מאמר שיטה

תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

3.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65222

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

במאמר זה

סיכום

מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.

תקציר

תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.

מבוא

תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח1. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs 2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות 4,5.

בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של הרשתית6. הסמנים הנפוצים ביותר המשמשים לכימות RGC בכל הרשתית כוללים Brn3a, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), וכן הלאה 7,8. אפיון הכמות והפיזור של RGCs דורש אימונוסטיין רשתית באיכות גבוהה. בדרך כלל, בפרוטוקולים של אימונוסטינינג, הרשתית שקועה בקיבועים כימיים לפני שהיא מודגרת בנוגדנים. קיבועים אידיאליים לא צריכים לשנות את צורת התאים, את הנגישות או הזיקה של האפיטופים לנוגדנים, או את הממדים הליניאריים של הרקמה 9,10.

בשל המבנה המורכב של הרשתית, בעיות כגון שבריריות רשתית וקיפול, כמו גם כמה קשיים נפוצים כולל התכווצות תאים וגרעינים לא ברורים, נוטים להתרחש בעת ביצוע תיקון רשתית שלם, אשר יש השפעה שלילית על מחקר ניסיוני. בנוסף, לא כל הרשתיות עוברות חיסון מיידי, במיוחד כשמדובר ברשתיות של עכברים טרנסגניים עם מחירים יקרים שמקורם יקר, מה שמחייב שימור דגימות הרשתית הנוספות לשימוש נוסף.

הפתרון המקבע המתאים יכול לתקן את הרקמה במהירות, להימנע מאוטוליזה של רקמות, לשמר את המורפולוגיה והמבנה הרגילים של תאי הרקמה, ולשמור על האנטיגניות של חלבונים וחומרים אחרים10. נכון לעכשיו, קיבוע מבוסס פורמלדהיד נמצא בשימוש נרחב ברקמות שונות, כולל רשתיות מופרדות, משקפיים hemisected, וגלגלי עיניים שלמים10. התכווצות רקמות ושינוי מורפולוגי של תאים הם שני האתגרים הקריטיים שנתקלים בהם בעקבות טבילה בפורמלדהיד11. בנוסף, ניסוחי קיבוע מותאמים צצים יותר ויותר כדי למקסם את השמירה על המאפיינים המקוריים של הרשתית ותאי היעד 9,10. טיפולים שונים בקיבוע רשתית עשויים להשפיע על מבנה הרשתית, אימונוגניות חלבון, עירור פלואורסצנטי , ומחזור מרווה הנחתה באופן שונה12,13. הרשתיות המקובעות בתמיסה של דוידסון שלמות יותר מבחינה מורפולוגית בהשוואה לאלה המקובעות בפורמלין, אך התמיסה של דוידסון פחות תואמת לנוגדנים מסוימים, כגון מולקולת מתאם קשירת סידן 112 של סמן מיקרוגליה. בהתחשב באופי השברירי של הרשתית, החוקרים יתהו באופן טבעי אם שלמות הרשתית, כמו גם התכונות והמורפולוגיה של תאי המטרה, ישתנו לאחר אחסון לטווח ארוך. עם זאת, ההשפעות האפשריות של תמיסת קיבוע על המורפולוגיה של תאי הרשתית וה-RGC לאחר אחסון במשך מספר חודשים דווחו רק לעתים רחוקות. אופטימיזציה של קיבוע הרשתית היא קריטית להערכה ושימור של RGCs.

אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה אמינה ופשוטה מבחינה טכנית בה אנו משתמשים לצביעת רשתית מורין בהרכבה שלמה. השיטה שלנו שמה דגש על הכנה ואחסון נכונים של רשתיות לחקירת RGC, תוך התחשבות בצורך באחסון לטווח ארוך של רקמת הרשתית וכן היבטים ספציפיים של היווצרות פלואורופור או התפרקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. כל עכברי C57BL/6J שנעשה בהם שימוש התקבלו ממרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת ווהאן, וכל הניסויים הקשורים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת ווהאן. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של העכברים.

1. חינוך וקיבוע העיניים

  1. הרדימו את העכברים בחנק פחמן דו חמצני, והפעילו את גלגל העין בעדינות באמצעות פינצטה חסרת שיניים.
  2. יש לשטוף את גלגל העין פעם אחת במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
  3. נקבו את גלגל העין עם מחט מזרק בקרנית תחת מיקרוסקופ (עינית WF: 10x/22; יעד הגדלה רציפה: 0.67x-4.5x) כדי להאיץ את הקיבוע לתוך גלגל העין ולשפר את יעילות הקיבוע.
  4. מעבירים לצלחת בת 24 בארות המכילה 4% פרפורמלדהיד (PFA).
  5. תקן את גלגל העין ב 4% PFA במשך 45 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו 1x PBS כדי להסיר PFA עודף (לשטוף שלוש פעמים, 5 דקות / זמן) מיד.

2. בידוד רשתית והשטחה

  1. מעבירים את גלגל העין למגלשת זכוכית, ומניחים אותו תחת מיקרוסקופ מנתח (עינית WF: 10x/22; יעד הגדלה רציפה: 0.67x-4.5x).
  2. החזיקו את המלקחיים ביד אחת, והשתמשו בה כדי להדק את שולי הקרנית כדי למנוע תנועת גלגל העין. השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את המספריים המנתחים ולחתוך סביב הקרנית בעומק של כ 1 מ"מ דרך הלימבוס corneoscleral. הסר את העדשה ואת גוף הזגוגית.
  3. החזיקו את הדיסק האופטי במרכז, ובעזרת מספריים חותכים את הרשתית רדיאלית לאורך ארבעת הרבעים, ומגיעים לכ-2/3 מרדיוס הרשתית.
  4. הדקו את אחד הקצוות הסקלרליים באמצעות מלקחיים עם שיניים. עם היד השנייה, החזיקו את קצה לובן העין עם מלקחיים ללא שיניים, ועברו מהמקום שבו לובן העין מקובע על ידי המלקחיים בעלי השיניים לכיוון בסיס הסקלרה. מקלפים בזהירות את הרשתית.
  5. משוך PBS באמצעות פיפטה (200 μL) כדי לשטוף ולהרטיב את הרשתית, ולאחר מכן להסיר את כל PBS עודף עם פיסת נייר סופג קטנה. במידת הצורך, שטחו בעדינות את הרשתית בעזרת מברשת זיפים קטנה.
  6. לאט לאט פיפטה מתנול קר (מקורר מראש במקפיא -20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפה על פני השטח הפנימיים של הרשתית (נפח מתנול אינו קבוע, כל עוד הרשתית יכולה להיות מכוסה לחלוטין על ידי מתנול). הרשתית הופכת לבנה ומפתחת עקשנות מוגברת.
  7. שטחו בעדינות את הרשתית, והסירו זיהומים כגון שאריות פיגמנט וגוף הזגוגית בעזרת מברשות זיפים קטנות. הפוך את הרשתית באמצעות מברשות זיפים קטנות, וחזור על התהליך הנ"ל.
  8. מעבירים את הרשתית המטופלת במתנול לבאר של צלחת בת 24 בארות, ושומרים אותה ספוגה במתנול.
  9. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C למשך 1-2 שעות לניקוי מיידי של מערכת החיסון, או השאירו את הרשתית במתנול, ואחסנו אותה בטמפרטורה של 20°C לאחסון לטווח ארוך.
  10. הסר את המתנול מהצלחת בת 24 הבארות, ושטוף את הרשתית עם PBS 1x.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית של RGCs

  1. מעבירים בזהירות את הרשתית לצלחת המגלוטיציה של 24 בארות עם פיפטת פסטר מפלסטיק, וחוסמים פנימה 5% PBS-TX-BSA (5 גרם אבקת אלבומין בסרום בקר מומסת ב-100 מ"ל של תמיסת PBST אחת; PBST נוצר על ידי הוספת 10 מ"ל של טריטון X-100 עד 2,000 מ"ל של 1 x PBS) בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. שמור על צד הגנגליון למעלה.
  2. הסר את PBS-TX-BSA, ודגר על הרשתית ב 4 ° C במשך 48-96 שעות, הוספת 100 μL של הנוגדן הראשוני שנבחר (נוגדן שרקן נגד RBPMS) באמצעות דילול 1:400.
  3. הסר את הנוגדן הראשוני, ושטוף את הרשתית שלוש פעמים (20 דקות כל אחת) עם PBS 1x, רועד בטמפרטורת החדר.
  4. לדגור על הרשתית עם רעד עדין במשך הלילה ב 4 ° C עם 100 μL של הנוגדן המשני המתאים (ראה טבלה של חומרים), ציאנין Cy3 affiniטהור חמור אנטי חזיר גינאה IgG (H+L), באמצעות דילול 1:400.
  5. שטפו את הרשתית עם PBS אחד שלוש פעמים (20 דקות כל אחת).
  6. הניחו את הרשתית שטוחה על המגלשה כששכבת תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה, שחררו כמות מתאימה של חומר מרווה אנטי-פלואורסצנטי סביב הרשתית עם פיפטה, וכסו את המגלשה בכיסוי (היזהרו שלא יהיו בועות).
    הערה: כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מרווה אנטי פלואורסצנטית, ודא שהוא מכסה את הרשתית כולה. לאחר מכן, כסו את המגלשה מבלי לאפשר לרשתית לצוף ולנוע בקלות.
  7. אטמו את המגלשה מסביב עם חומר איטום כדי למנוע ממנה לזוז. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C, והגנו עליהן מפני אור.
  8. דמיינו את הרשתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי/קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר נתיחה, הרשתית צריכה להיראות כמו תלתן שטוח בעל ארבעה עלים. במחקר זה, על-ידי שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, הרשתית הפכה לבנה לאחר הוספת מתנול (איור 1). בינתיים, הרשתית השתנתה מרכה לגמישה ושטוחה. לאחר מכן, RGCs היו מסומנים עם anti-RBPMS8. ארבעה שדות תמונה צולמו ברשתית כולה (n = 3) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (עינית: 10x; מטרה: 40x). תצוגות מייצגות של RGCs של רשתית לפני עיבוד מתנול ולאחר 12 חודשים של שימור ארוך טווח במתנול, מודגמות באיור 2. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהיד לבדו לא תמיד עובד טוב כקיבוע הכימי האופטימלי עבור חקירות מסוימות10,14. לסוגים שונים של קיבועים יש יכולות שונות לזרז חומצות אמינו ונוקלאוטידים, לייצב חלבונים ולשמור על מורפולוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מודעים להשתייכות, חברות, מימון או אחזקות פיננסיות שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי פרויקט פתיחת מעבדות מפתח חוביי (מענק מס '2021KFY055), הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מענק מס '2020CFB240), וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות (מענק מס '2042020kf0065).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אשכול תרבית תאים 24 בארותCostarקיבוע גלגל העין
24 בארות צלחת המגלוטינציהLabedit חברהדגירה נוגדן
הדבקה שקופיות מיקרוסקופCitotestאו דומה
תושבת מרווה אנטי פלואורסצנטיתServicebioG1401להאט את הקרינה מרווה
BSA (אלבומין סרום בקר)ServicebioGC305010חסימת מגיב
מיקרוסקופ קונפוקליOLYMPUSהחל עדשת אובייקטיבית 40x
מספריים מעוקלותג'יאנגסו Kanghua ציוד רפואי ושות', בע"מכלי ניתוח
מיקרוסקופניתוח RWD מדעי החיים ושות', בע"מ 77001Sכלי ניתוח
מלקחייםג'יאנגסו Kanghua ציוד רפואי ושות', בע"מכלי ניתוח
מתנולסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ20210624GC≥ 99.5%
לקSecheViteחומר איטום
מחטים שנחאי Kind Enterprises פיתוח קבוצה ושות', בע"מלהאיץ את הקיבוע
תמיסת פרפורמלדהידServicebioG1101קיבוע גלגל העין
PBS (pH מי מלח חוצץ פוספט 7.4)ServicebioG0002שטוף את גלגל העין 
נוגדן ראשוני: חלבון אנטי-קושר RNA של שרקנים עם שחבור מרובה (RBPMS)PhosphoSolutionsCat. #1832-RBPMSלאימונופלואורסצנטיות. בשימוש בשעה 1:400
נוגדן משני: Cy3 affiniPure donkey anti-piginea pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148לאימונופלואורסצנטיות. בשימוש ב 1:400
מספריים ישריםג'יאנגסו Kanghua ציוד רפואי ושות', בע"מכלי ניתוח

מקורות

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
  3. Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).
  4. Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
  5. Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
  6. Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).
  7. Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  8. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  9. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  10. Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
  11. Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
  12. Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
  13. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  14. Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
  15. Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59(2012).
  16. Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).
  17. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
  18. Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
  19. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
  20. Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
  21. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  22. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים