Method Article

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

DOI:

10.3791/65264

⸱

August 4th, 2023

 ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of California, Davis, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) מעכברים הם כלי מפתח לחקר הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים ברקמות. כתאים ראשוניים, הם מדגימים את הפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo באופן הדוק יותר מאשר שורות תאי מקרופאגים אימורטליים, וניתן לגזור אותם מעכברים שכבר נושאים שינויים גנטיים מוגדרים. עם זאת, שיבוש תפקוד הגנים ב- BMDM נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לעריכת גנום CRISPR/Cas9 יעילה ב- BMDM, המאפשר החדרה של החדרות ומחיקות קטנות (indels) הגורמות למוטציות frameshift המשבשות את תפקוד הגנים. הפרוטוקול מתאר כיצד לסנתז RNA מדריך יחיד (sgRNA-Cas9) וליצור קומפלקסים מטוהרים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) שניתן להעביר באמצעות אלקטרופורציה. הוא גם מספק שיטה יעילה לניטור יעילות העריכה באמצעות ריצוף Sanger שגרתי ותוכנית ניתוח מקוונת זמינה באופן חופשי. הפרוטוקול יכול להתבצע בתוך שבוע ואינו דורש בניית פלסמיד; התוצאה היא בדרך כלל יעילות עריכה של 85% עד 95%.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקידים קריטיים בתיקון רקמות ובמערכת החיסון 1,2. לקווי תאי מקרופאגים אימורטליים, כגון תאי עכבר RAW 264.7 או תאי THP-1 אנושיים, יש מספר מאפיינים מועילים, כולל צמיחה חזקה וקלות של שיבוש גנים על ידי העברת וקטורים להפרעות RNA או CRISPR/Cas9 3,4. עם זאת, טרנספורמציה אונקוגנית משנה באופן דרמטי את הפיזיולוגיה שלהם, מה שמביא להפעלה חריגה של מסלולים מסוימים ותגובות מושתקות של אחרים 5,6. מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMDMs) דומים יותר לפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo, אך עדיין מאתגרים למניפולציה גנטית בשל היעילות הנמוכה הן של טרנספקציית פלסמיד והן של התמרה נגיפית בתאי חיסון ראשוניים אלה 7,8. לפיכך, יש צורך בשיטות יעילות יותר לשיבוש תפקוד הגנים.

עריכת גנום CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה למניפולציה גנטית במגוון מערכות ביולוגיות, כולל תאי יונקים 9,10,11,12. חלבון Streptococcus pyogenes Cas9 קוטע ביעילות ובאופן ספציפי DNA דו-גדילי כאשר הוא מורכב עם RNA מנחה ספציפי לרצף. תיקון DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) של הדנ"א השסוע גורם להחדרות או מחיקות קטנות (indels) היוצרות מוטציות frameshift. במחקרים מוקדמים, Cas9 ו-sgRNA הועברו באמצעות וקטורים פלסמידים או לנטי-ויראליים, שהם שיטות העברה יעילות עבור קווי תאים רבים 9,10. עם זאת, תאים ראשוניים, ובמיוחד תאים חיסוניים ראשוניים, הם לעתים קרובות עקשנים לשיטות אלה בשל היעילות הנמוכה של העברת וקטורים על ידי טרנספקציה או טרנסדוקציה. לאחר מכן, פותחו שיטות ליצירת קומפלקסים sgRNA-Cas9 במבחנה ולהעברתם באמצעות אלקטרופורציה, ושיטות אלה השיגו יעילות גבוהה במגוון סוגי תאים13,14. התוצאות הצביעו על האפשרות להשתמש בגישה זו לביצוע עריכת גנום במקרופאגים ראשוניים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בקומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) לביצוע עריכת גנום ב- BMDM ראשוניים. הוא מכיל צעדים להפחתת ההפעלה של חיישני החיסון הנמצאים בתאי חיסון ראשוניים ומביא לעריכה של עד 95% באתרים ממוקדים עם רעילות מינימלית. פרוטוקול זה כולל גם זרימות עבודה להערכת יעילות העריכה באמצעות תגובת שרשרת שגרתית של פולימראז (PCR) וריצוף Sanger, ולאחר מכן ניתוח סיליקו על ידי Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, כלי תוכנה מקוון מאומת היטב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון sgRNA

הערה: שלב זה מתאר בחירה של רצפי היעד ועיצוב של sgRNAs. כדאי לתכנן מדריכים שנמצאים באקסון הקידוד הגדול הראשון, כך שכל חלבון מתורגם משתבש בשלב מוקדם במסגרת הקריאה הפתוחה. כדאי גם לבחור רצפי יעד שנמצאים באותו אקסון, מכיוון שזה ייעל את ניתוח יעילות העריכה (שלב 6). הדוגמאות לעריכת גנום שסופקו עם פרוטוקול זה השתמשו ב- sgRNA המכוון לאקסון הראשון של הגן Src ולגן Cblb , כמו גם במיקום Rosa26 שאינו מקודד של גנום העכבר.

  1. זהה 20 רצפים גנומיים של נוקלאוטידים למטרה, באמצעות אחד מכמה כלי עיצוב מקוונים חינמיים (טבלה 1). בחר ארבעה עד חמישה מדריכים שאינם חופפים בתוך כל גן, מכיוון שפעילות Cas9 משתנה בהתאם למדריך הספציפי שנבחר, וחיזוי מראש של מדריך פעיל מאוד אינו אפשרי.
    הערה: חשוב לוודא את הכיוון הנכון של המדריך ביחס לרצף הלוקוס הממוקד. כלי תכנון מספקים בדרך כלל את הרצף המנחה בכיוון 5' עד 3 אינץ', ללא קשר לגדיל הכרומוזומלי הממוקד. כדי לוודא את כיוון הגדיל, בדוק שקיים רצף מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) עבור S. pyogenes Cas9 (nGG) מיד 3' של הרצף הגנומי הממוקד. רצף sgRNA אינו כולל את PAM.

2. סינתזת sgRNA

הערה: שלב זה מתאר כיצד לסנתז sgRNA באמצעות PCR כדי ליצור תבנית עבור שעתוק חוץ גופי (IVT), ולאחר מכן לטהר את sgRNA באמצעות עמודות ספין (איור 1A). sgRNA סינתטי מותאם אישית זמין באופן מסחרי דרך מספר ספקים כחלופה ל- PCR/IVT.

  1. בצע PCR כדי ליצור תבנית IVT עבור T7 RNA פולימראז. תגובת PCR משתמשת בפריימרים אוניברסליים המכילים מקדם RNA פולימראז T7 ורצף CRISPR RNA (tracrRNA) מפעיל טרנס (טבלה 2), בנוסף לפריימרים בודדים קצרים עם רצף מדריך ספציפי לגן.
    1. זהו שלב הרחבת החפיפה שאינו הגברה. דלל את מאגר ה- PCR ל- 1x והוסף 1 mM MgCl2 נוסף. לאחר מכן, הוסף 0.25 μL של DNA פולימראז באיכות גבוהה, 0.5 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 0.02 mM פריימר ספציפי למדריך ופריימר אוניברסלי ארוך הפוך 0.02 mM T7 (טבלה 2) לנפח כולל של 46 μL. לאחר מכן, הניחו את הצינור בתרמוסייקלר והפעילו שני מחזורים של: 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. מצננים את התגובות על קרח.
    2. זהו שלב הגברת ה-PCR. לכל תגובה, הוסף 2 μL של פריימר הגברה קדמית של 25 mM ו- 2 μL של פריימר הגברה הפוכה של 25 mM. נפח התגובה הסופי הוא 50 μL. Denature עבור 30 s ב 95 ° C. לאחר מכן, הפעל 35 מחזורים של: 95 ° C עבור 15 שניות, 65 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות. בצע הארכה נוספת ב-72°C למשך 2 דקות.
    3. בדוק את המוצר תגובת PCR על ג'ל אגרוז 2%. PCR חופף-מאריך יוצר מולקולת dsDNA של 127 bp עם מקדם T7 במעלה הזרם של מדריך הנוקלאוטידים 20 הספציפי לגן וה-tracrRNA מיד במורד הזרם (איור 1B).
  2. טיהור תבנית IVT: ישנם פרוטוקולים וערכות רבים שעובדים היטב עבור זה. פרוטוקול זה משתמש בחרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI). מערבבים 50 μL של מוצר PCR עם 90 μL של חרוזים ופעל לפי הוראות היצרן. יש לחדד את הדנ"א על ידי הוספת 40 μL של חיץ (5 mM Tris, 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]) ולחמם ב-65°C למשך 5 דקות.
  3. למדוד את ריכוז הדנ"א של תבנית IVT באמצעות בליעה באורך גל של 260 ננומטר. ריכוז DNA של לפחות 50 ng/μL נדרש עבור IVT. ניתן לאחסן את תבנית IVT ב -20 °C.
  4. תגובת IVT
    1. השתמש בערכה מסחרית שנועדה להפיק תפוקות גבוהות של IVT (ראה טבלת חומרים). עקוב אחר המלצות היצרן לביצוע תגובת IVT. שימוש בתבנית IVT של 250 ננוגרם בתגובה של 20 μL, דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 4-16 שעות.
    2. בדוק את מוצר sgRNA IVT על ידי הפעלת 1 μL של התגובה על ג'ל אגרוז 2%. יש לצפות ברצועת רנ"א בהירה, הפועלת בדומה ל-dsDNA של 70 bp (איור 1C). למרות שהדבר אינו חובה, כדי להשיג רצועות חדות ופתורות יותר, השתמשו במאגר דגימת RNA עם אוריאה, ונטרלו את הדגימה בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות לפני הטעינה.
      הערה: ניתן לראות פסים קלושים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר והבדלי נדידה קלים עם כמה רנ"א מנחה עקב הבדלים במבנה המשני של הרנ"א.
  5. Dephosphorylate מוצר sgRNA IVT כדי למזער את ההפעלה של RIG-I (חיישן RNA זר) ואת המוות התא לאחר מכן לאחר אלקטרופורציה. עבור כל תגובת IVT של 20 μL, הוסף 69 μL של מים ברמה מולקולרית ו- 15 U של פוספטאז מעיים של עגל (CIP) במאגר CIP אחד. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
  6. יש להשפיל את תבנית ה-IVT כדי למזער את ההפעלה של חיישני דנ"א תאי, הגורמים למוות תאי בעקבות התחשמלות. לכל תגובת IVT, הוסף 2 U של DNase ללא RNase. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. מוצר IVT ניתן לאחסן ב -20 ° C ליום אחד או -80 ° C במשך מספר חודשים.
  7. לטהר את מוצר IVT באמצעות עמודות ספין. עבור שלב זה, ערכות טיהור חרוזים SPRI נחותות.
    1. קשרו את הרנ"א לעמודה על ידי הוספת 220 מיקרוליטר של חיץ קשירה למוצר IVT, ואחריו 1 מ"ל של אתנול 100% ברמה ביולוגית מולקולרית. מערבבים היטב וטוענים את העמודה. לאחר מכן, בצע את הוראות היצרן. בצע את השטיפה הסופית בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית כדי למנוע זיהום של sgRNA.
    2. בצע את elution במכסה המנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. יש להקפיד על הרנ"א באמצעות 30 μL של חיץ טריס סטרילי של 10 mM (pH 8.0).
  8. למדוד את ריכוז sgRNA על ידי מדידת הבליעה באורך גל של 260 ננומטר.
    הערה: תפוקות sgRNA טיפוסיות הן לפחות 100 מיקרוגרם.
  9. אחסנו את ה-sgRNA בטמפרטורה של -80°C. בצע aliquots כדי למנוע יותר משלושה מחזורי הקפאה-הפשרה.

3. הכנה לאלקטרופורציה

הערה: יש לבצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. פרוטוקול זה משתמש במערכת אלקטרופורציה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) עם קצוות של 10 μL.

  1. הפשירו את ה-BMDMs 48-72 שעות לפני השימוש והרחיבו אותם על צלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות (TC).
    הערה: לכל תגובה, 4 x 105 תאים נדרשים.
  2. לעקר צינורות PCR להרכבת תגובה. הכינו צינור PCR אחד לכל תגובה, וחממו אותם בתרמוסייקר למשך 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס. הכינו את הצינורות בקבוצות ואחסנו אותם סגורים. הניחו את צינורות ה-PCR המעוקרים על קרח כשהם מוכנים לשימוש.
  3. נקו את תחנת פיפטה עם 70% אתנול והניחו אותה במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. הגדר את הפרמטרים ל- 1,900 V, 20 אלפיות השנייה ופעימה אחת.
  4. הסר צינור transfection מן החבילה בזהירות לשמור אותו סטרילי ולמלא אותו עם 3 מ"ל של "E" חיץ. ודא שמאגר E נמצא בטמפרטורת החדר לפני ההתחשמלות. הכנס את הצינור לתחנה ודחוף אותו למטה עד שהוא לוחץ.
  5. עבור כל תגובה, aliquot 2.5 μL של sgRNA בריכוז של 1,100 ng/μL. לדלל את sgRNA במי מלח חוצצים פוספט קר (PBS) עם 0.9 mM CaCl2 ו 0.5 mM MgCl2 (PBS + Ca / Mg). השאירו אותו על קרח.
  6. הכינו שתי צלחות: צלחת לא מצופה 12 בארות לתאים וצלחת נוספת בת 24 בארות לאחיזת מצע התרבית. Aliquot 1.5 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה לכל תגובה לתוך הבארות של צלחת 24 בארות.
  7. הכינו חלבון Cas9. ישנם מספר ספקים מסחריים ואקדמיים של חלבון Cas9 מטוהר סטרילי. לדלל Cas9 לריכוז סופי של 20 מיקרומטר עם PBS קר + Ca / Mg. עבור כל תגובת אלקטרופורציה, aliquot 1 μL של 20 μM Cas9 לתוך צינורות PCR סטריליים. השאירו על קרח.
  8. הכינו תאים להתחשמלות.
    1. הסר את מדיום הגידול. שטפו את התאים באמצעות PBS ללא CaCl2 ו-MgCl2 (PBS-Ca/Mg) כדי להסיר את הסרום ואת הקטיונים הדו-ערכיים המקדמים הידבקות. לאחר מכן, להוסיף PBS + 1 mM EDTA ולדגור בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד התאים מתחילים להתנתק.
    2. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל דל חלבון. גלולה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות.
      הערה: מקרופאגים נצמדים לכלי פלסטיק. השימוש בצינורות צנטריפוגות דלות חלבון משפר באופן משמעותי את תפוקת התא.
    3. עבוד במהירות כדי למנוע דגירה ממושכת של תאים ב- PBS + EDTA. הסר את רוב supernatant, משאיר כ 1 מ"ל של supernatant בצינור. משעים מחדש את התאים בסופרנטנט הנותר, ולאחר מכן מעבירים לצינור מיקרופוגה דל חלבון בנפח 1.5 מ"ל.
    4. הסר aliquot קטן של תאים כדי לספור. משחררים את התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    5. במהלך הצנטריפוגה, ספרו את התאים וחממו את צינורות Cas9 ו-sgRNA לטמפרטורת החדר.
    6. מוציאים את כל הסופרנאטנט מכדורית התא. להשהות מחדש את התאים PBS + Ca / Mg בריכוז של 4 x 107 תאים / מ"ל (4 x 105 תאים לכל 10 μL תגובה).
      הערה: כל ערכה מסופקת עם כמות מוגבלת של מאגר אלקטרופורציה (Buffer R, Buffer T). עם זאת, אנו מוצאים כי יעילות אלקטרופורציה באמצעות PBS + Ca / Mg שווה ערך למאגרים הקנייניים.
    7. בעת אלקטרופורציה של sgRNA עבור גנים שונים, יש לחבר את התאים לצינורות שונים בעלי קישור חלבון נמוך עבור כל גן כדי למנוע זיהום צולב בין sgRNAs. שמרו את התאים בטמפרטורת החדר עד שיהיו מוכנים להתחשמלות.

4. הרכבת RNP

  1. שמור את sgRNA ו Cas9 בטמפרטורת החדר על מנת למנוע משקעים. הוסף 2.5 μL של sgRNA ל 1 μL של Cas9 מדולל בצינורות PCR מעוקרים. יש לפזר את ה-sgRNA באיטיות מעל 15 שניות עם ערבוב כדי למנוע משקעים.
  2. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות קומפלקס RNP.

5. משלוח RNP על ידי אלקטרופורציה

  1. הכינו את קצה האלקטרופורציה (קובטה). לחץ על הבוכנה כדי להאריך את הגבעול. הכניסו את הגבעול לקצה.
    הערה: ודא שהקצה מאובטח ושהבוכנה מחליקה בצורה חלקה ונמשכת מעבר לנדן הקצה. אם הקצה אינו ממוקם כראוי, בועות אוויר עלולות להיות מוחדרות לקצה, מה שגורם לכשל בקצה.
  2. השהה מחדש את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאחר מכן טען את קצה האלקטרופורציה עם התאים. משכו את מלוא קיבולת הנפח של 10 μL של הקצה, והימנעו מבועות.
  3. החל מבקרת sgRNA שלילית, העבר 10 μL של תאים בקצה האלקטרופורציה לצינור הדגימה המכיל 3.5 μL של RNP משלב 4. פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב היטב. משכו 10 μL מהתערובת בחזרה לקצה, כדי לוודא שאין בועות.
  4. הכניסו את הקצה לתחנת האלקטרופורציה, והורידו אותו לתוך החיץ. הימנע ממגע עם משטחי פלסטיק עם קצה כדי לשמור על סטריליות. לחץ על Start (התחל ) בתצוגת מסך המגע.
  5. לאחר השלמתה, התצוגה תציין דופק מוצלח. הסר את פיפטה מהמכשיר ומניחים את התאים בבאר יבשה של צלחת 12 בארות מסומנת, לא מצופה.
  6. שטפו את הקצה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים ב-15 מ"ל של PBS + Ca/Mg. הניחו בצד את הפיפטה כשהקצה עדיין מחובר. ודאו שהקצה לא נוגע בשום דבר ונשאר סטרילי.
    הערה: בניסויים רבים, ניתן לעשות שימוש חוזר בקצה עבור דגימות מרובות, כגון לאחר דגימת sgRNA שלילי שלילי לא פעיל, או במהלך ההערכות הראשוניות של פעילות המדריך כאשר ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים לכל גן והקריאה היחידה היא יעילות העריכה. עם זאת, במהלך ניתוח פונקציונלי של תאים ערוכים, מומלץ טיפ חדש לכל גן, שכן כמויות קטנות של sgRNA או נשיאת תאים עלולות להשפיע על תוצאות הניסוי.
  7. מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (aliquoted בשלב 3.6) לתאים ולנער בעדינות את הצלחת כדי לערבב.
  8. חזור על שלבים 5.2-5.6 עבור שאר התגובות.
  9. מחזירים את התאים לאינקובטור.
  10. בדוק את הכדאיות של התאים 1-2 שעות לאחר אלקטרופורציה. התאים צריכים להיות >90% דבקים. אופציונלי: הוסף גנטמיצין (5 מיקרוגרם/מ"ל) לתאים 1-2 שעות לאחר האלקטרופורציה כדי לסייע במניעת זיהום אם זה לא יפריע לניסויים במורד הזרם.

6. הערכת יעילות העריכה

הערה: רוב העריכה מסתיימת לאחר 48 שעות.

  1. בדוק את monolayer התא 48 שעות לאחר electroporation. אם התאים הם מעל 50% confluent, ואז להמשיך הלאה. אם התאים <50% נפגשים, המתן 1-2 ימים נוספים. ניתוח הדנ"א הגנומי כדי לקבוע את יעילות העריכה דורש 1 x 105 תאים, בנוסף לתאים הדרושים לניסוי במורד הזרם.
  2. הכנת DNA גנומי (gDNA).
    1. לשטוף את התאים עם PBS (-Ca / Mg). הוסף 1 מ"ל של PBS + 1 mM EDTA. דוגרים בטמפרטורת החדר כ-5 דקות עד שהתאים מתחילים להתנתק מהצלחת.
    2. נתק את התאים על ידי pipetting. מעבירים לצינור מיקרופוגה דל חלבון.
    3. ספור את התאים והסר aliquot של 1 x 105 תאים. התאים הנותרים יכולים להיות מצופים מחדש לשימוש בניסויים נוספים. בדרך כלל, הניסויים נערכים 5 ימים לאחר אלקטרופורציה על מנת לאפשר ריקבון של החלבון.
    4. גלולה את התאים לניתוח gDNA במשך 15 שניות במהירות מקסימלית בצינור מיקרופוגה.
    5. להשהות את הגלולה ב 50 μL של חיץ ליזיס. מערבולת כדי לנתק את כל התאים הדבוקים לדפנות הצינור, ולחמם ב 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ליזה את התאים ולהשבית DNase אנדוגני.
    6. מניחים את הצינורות על קרח.
    7. הוסף 1 μL proteinase K (20 מ"ג / מ"ל). לדגור לפחות 1 שעה ב 37 °C (77 °F); ניתן להשאיר אותו למשך הלילה לנוחיותכם.
    8. מחממים ל-98°C למשך 10 דקות כדי להשבית את הפרוטאינאז K.
    9. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות במהירות מרבית. הסר את הסופרנטנט, המכיל את הדנ"א. תכשיר גס זה ללא טיהור נוסף עובד היטב עבור רוב תגובות ה- PCR.
  3. הערך את יעילות העריכה באמצעות רצף Sanger.
    1. עצבו פריימרים PCR 200-300 bp במעלה הזרם של רוב אתרי מדריך 5' ו 200-300 bp במורד הזרם של אתרי מדריך 3' ביותר. גודל האמפליקון הטיפוסי הוא ~ 500 bp. עצבו פריימר ריצוף מקונן במרחק של לפחות 125 bp מאתר המדריך הקרוב ביותר (איור 2A).
    2. בצע PCR באמצעות 2 μL של gDNA.
  4. הכינו את מוצר ה-PCR לריצוף. פרוטוקול זה משתמש בטיפול exonuclease I/shrimp alkaline phosphatase (ExoI/SAP). ערכות טיהור DNA מסחריות עובדות גם הן, אך דורשות זמן רב יותר.
    1. הכן 15 μL של מוצר PCR. הוסף 7.5 μL מים, 1 μL של 10x ExoI buffer, 10 U של ExoI ו-1 U של SAP כדי לפגוע ב-dNTPs ובפריימרים שמפריעים לריצוף Sanger.
    2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בטמפרטורה של 85°C למשך 20 דקות כדי להשבית את האנזימים.
  5. לבצע ריצוף Sanger במוצר PCR המטופל ב- Exo/SAP; השתמש בכמות ידועה של סמן גודל DNA כדי להעריך את גודל מוצר ה- PCR הקיים בדגימה. תגובות הרצף עשויות לדרוש אופטימיזציה, מכיוון שתוכנת TIDE זקוקה לכרומטוגרמות רצף באיכות גבוהה כדי להעריך במדויק את יעילות העריכה. כרומטוגרמת הרצף של הלוקוס הלא ערוך אמורה לספק פסגות ברורות עם רקע מינימלי (איור 2B, C).
  6. כדי להעריך את יעילות העריכה, השתמש ב- TIDE כדי לנתח את קבצי הכרומטוגרמה של ריצוף Sanger באמצעות gDNA הערוך ו- gDNA הבקרה הלא ערוך. (טבלה 1, איור 2). העלה את קבצי רצף Sanger והפעל את התוכנה עם הגדרות ברירת המחדל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תבנית IVT היא מוצר PCR של 127 bp (איור 1B). תוצר ה-IVT באורך מלא הוא רנ"א של 98 ננוגרם, אשר נודד באופן דומה למקטע דנ"א דו-גדילי של 70 bp (איור 1C).

לאחר אלקטרופורציה, התאים צריכים להיות >90% קיימא, עם ספירת תאים כוללת של >70% ממספר התא ההתחלתי. מאגר התאים המוטנטיים המתקבל צריך לכלול קבוצה מגוונת של אינדלים, החל ליד אתר המחשוף Cas9. ניתוח הגנים הממוקדים על-ידי ריצוף PCR ו-Sanger אמור להראות נוקלאוטידים מרובים בכל מיקום במורד הזרם...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עריכת גנום באמצעות קומפלקסים חשמליים של Cas9-sgRNA מאפשרת שיבוש יעיל של תפקוד הגנים ב-BMDM. יעילות העריכה משתנה בהתאם לרצף היעד ולגן היעד. בדרך כלל, ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים בדרך כלל כדי לזהות אחד פעיל מאוד. לאתרים מסוימים יעילות עריכה נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מבנה הכרומטין. במקרים אלה, ניתן לבצע מספר שינויים כדי להגביר את יעילות העריכה. העברה משותפת של שני sgRNA פעילים לאותו אקסון מביאה לשיפור העריכה עבור גנים מסוימים. עם זאת, כאשר שני מדריכים מודבקים זה לצד זה, ראינו כי TIDE עלול לאבד את הדיוק. לכן, ייתכן שיהיה צור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH 5R01AI144149. הדמויות הסכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3T3-MCSF קו תאיםמתנה מראסל ואנסלא ישים
Alt-R Cas9 משפר אלקטרופורציהIDT1075915
אמפור XP ריאגנט חרוזיםבקמן קולטרA63880
עגל עגל אלקליין פוספטאזNEBM0525S
DNaseNEB M0303S
DPBS + Ca / Mg (0.9 מ"מ CaCl2 ו-0.5mM MgCl2)Thermo Fisher14040-133
DPBS -Ca/MgThermo Fisher14190-144
ExoINEBM0293S
סרום עגל עוברי (FCS)קורנינג35-015-CV
הרקולאז DNA פולימראז וחוצץAgilent600677
HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA בעלת תפוקה גבוההNEBצינורות חרוטיים E2040S
LoBind 15 מ"לEppendorf30122216
צינורות LoBind Eppendorf 2 מ"לEppendorf22431102
NEBuffer r2.1NEBB6002S
מערכת טרנספיקציה ניאוןThermo FisherMPK5000, MPP100, MPS100
מערכת העברת ניאון 10 uL טיפיםתרמו פישרMPK1025 או MPK1096
PBS + 1mM EDTALonzaBE02017F
Proteinase KThermo FisherEO0491
rCutSmart Buffer עבור ExoINEBB6004S
RibolockThermo FisherEO0384
צבע טעינת RNANEBB0363S
RNeasy Mini KitQiagen74104
S. pyogenes Cas9-NLSמעבדת המאקרו של אוניברסיטת קליפורניהאינה ישימה זמיןלחוקרים שאינם UC באמצעות  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, שונה IDT מהדור השלישי1081059
SAPNEBM0371S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  2. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  3. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
  4. Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
  5. Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225(2017).
  6. Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957(2019).
  7. Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
  8. Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  10. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  11. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  12. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
  13. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  14. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).
  16. Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
  17. Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143(2019).
  18. Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene DisruptionBone Marrow MacrophagesCRISPR Cas9ElectroporationRibonucleoprotein ComplexSanger SequencingGenome EditingPrimary MacrophagessgRNA SynthesisPCR Analysis

Related Articles