ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Summary

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

Abstract

תורשה אפיגנטית בין-דורית (TEI) מאפשרת העברת מידע דרך קו הנבט מבלי לשנות את רצף הגנום, באמצעות גורמים כגון RNA לא מקודד ושינויים בכרומטין. תופעת תורשה של הפרעות RNA (RNAi) בנמטודה Caenorhabditis elegans היא מודל יעיל לחקר TEI המנצל את מחזור החיים הקצר של אורגניזם מודל זה, התפשטות עצמית ושקיפות. בתורשה של RNAi, חשיפה של בעלי חיים ל-RNAi מובילה להשתקת גנים ולשינויים בחתימות הכרומטין במיקום המטרה שנמשכים מספר דורות בהיעדר הטריגר הראשוני. פרוטוקול זה מתאר את ניתוח תורשה RNAi ב- C. elegans באמצעות כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק גרעיני (GFP) המבוטא על ידי נבט. השתקת הכתבים מתבצעת על ידי האכלת בעלי החיים בחיידקים המבטאים RNA דו-גדילי המכוון ל-GFP. בכל דור עוברים בעלי חיים כדי לשמור על התפתחות מסונכרנת, והשתקת גנים נקבעת במיקרוסקופיה. בדורות נבחרים, אוכלוסיות נאספות ומעובדות עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית של כרומטין (ChIP) (qPCR) כדי למדוד את העשרת שינוי ההיסטון במוקד כתב GFP. פרוטוקול זה לחקר תורשה RNAi ניתן לשינוי בקלות ומשולב עם ניתוחים אחרים כדי להמשיך לחקור גורמי TEI במסלולי RNA וכרומטין קטנים.

Introduction

תורשה אפיגנטית מאפשרת העברת מידע על בקרת גנים בין דורות ולכן יכולה לאפשר לסביבה או לחוויות של ההורים להשפיע על צאצאיהם. ב- C. elegans, השתקת גנים של קו הנבט המופעלת על ידי RNA דו-גדילי אקסוגני (dsRNA) יכולה לעבור בתורשה במשך דורות רבים בצאצאים שלא נחשפו לטריגר המקורי 1,2,3,4. תהליך זה, המכונה RNA interference (RNAi) inheritance, הוא אחת ממספר תופעות השתקה אפיגנטיות קשורות ב- C. elegans, כולל השתקה רב-דורית ביוזמת piRNA ^2,5, paramutation/RNAe (השתקה אפיגנטית הנגרמת על ידי RNA) 6,7,8, והשתקה ביוזמת מערך multicopy^9, שיש להם דרישות חופפות אך נפרדות למכונות ויסות RNA וכרומטין קטנות . ב-C. elegans exogenous RNAi, dsRNA מעובד ל-RNA מפריע קטן (siRNAs) הפועל בקומפלקס עם חלבוני ארגונאוט ראשוניים כדי לזהות את mRNA המטרה שלהם. מיקוד זה מוביל להגברה של siRNA משני המשויך לארגונאוטים משניים כדי להשתיק mRNA מטרה דרך מסלולי השתקה ציטופלזמיים וגרעיניים כאחד. עבור מטרות RNAi המבוטאות בתאי נבט, המשנה הגרעינית Argonaute HRDE-1 וגורמי RNAi גרעיניים נוספים מכוונים לתעתיקים מתהווים, וכתוצאה מכך דיכוי שעתוק וגיוס של מתילטרנספראזות היסטון להפקדת סימני כרומטין מדכאים, כולל H3K9me3¹⁰. Histone H3K9me3 מקדם הקמת השתקה תורשתית של טרנסגנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתבטא בנבט על ידי ירושת RNAi^11,12.

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטרנסגן המבטא חלבון היתוך GFP-היסטון בקו הנבט ככתב לתורשה RNAi ולהעריך שינויים בשינויים בהיסטון במוקד הטרנסגן של הכתב באמצעות משקעים חיסוניים של כרומטין ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (ChIP-qPCR). פרוטוקול זה מתאר גישת הזנת RNAi סטנדרטית מבוססת צלחת ליזום השתקת כתבים. הוא גם מספק ציר זמן מפורט להעברת בעלי חיים בין דורות על ידי בידוד עוברי רחם ממבוגרים גרבידיים על ידי טיפול בהיפוכלוריט אלקליין ('הלבנה'). כמו כן מתוארות שיטות ונתונים מייצגים לניטור תדירות השתקת GFP בתת-קבוצה של האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועבור היסטון H3K9me3 ChIP-qPCR. מבחני תורשה מבוססי כתב RNAi מספקים מערכת יעילה ביותר לנתח באופן פונקציונלי את תפקידם של גורמים גנטיים וסביבתיים בוויסות אפיגנטי 13,14, ובדיקות גנטיות באמצעות כתבים כאלה זיהו הן גנים הדרושים עבור ^2,3,15 והן גנים המווסתים באופן שלילי ^16,17 את משך התורשה האפיגנטית הבין-דורית.

Protocol

הערה: ציר זמן של בדיקה מוצג באיור 1.

1. הכנת לוחות RNAi nematode growth medium (RNAi-NGM)

1. הוציאו החוצה את E. coli HT115(DE3) המכיל GFP או וקטורי RNAi בקרה ממלאי גליצרול על לוחות אגר Luria-Bertani (LB) בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין. לדגור על החיידקים לילה ב 37 ° C.
2. למחרת, הכינו צלחות RNAi-NGM (אגר 1.7% [w/v], 0.3% [w/v] NaCl, 0.25% [w/v] פפטון, 1 mM CaCl₂, 5 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול, 25 mM אשלגן פוספט חיץ [pH 6.0], 1 mM MgSO₄, 25 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצלין, ו 5 mM איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG]) על פי פרוטוקול סטנדרטי¹⁸.
   1. עבור כל זן בניסוי, הכינו לפחות שש לוחיות RNAi-NGM שנזרעו עם GFP RNAi (שתי לוחיות לכל אחד משלושת העותקים הביולוגיים) ושתי לוחיות RNAi-NGM שנזרעו עם RNAi בקרה (שכפול ביולוגי אחד).
   2. אוהל רופף את הצלחות עם נייר כסף כדי להגן מפני אור ולהשאיר לילה בטמפרטורת החדר לייבוש.
3. באותו יום כמו צלחת RNAi-NGM לשפוך, להכין 4 מ"ל של תרביות נוזליות של חיידקי RNAi.
   1. בתנאים סטריליים, aliquot 4 מ"ל של מרק LB בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין לתוך צינורות תרבית. בחרו מושבות בודדות מצלחות האגר LB לכל צינור ודגרו במשך הלילה תוך כדי ניעור במשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 37°C.
4. זרעו חיידקי RNAi על לוחות RNAi-NGM.
   1. לאחר גדילת לילה, מדדו את הצפיפות האופטית (OD₆₀₀) של תרביות באמצעות דילול של 1:5 חיידקים עם ציר LB.
   2. לדלל את חיידקי ה-RNAi ל-OD_{יחסית של} 600 מתוך 2 באמצעות ציר LB בתוספת טטרציקלין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
   3. בתנאים סטריליים, יש להוסיף 150 μL של חיידקי ה-RNAi של הבקרה או ה-GFP לכל צלחת RNAi-NGM.
   4. אוהל את הצלחות עם נייר כסף ולאפשר לחיידקים לגדול לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      הערה: ניתן לאחסן לוחות RNAi-NGM שאינם בשימוש הפוכים למשך עד שבוע אחד ב-4°C במיכל אטום בחושך.

2. התחלת בדיקת תורשה RNAi: הלבנה וציפוי עוברים לדור P0

הערה: לפני תחילת בדיקת הירושה RNAi, תולעים המכילות את כתב GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]⁷ צריכות להישמר ללא רעב ב 21 ° C במשך שני דורות לפחות.

1. 4 ימים (96 שעות) לפני תחילת בדיקת התורשה של RNAi (איור 1), בחרו שלושה או ארבעה בוגרים גרבידים על כל צלחת NGM סטנדרטית בקוטר 35 מ"מ עם זרעי חיידקי OP50-1.
   הערה: שלוש צלחות NGM לכל זן מספיקות. עבור זנים עם פוריות נפגעת, ייתכן שיהיה צורך ביותר מארבעה בעלי חיים בכל צלחת.
2. לאחר 4 ימים, ודא כי האוכלוסייה הבוגרת החלה להטיל עוברים על הצלחת. שטפו את התולעים מהלוחות לתוך צינורות של 1.5 מ"ל באמצעות 800 μL של חיץ M9 בתוספת Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO 4, 86 mM NaCl, 1mMMgSO ₄, 0.01% (v/v) TX-100). יש לחזור על השטיפה והבריכה לאותו צינור.
3. בודדו את העוברים מהאוכלוסייה על ידי הלבנה באופן הבא.
   1. הכינו תמיסת הלבנה עם אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט) ו-10 N NaOH ביחס נפח של 1.5:1. הכינו כמות מספקת כך שניתן יהיה להשתמש ב-250 מיקרוליטר לכל דגימה.
   2. צנטריפוגה את צינורות 1.5 מ"ל עם התולעים ב 1,000 x גרם במשך 1.5-2 דקות.
   3. שאפו את הסופרנטנט, והשאירו 100 מיקרוליטר מבלי להפריע ל'כדור' התולעת. לחלופין, ניתן להשאיר את הצינורות למשך כ-2 דקות כדי לאפשר לתולעים לשקוע לפני השאיפה.
   4. הוסף 650 μL של ddH₂O לכל צינור כדי להשיג נפח סופי של 750 μL.
      הערה: השלבים הבאים הם תלויי זמן.
   5. הוסיפו 250 μL של תמיסת ההלבנה לכל צינור והפעילו טיימר.
   6. כל 1-2 דקות, מערבלים היטב את הצינורות. לאחר 5 דקות, לבדוק את התולעים מתחת סטריאוסקופ כדי לפקח על השפלה של מבוגרים.
   7. ממשיכים לערבל עד שהתולעים מומסות לחלוטין ונשארים רק עוברים. צנטריפוגו מיד את הצינורות במהירות של 1,000 x גרם למשך דקה וחצי.
      הערה: ההלבנה בדרך כלל מושלמת תוך 6-7 דקות, אך יש לעקוב אחריה תחת סטריאוסקופ בהגדלה מספקת כדי לצפות בעוברים המשוחררים (פי 40). אל תשאירו את התולעים באקונומיקה לתקופה ממושכת, מכיוון שהדבר יפגע בעוברים.
   8. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט והשאירו בערך 50-100 μL. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ M9 עם TX-100 כדי לשטוף ולערבב על ידי מערבולת. צנטריפוגה שוב ב 1,000 x גרם במשך 1.5-2 דקות ולשטוף לפחות עוד פעמיים.
   9. שאפו את הסופרנאטנט מהשטיפה הסופית והשאירו כ-100 מיקרוליטר בצינור. מערבבים על ידי מערבולת. פיפטה 2 μL מכל צינור פעמיים על שקופית זכוכית מסומנת. ספרו את העוברים באמצעות מונה ספירה כדי להעריך את ריכוז העוברים למיקרוליטר.
      הערה: ניתן להשתמש כאן בשקופיות עם בארות חלביות מרובות כדי לספור העתקים של זנים מרובים. ניתן לשטוף שקופיות ספירה ולעשות בהן שימוש חוזר.
4. כדי להתחיל גידול אוכלוסייה מסונכרן למחצה, ערבבו ופיפטה נפח המכיל 250 עוברים על כל צלחת RNAi-NGM. השתמש בשני לוחות עבור כל שכפול. הניחו לנוזל להיספג.
5. עבור דור P0 שטופל ב-RNAi, יש לדגור בטמפרטורה של 21°C למשך 4 ימים (96 שעות) (מהעוברים ועד לבגרות). הזמנים עשויים להשתנות בהתאם לגנוטיפ.

איור 1: סכמת בדיקת תורשה של RNAi. ציר זמן מוצע להכנת לוחות RNAi-NGM והגדרת בדיקת תורשה RNAi. בוגרים Gravid נקטפים ביום -4 על צלחות NGM שנזרעו עם OP50-1. לאחר 4 ימים, צאצאים בוגרים מולבנים והעוברים מצופים על לוחות RNAi-NGM. דור P0 נחשף ל-RNAi במשך 4 ימים בטמפרטורה של 21°C. ברגע שהתולעים מגיעות לבגרות, ההעתקים עוברים על ידי הלבנה ומקבלים ניקוד לביטוי GFP של קו הנבט בכל דור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מעבר וניקוד בכל דור עבור ביטוי GFP של קו הנבט

הערה: כדי להקל על הניקוד, השתמש בתקליט ויניל כדי ליצור רפידות אגרוז עם רכסים ליניאריים כדי ליישר את התולעים. שיטה זו אומצה על ידי ריברה גומז ושוורצשטיין¹⁹.

1. מכינים 1% (w/v) אגרוז על ידי המסת אגרוז ב-ddH₂O בבקבוק קטן על ידי חימום במיקרוגל. מוסיפים ערבוב ומכסים בנייר כסף. אם נמס מחדש, מחממים את האגרוז על פלטה בחום של 200 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. לאחר המסה, להפחית את החום ל 80 ° C.
2. שטפו את התולעים מלוחות ה-NGM באמצעות 800 מיקרוליטר של חיץ M9 עם TX-100 לתוך צינור של 1.5 מ"ל. לשטוף את הצלחות פעמיים כדי להסיר את כל המבוגרים gravid. בדוק את הצלחות מתחת לסטריאוסקופ כדי לוודא שבעלי החיים נאספו ביעילות.
3. צנטריפוגו את הצינורות במהירות של 1,000 x גרם למשך 1.5-2 דקות או אפשרו לתולעים להסתפק במשך 2 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשאירו 100 מיקרוליטר מבלי להפריע ל'כדור' התולעת.
4. הכינו רפידות אגרוז להרכבת התולעים כדלקמן.
   1. מניחים טיפה של 1% מומס (w/v) agarose על תקליט ויניל (שתואר קודם¹⁹) באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (עם קצה צר שבור).
   2. כוון שקופית זכוכית כך שהקווים ברשומה יהיו אופקיים או אנכיים והנח את השקופית במהירות על טיפת אגרוז. המתן כ- 30 שניות לפני הסרת שקופית הזכוכית מהרשומה.
      הערה: אם אתה מבקיע גנוטיפים מרובים, ייתכן שיהיה שימושי ליצור כרית אגרוז גדולה יותר בשקופית אחת ולחתוך אותה לשניים באמצעות להב.
5. הרכיבו את התולעים על כריות האגרוז.
   1. תחת הסטריאוסקופ, להוסיף כ 5 μL של 5 mM levamisole כרית agarose. דילול הלבמיסול צריך להיעשות טרי בכל שבוע.
   2. מעבירים בעדינות את צינורות התולעים כדי לערבב ולהעביר 5-10 מיקרוליטר תולעים על כרית האגרוז. העריכו את מספר התולעים בעין בעת הוספתן, כך שיהיו כ-40 תולעים בכל שכפול.
   3. סדרו את התולעים בשורות באמצעות פיק ריסים לניקוד קל יותר. הוסיפו כיסוי זכוכית.
      הערה: מגלשות עם בעלי חיים המותקנים בדרך זו יכולות להימשך מספר שעות לפני שהן מתייבשות.
6. בודדו את העוברים מבעלי החיים הנותרים באמצעות פרוטוקול הלבנה (ראו שלב 2.3) לפני הניקוד של השקפים. צלחת 250 עוברים על לוחות NGM 35 מ"מ שנזרעו עם OP50-1²⁰. לאחר שהנוזל נספג, הפכו את הצלחות והחזירו אותן לאינקובטור של 21 מעלות צלזיוס.
7. השתמש בסטריאוסקופ תפרחת עם ערכת מסננים GFP. ספור ורשום את מספר התולעים החיוביות של GFP ו- GFP שליליות בשקופיות עבור כל שכפול באמצעות מונה ספירה.
   הערה: לתולעים חיוביות של GFP יהיה ביטוי גרעיני של GFP בנבט שלהן ובעוברים ברחם. עם זאת, הנבט של תולעים שליליות של GFP לא יפלוט, עם זאת, כאשר ה-GFP יתחיל לפעול מחדש בדורות מאוחרים יותר, הפלואורסצנטיות עשויה להיות עמומה. זה עשוי להיות מועיל להרכיב זני תולעים נוספים שאינם מהונדסים כדי להסביר כל autofluorescence שנצפה.
8. מעבר האוכלוסייה על ידי הלבנה, כמתואר לעיל, בערך כל 4 ימים (96 שעות) ב 21 °C (75 °F). לחלופין, ניתן לבצע את המעבר על פי לוח זמנים לסירוגין של 3 ימים / 4 ימים לנוחותכם. צלחת תוספת ~ 50 עוברים עבור הדורות החולפים הקצרים יותר אם לסירוגין, שכן ייתכן שיש יבול נמוך יותר של עוברים לאחר 72 שעות.
   הערה: שמור על זמן מעבר עקבי של דור P0 לאחר 4 ימים לאחר ציפוי.

4. אוסף בעלי חיים עבור ChIP

הערה: מספר בעלי החיים והעיתוי תלויים בזן, בשלב ההתפתחותי, באפיטופ ובמספר מטרות המשקעים החיסוניים (IP). בדוגמה שלהלן, אספו בעלי חיים עבור שלושה כתובות IP: H3K9me3, היסטון H3 והדברת IgG. פרוטוקול ChIP הותאם מ-Askjaer et ^al.21.

1. לפני איסוף דגימות ChIP, הרחיבו את הדור הקודם של בדיקת התורשה של RNAi בשלוש לוחיות NGM נוספות (לארבע לוחיות לפחות לכל שכפול). לגדול במשך 4 ימים ב 21 °C (75 °F).
2. הלבינו את הבוגרים הגרבידיים כדי לבודד את העוברים (ראו שלב 2.3).
3. עבור כל זן, צלחת כ -3,500 עוברים על 14 צלחות (250 לכל צלחת) ולגדול במשך 3 ימים ב 21 ° C לשלב הבוגר הצעיר.
4. שטפו את בעלי החיים לתוך צינורות של 1.5 מ"ל עם מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). צנטריפוגה ברזולוציה של 1,000 x גרם למשך 2 דקות. יש לשאוף ולאגד את בעלי החיים מזן אחד לתוך צינור אחד ולשטוף שלוש פעמים נוספות עם לפחות 1 מ"ל של PBS/TX.
5. לשאוף ל-1,000 μL, להפוך כדי לערבב, ולספור את מספר בעלי החיים ב-3 μL שלוש פעמים (עיין בשלב 2.3.9).
6. מחשבים את ריכוז בעלי החיים ומעבירים נפח המתאים ל-3,000 בעלי חיים לצינור חדש להצלבת פורמלדהיד.
7. ודא שהנפח הכולל הוא לפחות פי 10 מנפח גלולת התולעת.

5. קרוסלינקינג פורמלדהיד

אזהרה: יש לעבוד עם פורמלדהיד במכסה אדים כדי למנוע חשיפה לאדים.

1. מוסיפים פורמלדהיד (ריכוז סופי של 1.8%) לצינור המכיל את התולעים. סובבו בטמפרטורת החדר במשך 6 דקות.
2. מיד להקפיא בחנקן נוזלי. ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה וניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
3. הפשירו את הדגימה הצולבת באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות וסובבו במשך 16 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף גליצין 1.25 M לריכוז סופי של 125 mM וסובב במשך 5 דקות.
   הערה: עד להדבקת חרוזים מגנטיים, יש לשמור את הדגימות על קרח או בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש במאגרים קרים כקרח.
5. צנטריפוגה את הדגימה ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS/TX בכל פעם. יש לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ השעיה (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 0.01% TX-100, מעכב פרוטאז [טבליה אחת לכל 5 מ"ל]).
6. לאחר השטיפה האחרונה, השאירו מספיק חיץ כדי להבטיח שהנפח הכולל יהיה לפחות פי שלושה מנפח הכדוריות ומינימום של ~100 מיקרוליטר.

6. סוניקציה

הערה: פרמטרי הסוניקציה תלויים בסוג ובדגם של הסוניקטור ובמת בעלי החיים. פרמטרים כגון נפח וריכוז הדגימה, מרווחי הפעלה/כיבוי, מספר מחזורים והגדרת צריכת חשמל צריכים להיות ממוטבים אמפירית. לדוגמה, במהלך זמן של סוניקציה, עקוב אחר ליזה תולעת באמצעות בדיקת חלבון וקבע מתי הריכוז מגיע לרמה. בנוסף, יש לעקוב מתי גודל הגזירה הממוצע של הדנ"א הגנומי הוא בערך 200-1,000 bp על ידי אלקטרופורזה של DNA, מטוהר לאחר היפוך crosslinking, על ג'ל agarose/tris-acetate-EDTA (TAE) 1.5%.

1. מדוד את נפח הדגימות מהשלב הקודם. מערבבים ומוסיפים 90-120 μL לצינור סוניקציה מפוליסטירן.
2. הוסף נפח שווה של חיץ מתלה המכיל 2x דטרגנטים (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.2% נתרן deoxycholate, 0.7% sarkosyl).
3. סוניק באמבט מים בעוצמה של 50% למשך 7 דקות (20 שניות מופעלות / 40 שניות כבויות) ב- 4 ° C. מערבבים בעדינות על ידי פיפט. חזור על הסוניקציה במשך 7 דקות נוספות.
4. מעבירים את הליזט הסוניק לצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 0.5 נפחים של חיץ מתלה ללא דטרגנטים (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA) (למשל, הוסף 100 μL של חיץ ל 200 μL של דגימה).
5. צנטריפוגה ב-13,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C. שומרים את הליזט סופרנאטנט ומעבירים לצינור חדש.
6. לחלופין, בצע בדיקת חלבון כדי לקבוע את הריכוזים של כל ליזט. שלב זה עשוי להיות שימושי עבור כמויות מדגם גדולות או השוואות בין מבחנים. עם זאת, סטנדרטיזציה של מספר בעלי החיים כפי שתואר לעיל עובדת היטב עבור כמויות הדגימה המתוארות כאן, שכן יש מתאם טוב יותר עם התשואה של כרומטין/DNA כפי שנקבע על ידי qPCR.

7. משקעים חיסוניים

הערה: שנה את כמות הנוגדנים והחרוזים המגנטיים לנפח ולריכוז של ליזט.

1. חלק את סופרנאטנט הליזט לארבעה חלקים: שלושה נפחים שווים לכל IP ו-10% מנפח IP אחד כקלט (למשל, 100 μL של IP #1, 100 μL של IP #2, 100 μL של IP #3, 10 μL של קלט). העבר את ליזה IP לצינור PCR של 200 μL ואחסן את ליזה הקלט ב -20 °C בצינור של 1.5 מ"ל.
2. הוסף 0.5 מיקרוגרם של נוגדן נגד H3K9me3, נוגדן H3 נגד היסטון או IgG לדגימת ה- IP המתאימה. יש לדגור ב-4°C (75 °F) למשך הלילה עם סיבוב.
3. למחרת, aliquot 9 μL של חלבון G מצופה חרוזים מגנטיים לכל IP לצינור יחיד 1.5 מ"ל. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0.1% נתרן deoxycholate).
4. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים במאגר FA-150 לנפח המקורי שנלקח מהמלאי בשלב 7.3 לעיל. הוסף 7.5 μL לכל כתובת IP. יש לדגור ב-4°C למשך שעתיים עם סיבוב.

8. שטיפות ו elution

הערה: כדי להבטיח שהחרוזים המגנטיים לא יתייבשו, הוסיפו במהירות כל חיץ כביסה או חיץ אלוציה לאחר השאיפה של הכביסה הקודמת.

1. השתמש 0.2-1 מ"ל של פתרונות החיץ הבאים בכל פעם כדי לשטוף את החרוזים. אספו את החרוזים על מעמד מגנטי כדי לשאוף את השטיפות. יש לדגור על כל כביסה בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות עם סיבוב. בצע את ההזמנה כמפורט להלן.
   1. יש לשטוף פעמיים עם FA-150.
   2. יש לשטוף פעם אחת עם FA-1M (FA-150 עם 1 M NaCl).
   3. יש לשטוף פעם אחת עם FA-0.5M (FA-150 עם 0.5 M NaCl). העברה לצינור PCR חדש.
   4. יש לשטוף פעם אחת עם TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% נתרן deoxycholate).
   5. שטוף פעמיים עם TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 0.005% IGEPAL CA-630).
      הערה: המשך עיבוד הדגימה בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
2. שאפו את חיץ הכביסה האחרון. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים עם 50 μL של חיץ אלוציית ChIP (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% נתרן דודציל סולפט [SDS]) והעבר לצינור 1.5 מ"ל.
3. יש לערבב ב-65°C למשך 15 דקות בתרמומיקסר עם ערבוב ב-1,000 סל"ד למשך 5 שניות בכל דקה.
4. אוספים את החרוזים על מעמד מגנטי ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש.
5. חזור על ה- elution עם עוד 50 μL של מאגר אלוציית ChIP. אגרו את הסופרנאטנטים בסכום כולל של 100 μL. המשיכו לקרוסלינקינג הפוך ופליטת DNA, כמפורט להלן.

9. הצלבה הפוכה ואלוציית DNA

1. הפשיר את דגימת הקלט ליזט. למעלה עד 100 μL עם מאגר Elution ChIP.
2. הוסף 16.5 מיקרוגרם של RNase A לכל דגימת IP וקלט. לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
3. מוסיפים 40 מיקרוגרם של פרוטאינאז K ודגורים ב-55°C למשך שעתיים. לאחר מכן, לדגור ב 65 °C (65 °F) במשך הלילה.
4. מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר ומטהרים את הדנ"א בעזרת ערכת עמוד ספין.

10. הגדרה והפעלה של תגובת qPCR

הערה: יש לשנות את הפרמטרים פריימר, הגדרת תגובה ותרמוסייקלר כך שיתאימו להמלצות היצרן לתמהיל תגובת qPCR הנמצא בשימוש.

1. הכינו ערכות פריימר המכוונות לכתב ה-RNAi של GFP ולאזורי בקרת העשרה חיובית ושלילית של H3K9me3. טמפרטורת ההתכה של הפריימר היא 60 מעלות צלזיוס. ראו טבלת חומרים לרצפי פריימר.
2. עבור דנ"א הקלט, בצע ארבעה דילולים סדרתיים פי ארבעה (לדוגמה, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
   הערה: ניתן להשתמש בדנ"א IP ישירות או לדלל אותו (לדוגמה, 1:2 או 1:3) כדי לאפשר תגובות נוספות. התאמת הדילול חייבת להיקבע אמפירית, שכן ביצועי qPCR עשויים להיות מושפעים.
3. ארגן את כל התגובות המתאימות לערכת פריימר אחת על צלחת PCR אחת. הגדר תגובות טכניות כפולות עבור כל דילול DNA קלט וכל דגימת DNA IP. כל תגובה של 10 μL מכילה 1.5 μL של קלט או IP DNA (או חיץ אלוציה כבקרה), תערובת מאסטר qPCR (ריכוז סופי של 1x), פריימר קדמי ופריימר הפוך (ריכוז סופי של 400 ננומטר עבור כל פריימר).
4. על thermocycler בזמן אמת, להפעיל את התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 °C למשך 4 דקות; הגברה וזיהוי פלואורסצנטי: 40 מחזורים של 95 ° C עבור 10 s ו 60 ° C עבור 30 s עם לוח לקרוא; הארכה סופית: 60°C למשך 5 דקות; עקומת התכה: מ-60°C עד 90°C במרווחים של 0.5°C, 5 שניות לכל צעד.

11. קביעת יעילות הגברה ואימות ספציפיות המוצר

1. עבור כל קבוצה של דילולי DNA קלט, התווה את ארבע נקודות הנתונים עם [log10(1/dilution)] על ציר x ו- [Input Cq] על ציר y. לקבוע את השיפוע של הקו של ההתאמה הטובה ביותר.
2. חשב את יעילות ההגברה. ערכות פריימר אידיאליות אמורות להציג באופן עקבי יעילות של 95%-100%.
   
3. בדקו שלכל התגובות יש שיא עקומת התכה חד אחד ושלתגובות עם אותה ערכת פריימר יש אותה טמפרטורת התכה. פסגות מרובות או טמפרטורות התכה שונות עשויות להצביע על הגברה לא ספציפית.
4. לחלופין, הפעל תגובות על ג'ל סטנדרטי של 2% agarose/TAE בטמפרטורת החדר כדי לוודא את גודל רצועת המוצר.

12. חישוב אחוז הקלט

1. חשב את גורם דילול הקלט. מכיוון ש-10% מנפח ה-IP ליזט נשמר כקלט, מקדם הדילול עבור דילול 1:5 של DNA קלט הוא 50.
2. קבע את גורם דילול ה- IP. אם ה- DNA IP אינו מדולל לפני qPCR, גורם הדילול הוא 1.
3. חשב את הפרש ה- Cq בין ה- IP לקלט המותאם לגורמי דילול.
   
4. חשב את אחוז הקלט.
   

Results

חיות שנשאו את כתב GFP-histone H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]⁷ (איור 2A) נחשפו ל-GFP RNAi או לרנ"א בקרה באמצעות האכלה, ועברו כמתואר בפרוטוקול ובאיור 1. אות GFP גרעיני בקו הנבט הובחן ידנית באמצעות מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי עבור דגימה של האוכלוסייה בכל דור. השתקת הטרנסגן חודרת במלואה בחיות P0 ו-F1 שטופלו ב-GFP RNAi (איור 2B). בדור ה-F2, שיעור האוכלוסייה המציגה ירושה של השתקת GFP היה כ-50%. עד דור F5, רוב האוכלוסייה לא הראתה ירושה של השתקה, ודור F10, לא נמצאה ירושה, כפי שכל בעלי החיים ביטאו GFP.

כדי לקבוע את השינוי בהעשרת H3K9me3 של היסטון המתאים להשתקה הנגרמת על ידי RNAi, ChIP-qPCR בוצע על בעלי חיים מדור F1 לאחר טיפול RNAi GFP או RNAi בקרה. כצפוי, האוכלוסייה שטופלה ב-GFP RNAi הציגה רמות גבוהות יותר של היסטון H3K9me3 ביעד ה-GFP ובאזור של 1.3 קילו-בתים במורד הזרם בהשוואה לחיות ביקורת שטופלו ב-RNAi (איור 2C). הספציפיות של ההיסטון H3K9me3 ChIP נתמכת על ידי העשרה במוקד בקרה חיובי (clec-18) הידוע כמועשר בסימן זה, אך לא במוקד בקרה שלילי קרוב (hrp-2). העשרת Histone H3 והעשרת כמעט רקע במשקעים החיסוניים של בקרת IgG זוהו גם הם בכל מוקדי qPCR, כצפוי. כאשר העשרת ChIP אצל המדווח מנורמלת למוקד הבקרה החיובי clec-18 , מוצגת העשרה גבוהה יותר של היסטון H3K9me3 על RNAi GFP, בעוד שהעשרת H3 של היסטון דומה בין הביקורת לבין טיפולי RNAi של GFP (איור 2D). מכיוון ש-GFP RNAi אינו צפוי להשפיע על היסטון H3K9me3 או על תפוסה כוללת של היסטון H3 בלוקוס clec-18 , נורמליזציה זו ממתנת את השונות הטכנית, כגון הבדלים ביעילות ChIP בין RNAi GFP לבין דגימות RNAi בקרה. שינוי הקיפול של רמות ההיסטון H3K9me3 וההיסטון H3 בין טיפולי RNAi מראה העשרה ספציפית של היסטון H3K9me3 לכתב GFP, ללא תלות בתפוסת ההיסטון, בהשתקה הנגרמת על ידי GFP RNAi (איור 2E).

איור 2: השתקה הנגרמת על ידי GFP RNAi מתאימה להעשרה מוגברת של H3K9me3 ביעד ה-RNAi. (A) דיאגרמה של כתב ה-GFP RNAi mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] עם אזורי אמפליקון qPCR מסומנים. (B) ביטוי GFP הבקיע לאורך דורות לאחר טיפולי RNAi ב 21 ° C. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן משני משכפלים ביולוגיים. (C) בקרת ChIP-qPCR של H3K9me3, היסטון H3 ו-IgG בצעירים בפורמולה 1 משני שכפולים ביולוגיים. CLEC-18 ו-HRP-2 הם מוקדי הבקרה החיוביים והשליליים להעשרת H3K9me3, בהתאמה. (D) H3K9me3 והעשרת היסטון H3 בכתב RNAi GFP מנורמל למוקד הבקרה החיובי clec-18. (E) שינוי בהעשרת H3K9me3 וההיסטון H3 בין GFP RNAi ובעלי חיים שטופלו ב-RNAi בקרה, עם נורמליזציה ל-clec-18. קו מקווקו מייצג שינוי קיפול של 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בפרוטוקול זה, dsRNA מוצג על ידי האכלה, אשר הפך לשיטה סטנדרטית ב- C. elegans¹⁸. עבור מבחני תורשה RNAi, גישת ההזנה מספקת שיטה קלה להשגת אוכלוסיית P0 גדולה 2,11,12,22,23,24,25. עם זאת, העיתוי ומשך החשיפה ל-RNAi משפיע על יעילות השתקת הטרנסגנים²⁶, וריכוז חיידקי ה-RNAi משפיע על ההתמדה של השתקת RNAi תורשתית¹. לכן, חיידקי RNAi מתוקננים וצמיחת תולעים חשובים להשגת רמה עקבית של השתקת GFP ומשך הירושה. כאן, עוברים מצופים על לוחות RNAi כך שחיות P0 נחשפות לחיידקי RNAi מהבקיעה. גישות חלופיות ציפו חיות שלב מסונכרנות L1 ^24,27 או^{L4 25} על לוחות RNAi-NGM. בנוסף, מכיוון שרעב ולחצים אחרים משפיעים על תחזוקת תורשה RNAi¹³, יש לפקח על הצלחות כדי למנוע צפיפות ותשישות של אספקת המזון. כחלופה להתחלת RNAi על ידי הזנה, חלק ממחקרי התורשה החלוציים של C. elegans RNAi גרמו ל-RNAi באמצעות הזרקת גונאד, המספקת שליטה גדולה יותר בריכוז dsRNA ^1,28.

בפרוטוקול זה, כל דור עובר כאוכלוסייה עם טיפול בהיפוכלוריט אלקליין, כפי שתואר קודם לכן 16,22,23,24. טיפול בהיפוכלוריט מבטיח שדור ה-F1 לא יזוהם בחיידקי RNAi מהסביבה ההורית²² ומונע צוואר בקבוק פוטנציאלי בלתי רצוי באוכלוסייה. עם זאת, מעבר בתפזורת עשוי להיות גם מגבלה, שכן לבעלי חיים בודדים עשויים להיות דפוסי ירושה שונים ^1,29. שיטה חלופית להקים כל דור היא לבחור בעלי חיים בודדים 1,2,9,11,25. גישה זו מאפשרת מעקב אחר פנוטיפים בתוך שושלות ושילוב של צלבים גנטיים. ניתוח שושלת עשוי להיות יתרון גם עבור פנוטיפים של חדירה נמוכה¹².

ביטוי חלבון פלואורסצנטי הוא קריאה עוצמתית ונוחה של השתקה הנגרמת על ידי RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. כמתואר בפרוטוקול זה, ניתן להבקיע ביטוי GFP באופן ידני כ- ON או OFF 11,12,15,16,25. ניתן לשפר עוד יותר את הניקוד הידני על ידי הקצאת רמות עצימות איכותיות ^3,4,14. לחלופין, ניקוד עוצמה אוטומטי של תמונות מיקרוסקופיה 11,12,14,25,27 או מדידת פלואורסצנטיות של ציטומטריית זרימה של בעלי חיים² יכולים לספק קריאה כמותית ובעלת תפוקה גבוהה. עם זאת, מכיוון שהביטוי של הכתב מוגבל לקו הנבט, אזהרה של גישות אוטומטיות היא שהן חייבות גם להבדיל בין בעלי חיים עם ביטוי GFP מושתק לעומת בעלי חיים ללא קו נבט, במיוחד אם המחקר משלב מוטנטים עם התפתחות לא תקינה של קו הנבט. כחלופה לפלואורסנציה של GFP, ניתן להשתמש בשעתוק לאחור (RT)-qPCR כדי לכמת את רמות המטרה של RNAi pre-mRNA ו-mRNA 2,16,23,24. גישה זו מספקת קריאה ישירה יותר של השתקה, המכוונת לרנ"א, והיא שימושית במיוחד עבור מטרות RNAi אחרות שבהן השתקה אינה מייצרת פנוטיפ נראה לעין. מגבלה בשימוש בכתבי GFP מלאכותיים היא שרצפים אקסוגניים ואנדוגניים מווסתים באופן דיפרנציאלי ב-RNAi¹¹ בין-דורי. לפיכך, יש לשקול מחקרים עם מטרות אנדוגניות, כגון האלל הקטלני העוברי הרגיש לטמפרטורה oma-1(zu405)^1,11,16,25, כגישה משלימה למדווחי טרנסגנים פלואורסצנטיים.

ניתוח ChIP בהקשר של מבחני תורשה RNAi דורש השוואה בין טיפולים ושכפולים. ראשית, כדי להסביר את ההבדלים בחומר המוצא בין הדגימות, אות ChIP מנורמל לאות קלט באותו מוקד כמו 'אחוז הקלט'. עיבוד של Histone H3 ChIP במקביל יעזור לקבוע אם שינויים כלשהם בשינוי ההיסטון תואמים לשינויים בצפיפות הנוקלאוזומים. בנוסף, מכיוון ש- ChIP הוא תהליך רב-שלבי, היעילות עשויה להשתנות בין דגימות. הבחירה של מוקדי בקרה חיוביים ושליליים מתאימים שימושית כדי להעריך ולהשוות את יחס האות לרעש בין דגימות וניסויים. בנוסף, כדי להקל על השוואות בין דגימות, ערכי מחזור הסף של ChIP DNA qPCR ביעד RNAi מנורמלים לעתים קרובות למוקד בקרה 3,11,15,23,30,31. כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול ב-RNAi, משווים גם את היחס בין אות ה-ChIP בטיפול ב-RNAi לעומת תנאי RNAi של בקרה או ללא תנאי RNAi. מגבלה של הגישה הנוכחית היא כי ChIP מבוצע עם בעלי חיים שלמים, בעוד התגובה לטיפול RNAi עשוי להיות ייחודי לקו הנבט. גישה להתגבר על אזהרה זו היא לבצע ChIP באמצעות גרעיני נבט מבודדים. שיקולים טכניים נוספים לאופטימיזציה של ChIP נדונו בהרחבה גם במקומות אחרים^32,33.

בסך הכל, פרוטוקול תורשה ו-ChIP זה של RNAi מספק בסיס מפורט וקל להסתגלות שניתן לשלב עם טכניקות אחרות כדי להמשיך לחקור רגולציה אפיגנטית בין-דורית. לדוגמה, ספריות ריצוף בתפוקה גבוהה יכולות להיבנות מהדנ"א ChIP (ChIP-seq) לקבלת תצוגה מפורטת יותר של נוף הכרומטין הן קרוב למטרה RNAi והן בקנה מידה גנומי רחב.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioshop	AGA002
Ampicillin	Bioshop	AMP201	הכינו תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
אנטי-H3K9me3 נוגדן רב-שבטי ארנב	Abcam	ab8898	ריכוז תלוי אצווה (0.9 - 1 מ"ג/מ"ל).
אנטי-היסטון H3 ארנב נוגדן רב-שבטי	Abcam	ab1791	ריכוז תלוי אצווה (0.7 - 1 מ"ג/מ"ל).
אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט)	Lavo	02358107
C. elegans זן עם GFP RNAi Reporter	NA	SX1263	Sapetschnig et al. 2015 (הפניה 7). מתנה ממעבדת א. מיסקה, אוניברסיטת קיימברידג'.
קרבניצילין	BioShop	CAR544	הכינו תמיסה של 25 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
Dynabeads חלבון G חרוזים מגנטיים	Invitrogen	10003D
E. coli זן HT115(DE3)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	HT115(DE3)
E. coli זן OP50-1	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50-1
EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Invitrogen	15575020
Fluorescence סטריאוסקופ	Zeiss	Axio Zoom.V16
פורמלדהיד (37%)	Sigma	F8775
Glycine	Sigma	50046	הכינו תמיסה של 1.25 מ' ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
HEPES-KOH (1 מ', pH 7.5)	Teknova	H1035
שקופיות מודפסות הידרופוביות, 10 בארות	VWR	100488-904
IGEPAL CA-630 (אוקטילפנול אתוקסילט)	BioShop	NON999	הכינו תמיסה של 10% (v/v) במים טהורים במיוחד ואחסנו בטמפרטורת החדר.
IPTG (איזופרופיל-ובטא;-D-thiogalactoside)	BioShop	IPT001	הכינו תמיסה של 0.2 גרם/מ"ל במים טהורים במיוחד. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122
צלחות אגר LB בתוספת 100 ומיקרו; גרם/מ"ל Ampicillin	NA	NA	מתכון מעבדה סטנדרטי.
Levamisole (טטרמיזול הידרוכלוריד)	Sigma	L9756	הכינו תמיסה של 200 מ"מ במים טהורים במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
LiCl (8 מ')	Sigma	L7026
M9 מאגר	NA		NA 22 מ"מ KH2PO4, 42 מ"מ Na2HPO4, 86 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgSO4.
מפריד מגנטי (צינורות 1.5 מ"ל)	Applied Biosystems	A13346
מפריד מגנטי (צינורות 0.2 מ"ל)	Permagen	MSR812
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית	פישר מדעי	12541B
מיקרוסקופ שקופיות	טכנולוג בחירה	LAB-037
NaCl (5 מ')	Promega	V4221	למאגרי ChIP.
נאו	סיגמא	S5881	הכינו תמיסה של 10 מ 'ואחסנו בטמפרטורת החדר.
NGM Plates	NA	NA	1.7% אגר, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) פפטון, 1 מ"מ CaCl2, 5 μ גרם/מ"ל כולסטרול, 25 מ"מ אשלגן פוספט pH 6.0, 1 מ"מ MgSO4, 50 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין.
ארנב רגיל IgG (1 מ"ג/מ"ל)	טכנולוגיית איתות תאים	2729
צלחות פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ)	Sarstedt	82.1135.500
פוספט חוצץ מלח (10X)	פישר ביו-ריאגנטים	BP3991
פלסמיד - RNAi	Addgene	L4440 (פלסמיד #1654)
פלסמיד - RNAi	Addgene	L4417 (פלסמיד #1649)	הערה, ניתן להשתמש בפלסמידים חלופיים שמקורם ב-L4440 המכוונים ל-GFP.
זוג פריימר [-3.3 kb במעלה הזרם של gfp]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
זוג פריימר [+1.3 kb במורד הזרם של gfp]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA F	: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: acgtgcgggatcatttcttact
זוג פריימר [clec-18]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	F: TGCTCCATGACCTCAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
זוג פריימר [gfp exon 1]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTTGC
זוג פריימר [gfp exon 4]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
זוג פריימר [HRP-2]	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	F: CGTCAACAGGGAGCAGCTGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCCA
טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	11836170001
פרוטאינאז K	Bioline	BIO-37084
QIAערכת טיהור PCR מהירה	Qiagen	28104
מערכת זיהוי PCR בזמן אמת	Bio-Rad	CFX96
לוחות RNAi-NGM	NA	NA	1.7% (w/v) אגר, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) פפטון, 1 מ"מ CaCl2, 5 ומיקרו; גרם/מ"ל כולסטרול, 25 מ"מ מאגר אשלגן פוספט pH 6.0, 1 מ"מ MgSO4, 25 ומיקרו; גרם/מ"ל קרבניצילין ו-5 מ"מ IPTG.
RNase A	Sigma	R4642
Sarkosyl (מלח נתרן N-Lauroylsarcosine)	Sigma	L5777	הכינו תמיסה של 10% (w/v) ואחסנו בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור למשך חודש אחד לכל היותר.
SDS	Sigma	74255	הכינו תמיסה של 10% (w/v) ואחסנו בטמפרטורת החדר.
נתרן דאוקסיכולאט	סיגמא	30970	יש ליצור תמיסה של 5% (w/v) ולאחסן בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור למשך חודש אחד לכל היותר.
צינור סוניקציה	ירוק עד	214-3721-010
מכסה צינור סוניקציה	ירוק עד	300-2911-020
סוניקטור	Qsonica	Q800R3-110
סטרפטומיצין סולפט	ביושופ	STP101	הכינו תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מאגר TAE (1X)	NA	NA	40 מ"מ טריס, 20 מ"מ אצטט, 1 מ"מ EDTA
Tally קליק מונה	Uline	H-7350
טטרציקלין	ביושופ	TET701	הכינו תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל באתנול ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
Thermomixer	Eppendorf	05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Invitrogen	15568025
Triton X-100	Sigma	T8787	הכינו תמיסה של 10% (v/v) במים טהורים במיוחד ואחסנו בטמפרטורת החדר.