מערכת הקלטה אלקטרואנצפלוגרפית בעלות נמוכה בשילוב עם סליל בגודל מילימטר כדי לגרות באופן טרנס-גולגולתי את מוח העכבר in vivo

גירוי מגנטי תוך גולגולתי (TMS) הוא כלי מבטיח למדעי המוח האנושי, ליישום קליני ולמחקר מודלים של בעלי חיים בגלל הפולשנות הלא/נמוכה שלו. במהלך השלב המוקדם של יישומי TMS, מדידת ההשפעה של קליפת המוח בתגובה ל-TMS של דופק יחיד וזוג בבני אדם ובבעלי חיים הוגבלה לקליפת המוח המוטורית; התפוקה הניתנת למדידה בקלות הוגבלה לפוטנציאלים מוטוריים מעוררים ולפוטנציאלים מיואלקטריים מושרים המערבים את קליפת המוח המוטורית ^1,2. כדי להרחיב את אזורי המוח שניתן למדוד באמצעות אפנון TMS, הקלטה אלקטרואנצפלוגרפית (EEG) שולבה עם TMS בעל פולס יחיד וזוג כשיטה שימושית לבחינה ישירה של ההתרגשות, הקישוריות והדינמיקה המרחבית-טמפורלית של אזורים ברחבי המוח כולו ^3,4,5. לפיכך, היישום הסימולטני של TMS ורישום EEG (TMS-EEG) במוח שימש לחקירת אזורי מוח שטחיים שונים בקליפת המוח של בני אדם ובעלי חיים כדי לחקור מעגלים עצביים תוך קורטיקליים (ראו Tremblay et ^al.6). יתר על כן, ניתן להשתמש במערכות TMS-EEG כדי לבחון מאפיינים מרחביים-זמניים נוספים בקליפת המוח, כולל התפשטות אותות לאזורים אחרים בקליפת המוח ויצירת פעילות תנודתית ^7,8.

אולם מנגנון הפעולה של TMS במוח נותר ספקולטיבי בגלל הלא-פולשניות של TMS, אשר מגבילה את הידע שלנו על האופן שבו המוח מתפקד במהלך יישומי TMS. לכן, מחקרי תרגום פולשניים בבעלי חיים, ממכרסמים ועד בני אדם, הם בעלי חשיבות מכרעת להבנת מנגנון ההשפעות של TMS על מעגלים עצביים ופעילותם. בפרט, עבור ניסויים משולבים TMS-EEG בבעלי חיים, מערכת גירוי ומדידה בו זמנית לא פותחה באופן אינטנסיבי עבור בעלי חיים קטנים. לכן, הנסיינים נדרשים לבנות מערכת כזו על ידי ניסוי וטעייה בהתאם לדרישות הניסוי הספציפיות שלהם. בנוסף, מודלים של עכברים שימושיים בין מודלים אחרים של מיני בעלי חיים in vivo מכיוון שזנים רבים של עכברים טרנסגניים ומבודדים זנים זמינים כמשאבים ביולוגיים. לפיכך, שיטה נוחה לבניית מערכת מדידה משולבת TMS-EEG עבור עכברים תהיה רצויה עבור חוקרי מוח רבים.

מחקר זה מציע שיטה משולבת TMS-EEG שניתן ליישם לגירוי והקלטה בו זמנית של מוח העכבר, שהוא הסוג העיקרי של בעל חיים מהונדס המשמש במחקר, ושניתן לבנות בקלות במעבדות מדעי מוח טיפוסיות. ראשית, מערכת הקלטה EEG בעלות נמוכה מתוארת באמצעות אלקטרודות בורג קונבנציונליות ומצע גמיש כדי להקצות מיקום מערך אלקטרודות בכל ניסוי. שנית, מערכת גירוי מגנטי נבנית באמצעות סליל בגודל מילימטרי, אשר יכול בקלות להיות מותאם אישית במעבדות טיפוסיות. שלישית, המערכת המשולבת TMS-EEG מתעדת פעילות עצבית בתגובה לקול ולגירוי מגנטי. השיטה המוצגת במחקר זה יכולה לחשוף את המנגנונים היוצרים הפרעות ספציפיות אצל בעלי חיים קטנים, ואת התוצאות המתקבלות במודלים של בעלי חיים ניתן לתרגם כדי להבין את ההפרעות האנושיות המתאימות.

במחקר הנוכחי, כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת הוקאידו. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J, שני זכרים ושלוש נקבות, בני 8 עד 10 שבועות. זהו הליך סופני. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. תכנון ובנייה גמישים של מערך דו-ממדי

1. הכינו את המספר הנדרש של אלקטרודות בורג זעירות (נירוסטה, SUS XM7; ראו טבלת חומרים) עם המאפיינים המבניים הבאים לשימוש כאלקטרודות הקלטה וייחוס של EEG: קוטר נומינלי, אורך צוואר וקוטר ראש של 0.6 מ"מ, 1.5 מ"מ ו-1.1 מ"מ, בהתאמה (איור 1A).
   הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-16 אלקטרודות בורג זעירות.
2. הכן שרטוט של דיאגרמת מעגל מודפס על מצע גמיש לפי השלבים הבאים.
   1. צור תבנית פד אלקטרודות דו-ממדית (דו-ממדית) על מצע גמיש (גודל שלם, 41.2 מ"מ × 19.9 מ"מ; ראה טבלת חומרים) להקראת אלקטרודות הבורג. תכנן את סידור האלקטרודות הדו-ממדי. איור 1B מראה את הסידורים הספציפיים ששימשו במחקר הזה ואת הקואורדינטות היחסיות מנקודת בסיס (הצלבה המסומנת במקור [0, 0]).
      הערה: במחקר הנוכחי, כדי לתעד את הפעילות העצבית בקליפת המוח השמיעתית בתוך האונות הרקתיות, מיקום האלקטרודות בכיוון הצידי לאמצעי (אופקי) היה ארוך יותר מזה שבכיוון הרוסטרלי לקאודלי (אנכי) (איור 1B).
   2. ודאו שעבור אלקטרודות רישום EEG, לכל משטח נחושת (ראו טבלת חומרים) על המצע הגמיש יש צורת טבעת בקוטר חיצוני של 1.3 מ"מ וקוטר פנימי של 0.8 מ"מ (איור 1C, משמאל). צור חור קטן (בקוטר 0.8 מ"מ) במרכז כדי שכל אלקטרודת בורג תעבור דרך המצע. עבור אלקטרודות הייחוס, כל כרית נחושת צריכה להיות צורה מרובעת עם אורך צד של 1.4 מ"מ; באופן דומה, צרו חור קטן (בקוטר 0.8 מ"מ) במרכז כדי שכל בורג יעבור דרך הפד המרובע שעל המצע (איור 1C, מימין).
   3. לאחר מכן, כדי לרתך מחבר להרכבה משטחית (איור 1D, משמאל), תכננו רפידות קריאה (מערך דו-ממדי) המובילות למחבר (איור 1D, מימין). לדוגמה, השתמש במחבר עם 2 × 10 פינים ופסיעה של 1.27 מ"מ בין פינים סמוכים (איור 1D, מימין).
   4. חוט את רפידות אלקטרודות הבורג ואת רפידות המחברים באמצעות שכבת המשטח והאחורית עם רוחב קו של 0.03 מ"מ ומרווח קו של 0.03 מ"מ (קווים דקים באיור 1E).
   5. יתר על כן, כדי לחבר את תעלות הייחוס והארקה למגבר, חברו את רפידות האלקטרודות עבור הייחוס ואת אלקטרודות הארקה לחלק המבודד בחלק החיצוני של המערך הדו-ממדי הגמיש (שני מלבנים אנכיים המסומנים על-ידי "G" ו-"HR" בתחתית איור 1E). לאחר קביעת תעלות הייחוס וההארקה, זכור לרתך את רפידות האלקטרודות למחברים המתאימים (ראה שלב 2.1).
   6. תכנון נכון של אזור חשוף שאינו מכוסה בשכבת הגנה (שכבת פולימיד). חשוף את רפידות המחברים בשכבת פני השטח תוך חשיפת רפידות אלקטרודות הבורג הן בשכבת המשטח והן בשכבת הגב. כל העיצוב, הגדלים והמערך הדו-ממדי הגמיש המעובד של האלקטרודות מתוארים באיור 1E, והתמונה של מצע מפוברק מוצגת באיור 1F.
   7. בחלק האלקטרודה העליון (חלק הראש) של המערך הדו-ממדי הגמיש, ודא שהמבנה התלת-שכבתי מלמעלה למטה מורכב מהדברים הבאים (עובי כולל של 49.0 מיקרומטר): שכבת נחושת עליונה (עובי 12.0 מיקרומטר), שכבה אמצעית של פולימיד ליבה (25.0 מיקרומטר) ושכבת נחושת תחתונה (12.0 מיקרומטר) (איור 1G, למעלה).
   8. חרטו את שכבות הנחושת על פני השטח העליונים והתחתונים של המצע, למשל, באמצעות תחריט רטוב וטכניקת הייצור הסטנדרטית⁹.
   9. בחלק המשטח הריבועי התחתון (חלק המחבר) של המערך הדו-ממדי הגמיש, יש לוודא שהמבנה בן שש השכבות מורכב משלוש שכבות, כולל שכבת נחושת עליונה (12.0 מיקרומטר עובי), שכבת פולימיד ליבה אמצעית (25.0 מיקרומטר) ושכבת נחושת תחתונה (12.0 מיקרומטר), אשר נדחקות על ידי שכבות פולימיד מגן, כולל שכבות עליונות ותחתונות (שתיהן 12.5 מיקרומטר). חברו לוח פולימיד בקוטר 2 מ"מ מלמטה כחומר מחזק (איור 1G, למטה).
      הערה: כדי לשמור על גמישות, לוח הפולימיד המחזק אינו מותקן על חלק הצוואר של המערך הדו-ממדי הגמיש בין חלק הראש למחבר.
   10. באופן דומה, בחלק המחבר, חרטו את שכבות הנחושת והפולימיד המגן בחלק העליון באמצעות תחריט רטוב וטכניקת הייצור הסטנדרטית.
       הערה: המשקל הכולל של התקן המערך הדו-ממדי המפוברק, הגמיש, כולל המחבר, הוא 0.84 גרם. לאחר תכנון פריסה למערך דו-ממדי גמיש, מומלץ לעתים להשתמש במצעים של יצרן מסחרי (ראה טבלת חומרים) מטעמי נוחות.

איור 1: חלקי הרכיבים של המערך הדו-ממדי (2D) הגמיש להקלטה אלקטרואנצפלוגרפית (EEG) וההתקן המפוברק, כולל המערך. (A) אלקטרודת הבורג הזעירה המוטמעת בגולגולת העכבר. (B) רפידות האלקטרודות המתוכננות למדידת פעילות המוח (עיגולים ירוקים) וערוץ הייחוס (ריבוע בפינה הימנית התחתונה). הקואורדינטות היחסיות של רפידות האלקטרודות מנקודת ייחוס (סימן צלב) במקור (0, 0) מוצגות; הגודל במילימטרים מתואר בסוגריים. הקואורדינטות המרכזיות של רפידות האלקטרודות סימטריות ביחס לציר האנכי העובר דרך סימן הצלב. (C) רפידות האלקטרודות וחורי הקידוח עבור אלקטרודת הקלטה (משמאל) ואלקטרודת ייחוס (מימין) מאוירים. (D) מחבר להרכבה משטחית (2 × 10 פינים) המשמש למערך הדו-ממדי הגמיש (משמאל) ולתבנית ולגודל של הרפידות המעוצבות על המצע (מימין). (E) שרטוט מתוכנן בגודל של כל חלק במילימטרים. (ו) תמונה של מצע מפוברק המסומנת בשרטוט ב-E. (G) מבנה השכבות של המערך הדו-ממדי הגמיש (חלקי ראש ומחבר). מוצגות התצוגות העליונות והצידיות של רפידות אלקטרודות הבורג (למעלה) ומשטחי הקריאה (למטה). הראש וחלקי המחבר מורכבים ממבנה תלת שכבתי (למעלה) ומבנה שש שכבות (למטה), בהתאמה. בנוסף, חלק הצוואר מורכב ממבנה בן חמש שכבות; שכבת פולימיד מגן מותקנת על המשטח העליון והאחורי, ולוח הפולימיד המחזק אינו מותקן על חלק הצוואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. בניית מתאם ומיפוי ערוצים

1. בצע בניית מתאם בהתאם לשלבים הבאים.
   1. פיזר שטף הלחמה על מחבר 2 × 10 פינים להרכבה משטחית (איור 1D, משמאל) ועל רפידות המחברים של המערך הדו-ממדי (איור 1D, מימין) (ראה טבלת חומרים) על המצע הגמיש.
   2. הלחמת את מחבר 2 × 10 הפינים להרכבה משטחית לרפידות המחברים. בפרט, אשרו את החיבור בין שני הרפידות בחלק התחתון של המערך הדו-ממדי לבין שני פיני המחברים שמשמשים כתעלות ייחוס והארקה (איור 2A).
   3. חבר כל אחד משני הרפידות לחוטי עופרת נפרדים כדי להזין אותות בסיסיים לנקודה חיצונית (לדוגמה, נקודת הארקה המחוברת לערוץ הקרקע של מערכת המדידה; איור 2A).
      הערה: במחקר זה, לעומת זאת, אחת מרפידות האלקטרודות המעגליות עם אלקטרודות בורג שימשה כאלקטרודת ייחוס במקום אלקטרודה מרובעת בחלק המחבר.
   4. לאחר ההלחמה, כסו את נקודות ההלחמה באמצעות שרף אפוקסי (ראו טבלת חומרים) כדי להגן על הנקודות החשופות ולמנוע קצרים.
2. הצמד את כבל המחבר ואת מגבר הראש לפי השלבים הבאים.
   1. הכן מחבר בידוד-תזוזה (IDC) עם 2 × 10 פינים ופסיעה של 1.27 מ"מ (איור 2B, למעלה משמאל) וכבל סרט שטוח של 20 פינים (ראה טבלת חומרים) עם פסיעה של 0.635 מ"מ (איור 2B, למטה משמאל). גזור את כבל הסרט השטוח לאורך הנדרש (לדוגמה, 40 ס"מ).
   2. כווץ את IDC וקצה אחד של כבל הסרט השטוח באמצעות כלי כיווץ IDC (איור 2B, למעלה מימין) (ראה טבלת חומרים).
   3. הפרד כל שורה בקצה השני של הכבל עד כ-15 מ"מ מקצה הכבל באמצעות חותך. פשטו את הבידוד 3 מ"מ מקצה הקצה.
   4. חבר את IDC המכווץ לכבל הסרט השטוח ולמחבר 2 × 10 הפינים המולחם למצע הגמיש (איור 2C).
   5. אשר את ההתאמה בין אלקטרודת ההקלטה לבין הקו המופרד של הכבל. ודא שכל שורה שבה נעשה שימוש אינה יוצרת שגיאת חיבור שגויה.
   6. הלחמת את חוטי הנחושת החשופים של הקווים הנפרדים המתאימים לפלט של כל אלקטרודה למחבר 20 הפינים (פסיעה של 1.25 מ"מ) של מערכת המדידה, כולל המגבר הראשי (איור 2B, למטה מימין).
   7. לאחר ההלחמה, יש לאשר את ההולכה בין רפידות אלקטרודות הבורג לבין פיני המחבר באמצעות ציוד בדיקה (לדוגמה, מד LCR; ראו טבלת חומרים).
   8. כסו את נקודות ההלחמה באמצעות שרף אפוקסי וסרט מיגון כדי להגן עליהן מפני נזק ולמנוע מגע עם קווי איתות אחרים.
   9. באמצעות שרף אפוקסי, הדביקו מוט נירוסטה דק (קוטר: 1.1-1.2 מ"מ; אורך: 100 מ"מ) לצד האחורי של חלק המחבר של המערך הדו-ממדי על המצע הגמיש.
      הערה: מחזיק מיקרומניפולטור יכול לתפוס את מוט הנירוסטה הזה במהלך ניסויים (איור 2C).
   10. לבסוף, אשרו את המיפוי בין אלקטרודות הבורג ותעלות פלט האות (איור 2D).

איור 2: בניית מתאם למערך אלקטרודות דו-ממדי (2D) על המצע הגמיש ומיפוי ערוץ הקלטה. (A) בחלק המחבר, תעלות הייחוס והארקה מחוברות לרפידות האלקטרודות התחתונות באמצעות חוטי עופרת. אם תעלות הייחוס והארקה נקבעות מראש, יש לחבר את התעלות לרפידות האלקטרודות התחתונות המתאימות בשלב התכנון. במקרים כאלה, הלחמת חוטי עופרת לתעלות ולרפידות האלקטרודות מיותרת. (B) מחברי בידוד-תזוזה (למעלה משמאל) מכווצים לקצה אחד של הכבל השטוח (למטה משמאל) כדי לחבר את מחבר מגבר המדידה (למעלה מימין). כל הקווים המתאימים לערוצים שישמשו מולחמים למחברים הירוקים (מימין למטה). במקרה זה, מכיוון שכל מחבר ירוק המחובר למגבר הראש מוקצה למדידה של שמונה ערוצים, נדרשים לפחות שני מחברים כדי להקליט אותות פעילות מוחית של 16 ערוצים. הנקודות המולחמות מכוסות בשרף אפוקסי ובסרט מיגון כדי למנוע מגע עם קווי איתות אחרים. (C) המחבר והכבל המיוצר מונחים על פני השטח של מצע המערך הדו-ממדי הגמיש. מוט הנירוסטה הדק מחובר לצד האחורי של המצע הגמיש. (D) המיקומים המרחביים של ערוצי הקלטה על פני המוח של העכבר ומפות הערוצים של כל נקודה עבור מערכת המדידה מוצגים. במקרה זה, ישנם 16 ערוצי הקלטה עם אלקטרודות בורג (עיגולים אדומים), אם כי המספר הכולל של אתרי הקלטה אפשריים הוא 32. 16 הערוצים האחרים שאינם מקליטים מוצגים גם הם כעיגולים ירוקים על פני המוח. בתרשים המיפוי, "G" ו- "R" מציינים את התעלות המיועדות לאלקטרודות הארקה ואלקטרודות ייחוס, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח בעלי חיים

1. הכינו את סביבת הניתוח הסטרילית.
   1. ללבוש ציוד מגן, כגון כפפות לטקס, במהלך כל הליך הניסוי מעורבים בעלי חיים.
   2. לעקר את המנגנון הסטריאוטקסי ואת כלי הניתוח (ראה טבלת חומרים).
   3. לאחר עיקור כלי הניתוח, שטפו אותם במי מלח סטריליים.
2. מרדימים את בעלי החיים.
   1. למדוד את משקל העכבר לפני הניתוח. מתן אטרופין סולפט (0.04 מ"ג/ק"ג; ראו טבלת חומרים) באמצעות הזרקה תוך צפקית.
   2. מרדימים את העכבר באמצעות הזרקה תוך צפקית של תערובת של medetomidine (0.3 מ"ג / ק"ג), midazolam (4.0 מ"ג / ק"ג) ו butorphanol (5.0 מ"ג / ק"ג).
   3. ודא את עומק ההרדמה לפי רמת התגובה באמצעות צביטת הבוהן.
      הערה: ההרדמה תפוג לאחר כ-40 דקות. אם העכבר מגיב לצביטת בוהן, יש לתת את אותו מינון של תערובת ההרדמה באמצעות זריקה תוך צפקית.
3. התכוננו מראש לניתוח השתלת אלקטרודות.
   1. חותכים את שפם העכבר כדי למנוע תחושה הפטית.
   2. יש לשמן את שתי העיניים במשחה אופתלמית למניעת התייבשות. סגרו את העפעפיים כדי לחסום את חוש הראייה ושמרו על סגירה על ידי הדבקת העפעפיים העליונים והתחתונים בנייר דבק.
   3. לגלח את השיער על ראש העכבר עם קוצץ חשמלי. הכנס מדחום לפי הטבעת ושמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° C באמצעות כרית חימום.
   4. יש לתת לידוקאין הידרוכלוריד כהרדמה מקומית מקומית לחלק של קרקפת העכבר שייחתך.
   5. חותכים את קרקפת העכבר באמצעות אזמל או מספריים כירורגיים בכיוון רוסטרלי לקאודלי (גודל שטח: 7 × 10 מ"מ²).
   6. צבטו את הקרקפת ליד החלק החתוך בפינצטה והרימו אותה. הסר את הקרום הנראה על הגולגולת באמצעות אזמל או מספריים כירורגיים. אין לשבור את כלי הדם סביב העיניים במהלך הניתוח.
   7. אחוז את העור ליד שני מרכזי קו החתך של הקרקפת עם מלקחיים והרחיב את החלק החתוך כדי לחשוף באופן נרחב את החלק העליון של הגולגולת.
   8. לאשר את ההסרה המלאה של כל הממברנות על פני הגולגולת ואת הרקמה סביב lambda עם מספריים כירורגיים.
   9. יש להרטיב את פני הגולגולת במי מלח פיזיולוגיים כדי לשפר את הנראות של משטח המוח מתחת לגולגולת ולאתר את הסינוס הרוחבי.
      הערה: בעת השתלת אלקטרודות בורג לתוך הגולגולת, זכור לא להטמיע אותם מעל ולתוך הסינוס הרוחבי.

4. השתלת אלקטרודה

1. חבר את מוט הנירוסטה המותקן למערך האלקטרודות הדו-ממדי בצד האחורי של המצע הגמיש למיקרומניפולטור. מניחים את המצע הגמיש על הגולגולת.
2. התאימו את מיקום הערוצים (Chs) 3 ו-14 (איור 2D) במערך כך שיתאימו לקוליקולוס התחתון.
   הערה: הקוליקולוס התחתון ממוקם לאורך הסינוס הרוחבי. אנו ממליצים לאשר מראש את מיקומו של הקוליקולוס התחתון באמצעות אטלס מוח עכבר.
3. ציירו עיגולים קטנים במיקומים של Chs 3, 8, 9 ו-14 (איור 2D) על הגולגולת עם סמן קבוע שישמש כנקודות ציון ממוקדות.
4. יבש את משטח הגולגולת כדי לשפר את ההיצמדות לצמנט הדנטלי ולבודד חשמלית את מערך האלקטרודות הדו-ממדי על המצע הגמיש מגולגולת העכבר.
5. יש למרוח מלט דנטלי (עובי של כ-1 מ"מ; ראו טבלת חומרים) על משטח הגולגולת. לאחר מריחת המלט הדנטלי, המתינו כ-30 דקות עד שהוא יחלים.
6. יישרו את המצע הגמיש בהתאם לסימנים המעגליים הקטנים על פני הגולגולת.
7. יישרו את קצה המקדחה הדנטלית לכל חור בכרית האלקטרודות במצע הגמיש. קדח בזהירות לתוך הגולגולת דרך כל אחד מחורי כרית האלקטרודות.
8. הבריגו כל אחת מאלקטרודות הבורג המיניאטוריות דרך החורים שנקדחו בגולגולת באמצעות מברג ייעודי לברגים זעירים.
9. כווץ את ראש אלקטרודת הבורג ואת כרית האלקטרודה בחוזקה. לבסוף, מדוד את המוליכות בין כל אלקטרודת בורג לבין המחבר באמצעות ציוד בדיקה (למשל, מד LCR) כדי לאשר מוליכות חשמלית.

5. תכנון ובניית סלילים קטנים

1. עצבו דיסק בצורת סופגנייה (ראו קובץ קידוד משלים 1) עם חור במרכז (קוטר פנימי: 2 מ"מ; קוטר חיצוני: 7 מ"מ; עובי: 1 מ"מ) באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD) (ראו טבלת חומרים).
2. באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס שני דיסקים (איור 3A, משמאל) העשויים מחומר שאינו עמיד בחום (לדוגמה, נימה של חומצה לקטית); חומר שאינו עמיד בחום אינו תמיד הכרחי (ראה להלן).
3. חיתוך מוט פרמלוי-45 (קוטר: 2 מ"מ; ראו טבלת חומרים) ליצירת מוט קצר (אורך: 60 מ"מ).
4. הכנס את הפיר לכל חור של שני הדיסקים המודפסים בתלת-ממד (איור 3A, מימין). מניחים דיסק אחד בקצה הפיר ואת השני 11 מ"מ מהסוף, והתוצאה היא מרחק של 10 מ"מ בין שני הדיסקים. הדביקו את הדיסקים בדבק מיידי (ראו טבלת חומרים).
5. חברו את קצה הפיר ללא דיסק למנהל התקן פגיעה (איור 3B). חבר מגנט קטן לפיר permalloy-45. מקם חיישן אפקט הול ליד המגנט 5 מ"מ מהפיר. חבר את חיישן אפקט ההול למערכת איסוף נתונים (DAQ; ראה רשימת חומרים).
6. כדי לספור את מספר הסיבובים, הכינו תוכנית מחשב (ראו טבלת חומרים) המנתחת אותות פלט מחיישן אפקט הול באמצעות מערכת DAQ.
7. חבר חוט נחושת דק (קוטר: 0.16 מ"מ) לפיר והדבק את הקצה העליון של החוט עם דבק מיידי.
8. באמצעות דרייבר הפגיעה, סובב את חוט הנחושת במשך 1,000 סיבובים בין שני הדיסקים. למרות שמהירות הסיבוב שרירותית, בדרך כלל משתמשים בכ-5 סיבובים בשנייה. לאחר מכן, לדבוק חוט הפצע עם דבק מיידי.
9. נתק את שני הדיסקים מהפיר. אם הדיסקים דבוקים חזק לפיר, להמיס את הדיסקים באמצעות אקדח חום.
10. מכסים את הסליל בשרף אפוקסי כדי לבודד ולאבטח את פני השטח. לאחר מכן, לחתוך את החלק פיר unwound כמו עודף.
11. ודא שגובה הסליל המתקבל הוא 10 מ"מ וקוטר של 6 מ"מ (איור 3B, משמאל). עבור מניפולציה של סליל, בנו מחזיק סליל (איור 3C, מימין) או הדביקו מוט נירוסטה לסליל (לא מוצג כאן).
12. מדוד את ההתנגדות וההשראות של הסליל באמצעות מד LCR (ראה טבלת חומרים). לדוגמה, לסליל המשמש כאן הייתה התנגדות זרם ישר (DC) של 18.3 Ω והשראות של 7.9 mH בכניסת זרם חילופין (AC) של 1 kHz. תכונות AC (התנגדות והשראות) מוצגות באיור 3D.
13. השתמש במחולל פונקציות כדי להחיל גל ריבועי דו קוטבי על הסליל. המשרעת האופיינית של מתח הכניסה היא 20 V דרך ספק כוח דו קוטבי עם רווח פי 10, לאחר יציאת גנרטור 2 V. צורת הגל המתקבלת היא גל ריבועי דו-קוטבי עם משרעת משוערת של 20 וולט (כלומר, מתח שיא לשיא של 40 וולט) (איור 3E).
14. מדוד את צפיפות השטף המגנטי באמצעות חיישן אפקט הול ומערכת DAQ. במקרה זה, לדוגמה, צפיפות השטף המגנטי (B) של הסליל הייתה 113.6 ±2.5 mT (ממוצע ± SEM) כאשר תחתית הסליל הייתה במגע עם חיישן אפקט הול (איור 3F).

איור 3: סליל קטן לגירוי מגנטי. (A) דיסק מודפס תלת-ממדי (תלת-ממדי) (משמאל). שני דיסקים זהים מודבקים לפיר permalloy-45; אחד נמצא בקצה הפיר, והשני נמצא במרחק של 10 מ"מ (מימין). (ב) התקנה לפיתול הסליל. פיר 60 מ"מ עם שני הדיסקים מחובר למנהל התקן השפעה. חיישן אפקט הול ממוקם ליד המגנט הקטן המחובר לפיר. חוט הנחושת נקטע בין שני הדיסקים. (ג) סליל בנוי. גובהו של הסליל 10 מ"מ, קוטרו 6 מ"מ והוא בעל 1,000 סיבובים של חוטי נחושת. הצד הימני של האיור מראה את הסליל שעבר מניפולציה על ידי מחזיק סליל מודפס בתלת-ממד. (D) תכונות AC של הסליל שנרשמו על ידי מד LCR: התנגדות (עליונה) לעומת תדירות הקלט הסינוסואידלי; (למטה) השראות לעומת תדירות קלט. לסליל טיפוסי יש התנגדות והשראות של 21.6 ו- 7.9 mH, בהתאמה, ב- 1 kHz של קלט AC. (E) צורת גל מלבנית ביפאזית המשמשת כקלט סליל שנרשם על ידי אוסצילוסקופ. (F) הקשר בין צפיפות השטף המגנטי לבין המרחק בין סליל בנוי לבין חיישן אפקט הול. צפיפות השטף המגנטי נרשמה על ידי חמישה חיישני אפקט הול שונים, פעם אחת עבור כל חיישן. הממוצע של חמש מדידות משורטט, וקווי שגיאה מייצגים את שגיאות התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. מערכת הקלטת אותות ונוהל

1. חבר את המערך הדו-ממדי הגמיש למערכת ההקלטה (ראה רשימת חומרים) באמצעות כבל הסרט השטוח.
2. חבר את מוט הנירוסטה המורכב על הסליל למיקרומניפולטור (ראה טבלת חומרים).
3. מקם את הסליל מעל ברגמה וכוונן את המיקום בכיוון הקאודלי כדי למקם את נקודת המוקד מעל הקוליקולוס התחתון. נקודת המוקד של השדה החשמלי הפולט היא קו האמצע של אזור הפצע על פני השטח התחתונים של הסליל (כלומר, 1 מ"מ מהקצה למרכז).
4. הכינו מערכת גירוי המורכבת מספק כוח דו-קוטבי וגנרטור פונקציות (ראו טבלת חומרים) וחברו את הסליל למערכת.
5. חבר כבל בין מסוף הקלט של מחולל הפונקציות לבין מסוף הפלט של מערכת DAQ כדי להחיל אותות הדק על מחולל הפונקציות ממערכת DAQ. הכן תוכנית מחשב מתאימה לאותות טריגר ליזום גירויים. בנוסף, חבר את מערכת DAQ למערכת ההקלטה כדי לשמור את זמני הגירוי כחותמות זמן.
6. התחל את תהליך הרכישה עבור מערכת ההקלטה.
   הערה: אם מערכת ההקלטה קולטת רעש, מצא את מקור הרעש והפחת אותו.
7. בדוק את הגירוי המגנטי על ידי הפעלת מערכת הגירוי.
   הערה: אם הרעש המופק על-ידי הגירוי המגנטי רווי את טווח המדידה, כוונן את הטווח כראוי. בנוסף, ודא שמערכת ההקלטה שומרת את חותמות הזמן של הגירוי כראוי.
8. התחל להקליט את נתוני התגובה והתחל במפגשי גירוי. הפסק את ההקלטה כאשר כל הפעלת גירוי הושלמה. שמור את כל הנתונים המוקלטים לניתוח הבא.
   הערה: כדי לבצע את כל תנאי הניסוי עם חמש עוצמות מגנטיות שונות, לדוגמה, הזמן הכולל הדרוש לכל המפגשים היה בערך 75 דקות. נקודת הסיום נקבעה בדרך כלל לאחר שכל ההקלטות הסתיימו. עם זאת, כאשר החיות הראו סימנים קליניים כולל שיעול, נשימה מאומצת והתנשפות, מפגש הניסוי הופסק מיד. עבור המתת חסד, עריפת ראשים בוצעה באמצעות מספריים חדים ונקיים בזמן שבעלי חיים היו תחת הרדמה.

7. ניתוח נתונים

1. סנן את אות הפס הרחב (RAW) באמצעות מסנן בעל מעבר נמוך בתדר חיתוך של 200 הרץ.
2. אסוף צורות גל מסוננות במהלך חלון זמן סביב כל חותמת זמן לגירוי. ממוצע צורות הגל כדי לקבל את צורות הגל הקשורות לאירוע (ERP) (איור 4 ואיור 5).

נתוני EEG לדוגמה שנרשמו בעכברי C57BL/6J מורדמים עם המצע הגמיש בשילוב עם אלקטרודות הבורג מוצגים להלן.

כדוגמה טיפוסית, צורות הגל הממוצעות של EEG שנוצרו בתגובה לגירוי קול (8 kHz טון פרץ, 80 dB רמת לחץ קול [SPL]) מוצגות עבור 60 ניסויים עם גירויים זהים (איור 4A). שרטוט של מיפוי ערוצי הקלטה מוצג גם באמצע איור 4A. התגובות של Chs 5, 7, 10 ו-12 מתועדות מאזורים ליד קליפת המוח השמיעתית בשתי האונות הרקתיות. בצורות הגל הבודדות של EEG של התעלות הממוקמות סביב אזורי השמיעה (הקוליקולוס התחתון וקליפת המוח השמיעתית), התגובות למעט תוצרי הגירוי היו תחילה שליליות – מיד לאחר הופעת גירוי הקול (למשל, Chs 3 ו-10); אמפליטודות השיא היו 45.6 ±-4.0 μV ו-25.6 ±-1.5 μV, בהתאמה. התגובות לאחר מכן היו חיוביות במידה מסוימת מעבר לקו הבסיס (איור 4B,C) והתנדנדו תוך כדי שיכוך. לעומת זאת, תגובות מערוצים אחרים היו כמעט בלתי תלויות בהופעת הגירוי, אם כי חלק מצורות הגל של הערוץ הראו תגובות דומות.

איור 4: צורות גל של פוטנציאל הקשור לאירועי קול (ERP) ב-16 אתרים במוח העכבר. (A) בתגובה לגירוי צליל (8 kHz tone-burst, 80 dB SPL) המופעל על עכבר מורדם, מודגמות צורות גל ERP בנות 16 ערוצים. הסכימה של מוח עכבר מוצגת במרכז, ו-16 אתרי ההקלטה (עיגולים אדומים) על פני השטח של מוח העכבר מסומנים על-ידי מספרי ערוצים. במקרה זה, נעשה שימוש ב -16 ערוצי הקלטה; 16 הערוצים האחרים שאינם מקליטים מוצגים כעיגולים ירוקים. (B) תצוגות מורחבות של צורות גל ERP עבור Ch 3. (C) תצוגות מורחבות של צורות גל ERP עבור Ch 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

באופן דומה, צורות הגל הממוצעות של רישומי EEG בתגובה לגירוי מגנטי קצר (V in = 60 Vpp) של האזור הסמוך לקוליקולוס התחתון הימני מוצגות עבור 60 ניסויים עם גירויים זהים באיור 5A. שרטוט של מיפוי ערוצי הקלטה מוצג גם באמצע איור 5A. מכיוון שסליל הגירוי היה ממוקם בסמוך לאזור Ch 14, חפץ הגירוי היה הגדול ביותר בתעלה זו. עם זאת, ממצאים גדולים יחסית של גירוי נצפו ברוב הערוצים מיד לאחר תחילת הגירוי, מה שמצביע על כך שהגירוי המגנטי השפיע על כל אתרי ההקלטה. מאחר שהתגובות של Chs 5, 7, 10 ו-12 תועדו מאזורים ליד קליפת המוח השמיעתית בשתי האונות הרקתיות, צורות הגל הבודדות של EEG למעט תוצרי הגירוי היו תחילה שליליות – הולכות ואז חיוביות במידה מסוימת, בהתאם למיקומי הערוצים (איור 5A-C). ליד אזורי השמיעה, מסלולי זמן התגובה המושרים על ידי גירוי מגנטי היו שונים מאלה המושרים על ידי גירוי קול. עבור Chs 3 ו-10, למשל, התגובות היו שליליות מיד לאחר תחילת גירוי הקול, אם כי אמפליטודות השיא היו 58.8 ±-4.0 μV ו-28.2 ±-2.0 μV, בהתאמה. יתר על כן, עם העלייה בעוצמות הגירוי המגנטי, אמפליטודות השיא של תגובות מונעות עבור Ch 10 גדלו (איור 5D), מה שמרמז על כך שהגירוי המגנטי שהושפע עורר תגובות עצביות.

איור 5: צורות גל של גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי (TMS) המונע על ידי אירועים הקשורים לאירועים (ERP) ב-16 אתרים במוח העכבר. (A) מודגמות צורות הגל של ERP בנות 16 ערוצים בתגובה ל-TMS (V in = 60 Vpp) המופעלות על עכבר מורדם. סכמה של מוח עכבר מוצגת במרכז, ו-16 אתרי ההקלטה (עיגולים אדומים) על פני השטח של מוח העכבר מסומנים על-ידי מספרי הערוצים. (B) תצוגות מורחבות של צורות גל ERP עבור Ch 3. (C) תצוגות מורחבות של צורות גל ERP עבור Ch 10. (D) סיכום עבור המשרעת של Ch. 10 ERPs המתעוררים בעוצמות מגנטיות שונות (מתח כניסה). לצורך ניתוח סטטיסטי, ANOVA עבור השוואות מרובות ואחריו מבחן Tukey-Kramer פוסט-הוק משמש. * ו- *** מייצגים את P < 0.05 ו- P < 0.001, בהתאמה. מספר הניסוי לפגישה הוא 60 פעמים עבור כל מצב של בעלי חיים בודדים. הנתונים הסטטיסטיים מחושבים עבור הדגימות המתקבלות משני בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטה זו יכולה גם להיות מורחבת בקלות לחיה קטנה וערה, שמחוברת באמצעות כבלים קשורים באמצעות מתאם משותף, ומקובעת עם מכשיר TMS לראש במהלך ההקלטה (איור משלים 1 ואיור משלים 2).

איור משלים 1: קיבוע סליל הגירוי המחובר לגולגולת עכבר. (A) עבור עכבר ער, מוצג סליל גירוי הקבוע עם גוף התאורה המחובר לגולגולת העכבר. (B) פוטנציאלים הקשורים לאירועים (ERPs) של העכבר הער תועדו בקופסת אקריל שבה העכבר יכול לנוע בתוך הקופסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: צורות גל של מערכות ERP מונעות קול וגירוי מגנטי טרנס-גולגולתי (TMS) ב-16 אתרים ממוחו של עכבר ער. (A) בתגובה לגירוי קול (פרץ צלילים של 8 קילוהרץ, SPL של 80 dB) המופעל על עכבר ער במקרה אקריל (איור משלים 1B), מודגמות צורות גל ERP של 16 ערוצים. הסכימה של מוח העכבר מוצגת במרכז, ו-16 אתרי ההקלטה (עיגולים אדומים) על פני השטח של מוח העכבר מסומנים על ידי מספרי ערוצים. במקרה זה, נעשה שימוש ב -16 ערוצי הקלטה; 16 הערוצים האחרים שאינם מקליטים מוצגים כעיגולים ירוקים. (B) באופן דומה, מודגמות צורות גל ERP של 16 ערוצים בתגובה ל-TMS (Vin = 60 Vpp) המופעלות על אותו עכבר ער. סכמה של מוח עכבר מוצגת במרכז, ו-16 אתרי ההקלטה (עיגולים אדומים) על פני השטח של מוח העכבר מסומנים על-ידי מספרי הערוצים. סליל הגירוי ממוקם בסמוך לאזור Ch 14. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ נתונים CAD עבור הדיסק בצורת סופגנייה הדרוש לבניית הסליל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין מה לחשוף.