שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות¹. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומים^{במידה רבה 2}. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בעיקר נוירובלסטים הנודדים לעבר פקעות הריח ותורמים לאוכלוסיית הנוירונים המקומית; לעומת זאת, אוליגודנדרובלסטים שנוצרו נודדים לכפיס המוח הסמוך (CC)³. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) הם תאים פעילים מיטוטית, המפוזרים באופן נרחב ברחבי מערכת העצבים המרכזית, אשר: i) מחויבים לשושלת אוליגודנדרוגליאלית, ii) יכולים לנדוד לאתרים של demyelination, ו iii) יכולים להתמיין לאוליגודנדרוציטים myelinating. OPCs גם להציג פוטנציאל התחדשות עצמית שקט⁴.

עד כה, הבידוד והמחקר של NSCs ו- OPCs דרשו דיסוציאציה לאחר המוות של רקמת המוח וחוט השדרה המנותחת. כדי לעקוף את המגבלה הניסויית הזו, הקמנו שיטה שמאפשרת, לראשונה, בידוד של תאי גזע עצביים במוח ו-OPC מבעלי חיים חיים. אנו קוראים לשיטה זו "חליבה", מכיוון שהיא מאפשרת אוספים מרובים של תאים מכיוון שהמאגרים שלהם אינם מתרוקנים. הפרוטוקול פותח בחולדות, בשל גודל המוח הגדול שלהן, המכוון בעיקר ל-SEZ, או CC, וכולל שני שלבים עיקריים. ראשית, NSCs או OPCs "מוסרים" מהרקמה באמצעות הזרקת i.c.v של "קוקטייל שחרור" המכיל neuraminidase, רעלן המשרה denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2). הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי דו צדדי בתוך החדרים הצדיים. אם השימוש המיועד הוא בידוד של NSCs, אזורים rostral של החדרים לרוחב ממוקדים. אם המטרה היא לבודד OPC בצורה טהורה יותר, הקוקטייל מוזרק באופן קאודלי באזור הפימבריה של ההיפוקמפוס. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי (CSF) מבוצעות מן cisterna magna של חולדות מורדמות, ללא צורך בחתך. הביופסיה הנוזלית מעורבבת עם מדיום תרבית NSC וניתן לשמור אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה.

הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר פרוטוקול: 5675/39/18-01-2021). נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley, Wistar ו-Long-Evans, שגילן נע בין חודשיים לארבעה חודשים ומשקלי הגוף שלהן בין 150 גרם ל-250 גרם. הפרוטוקול מסוכם באופן גרפי באיור 1.

1. שחרור הכנת קוקטייל

הערה: יש להכין טרי ביום ההליך ולשמור על קרח. הכמויות ניתנות לכל 2 μL שיוזרקו i.c.v בכל חדר לטרלי. יש להכין 1 מיקרוליטר נוספים לכל זריקה מיועדת.

1. הכינו 0.5 μL של 500 mU neuraminidase מ Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   הערה: אחסן אותו כמלאי U/μL 1 מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C. סוגים אחרים של neuraminidases לא נבדקו.
2. הכינו 1 μL המכיל 1 מיקרוגרם של נוגדן חוסם integrin-β1.
   הערה: אחסן אותו בטמפרטורה של 4°C.
3. הכינו 0.5 מיקרוליטר המכיל 0.5 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-בסיסי אנושי רקומביננטי).
   הערה: יש לאחסן אותו כציר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C.

2. הזרקת קוקטייל שחרור

הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 20 דקות. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.

1. מרדימים את חיית הניסוי בשאיפת איזופלורן (2.5% לאינדוקציה ו-2% לתחזוקה). אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפה האחורית והזנב) ואופן הנשימה.
   הערה: ניתן לבצע הליכים כירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג / ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג / ק"ג]). הרדמה עמוקה אושרה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפיים האחוריות והזנב) ואופן הנשימה.
2. מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.
3. הרכיבו את החולדה על המסגרת הסטריאוטקסית.
4. לגלח את הפרווה של הראש עם סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% povidone-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש.
5. בצע חתך של 2 ס"מ בעור הראש לאורך קו האמצע באמצעות אזמל סטרילי.
6. יש לנקות את הגולגולת בקפידה באמצעות מקלונים סטריליים ומלוחים סטריליים.
7. זהה את הברגמה באמצעות קצה המחט של מזרק המילטון 10 μL המותקן על המכשיר הסטריאוטקסי. הגדר את הברגמה כ"נקודה 0,0".
   הערה: הברגמה מזוהה כנקודת ההצטלבות בין התפרים הסגיטליים והעטרה. פרטים נוספים ניתן למצוא באטלס המוח של החולדות של פקסינוס וווטסון⁵.
8. העבר את ההתקן לקואורדינטות anterioposterior (AP) = 0.3 מ"מ, לרוחב (L) = +1.2 מ"מ (כדי לכוון ל-SEZ), או AP = 1.5 מ"מ, L = +2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).
9. קדח חור בור בקוטר 1 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית.
   הערה: בעת קידוח ידני, יש להיזהר שלא לפגוע במשטח קליפת המוח. הדימום לא צפוי להיות משמעותי. נקה כל דם עם מלוחים ולהפעיל לחץ כדי לעצור דימום מתמשך יותר.
10. לטעון 4 μL של קוקטייל שחרור מזרק 10 μL המילטון.
11. הורידו את המחט (רצוי קצה קהה או חרוט) של מזרק המילטון על מנת ליצור קשר עם הדורה.
12. הכנס את המחט בעומק הרצוי (D = 3.5 מ"מ).
    הערה: שפכו מי מלח על פני השטח של הדורה כדי לשמור על הרקמה רוויה.
13. יש להחדיר 2 μL של קוקטייל השחרור בקצב של 1 μL/min.
14. השאירו את המחט במקומה עוד 2 דקות לפני שליפה איטית כדי למנוע גלישה של קוקטייל השחרור.
15. חזור על שלבים 2.8-2.14 עבור חצי הכדור השני בקואורדינטות AP = 0.3 מ"מ, L = -1.2 מ"מ (כדי לכוון לאזור הכלכלי הכלכלי), או AP = 1.5 מ"מ, L = -2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).
16. תפרו את החתך בניילון 5-0 (קוטר 0.1 מ"מ) ונקו את האזור שנתפר בחומר חיטוי.
17. הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח.
    הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.
    1. עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. להחזיר את החיה לחברה של חבריה לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור התאוששות מלאה.
    2. יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. לטפל בסימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול) על ידי מתן שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine, תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.

3. ביופסיה נוזלית של נוזל מוחי שדרתי (CSF)

הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 10 דקות. הביופסיה הנוזלית המתוארת כאן מבוצעת 3 ימים לאחר הזרקת קוקטייל השחרור אך ניתן לבצעה בדיוק באותו אופן בעת הצורך. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.

1. מרדימים את בעל החיים בשאיפת איזופלורן (2.5% לזירוז ו-2% לתחזוקה). לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הקרנית
   רפלקס, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת גפה אחורית וזנב), ואופן הנשימה.
   הערה: ניתן לבצע את ההליכים הכירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג/ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג/ק"ג]). עם זאת, זה לא מומלץ כמו ההליך הוא קצר, במיוחד אם ביופסיות יבוצעו מספר פעמים בימים רצופים.
2. מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.
3. הרכיבו את חיית הניסוי על המסגרת הסטריאוטקסית. השתמשו במוטות אוזניים כדי לקבע את הראש מבלי להפריע לתנועה הסיבובית לכיוון החלק הקדמי והאחורי.
4. ייצבו את הראש בזווית של 40 מעלות כלפי מטה, כך שניתן יהיה להשיג הארכה טובה של העורף.
   הערה: אחת הדרכים לעשות זאת היא באמצעות סרגל הפה של המכשיר⁶.
5. לגלח את הפרווה באזור הצוואר באמצעות סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% פובידון-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם.
6. בעזרת קצה האצבע, מצאו את האזור הדיכאוני בצורת מעוין הממוקם בין הבליטה העורפית לעמוד השדרה של האטלס⁶.
7. ציירו סימן נקודה (למשל, באמצעות סמן).
8. תקן מזרק 1 מ"ל או 0.5 מ"ל על המסגרת הסטריאוטקסית.
   הערה: מומלץ להשתמש מזרקים עם מחטים שאינן ניתנות להסרה מכיוון שהם מייצרים יניקה טובה יותר ויש להם פחות נפח מת.
9. הביאו את המחט בנקודת המגע עם העור בנקודת הנקודה.
10. בעזרת זוג מלקחיים, הרימו את העור תוך הורדת המזרק דרך שכבות העור.
11. אחזר את הבוכנה מעט כדי ליצור לחץ שלילי במזרק.
12. הפעל מחדש כדי לטבול את המחט לאט מאוד עד שנוזל (CSF) מופיע במזרק.
13. ליישב את המחט במיקום זה ולאפשר זרימה איטית של CSF.
    הערה: ניתן להוריד או להגביה מעט את המחט אם זרימת CSF איטית מאוד.
14. התחל להסיר את CSF באיטיות (בצעדים של 40 μL / min) עד 120 μL.
15. שלפו לאט את המזרק.
16. מתן תוך-צפקי של 1 מ"ל של סרום רגיל לתמיכה בחידוש הנוזלים של חיית הניסוי.
17. מערבבים את הביופסיה הנוזלית (CSF) עם 400 μL של מדיום NSC ושומרים על צינור המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: יש לעבד ביופסיות נוזליות תוך 3 שעות אם לא להקפיא.
18. הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח.
    הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.
    1. עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. החזירו את בעל החיים לחברתם של חבריו לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור החלמה מלאה.
    2. יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. אם נצפים סימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול), יש לבצע שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.

4. עיבוד רקמה עבור immunofluorescence

1. להרדים את החיה על ידי עירוי תוך לבבי של 20 מ"ל של מלוחים קרים כקרח, ואחריו 50 מ"ל של 4% paraformaldehyde קר כקרח (PFA; במי מלח חוצצים פוספט [PBS] של pH = 7.4).
2. לנתח את רקמת המוח.
   1. להפריד את הראש מהגוף באמצעות מספריים כדי לבצע חתך באזור צוואר הרחם. השתמש במספריים כדי להסיר את העור ולאחר מכן לחתוך את עצם הגולגולת לאורך קו האמצע של קשת, כאשר קצות המספריים מצביעים כלפי מעלה כדי לא לפגוע ברקמת המוח. המטרה היא להמשיך לחתוך ככל האפשר, לעבור את קו האמצע העטרה.
   2. השתמש מלקחיים כדי להסיר את העצמות, החל מן העצמות supraoccipital ואת הקודקוד ולבסוף את העצמות הקדמיות.
   3. ברגע שרקמת המוח נחשפת, השתמשו במלקחיים או במרית כדי להרים אותה מהגולגולת. כדי להקל על כך, לחתוך את העצבים בבסיס המוח ואת נורות הריח, אם לא רצוי.
3. לאחר לתקן את הרקמה לילה ב 2% PFA ב 4 ° C.
4. Cryo-להגן על הרקמה ב 30% סוכרוז (ב PBS) לפחות 48 שעות ב 4 ° C עד הרקמה שוקעת לתחתית.
5. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C.
6. חתכו את רקמת המוח לחלקים קורונליים בעובי 14 מיקרומטר בעזרת קריוסטט.
7. ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ^3,7
   1. יש לדגור על המקטעים עם חיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 3% [BSA], 0.1% Triton X-100, ב-PBS) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
   2. בצע שליפת אנטיגן (רותח במשך 15 דקות במאגר ציטראט 10 mM, pH = 6.0, באמצעות צנצנות זכוכית).
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך הכרחי עבור אנטיגנים גרעיניים.
   3. יש להגיע לטמפרטורת החדר ולדגור עם נוגדנים ראשוניים נגד חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), דו-קורטין (Dcx), S100β ו-β-catenin (ראו טבלת חומרים) בחסימת חיץ למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   4. דגירה במשך שעתיים עם נוגדנים משניים ב- PBS עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור צביעה נגדית גרעינית בטמפרטורת החדר (ראה טבלת חומרים).
   5. הרכיבו את הכיסויים.

5. עיבוד תאים מבודדים עבור immunofluorescence

1. לוחים את התאים ללוחות 96 בארות תואמות מיקרוסקופיה, מצופות בפולי-D-ליזין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
2. תקן את התאים ב-2% PFA קר כקרח למשך 10 דקות ושטוף 3x עם PBS.
3. בצע immunofluorescence באמצעות הליכים סטנדרטיים^3,7 עבור PDGFRα, GFAP, Dcx^, SOX2 ו- ID3 (ראה טבלת חומרים).
4. שמור את התאים PBS + NaN₃ (0.1%) ב 4 ° C בחושך.

6. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה

1. צלם תמונות באמצעות אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי ובצע ספירת תאים באמצעות כלי תוכנה סטנדרטיים לניתוח תמונה, כגון מוני תאים.

שחרור ואיסוף של NSCs
NSCs של SEZ מופרדים מן CSF רק על ידי monolayer של תאים ependymal, אם כי הם נשארים בקשר ישיר עם התוכן החדר באמצעות intercalating mono-ciliated תהליכים 8,9. Neuraminidase פועל באופן ספציפי על תאים ependymal באמצעות מחשוף של שאריות חומצה sialic והוא יכול לגרום denudation של דופן החדר. זה מוביל אשכולות neuroblast על פני החדר10,11. יתר על כן, זרימה של נוירובלסטים נצפתה ב- CSF לאחר הזרקת i.c.v של נוגדן חוסם אינטגרין β1, כנראה עקב התרופפות של צמתי התאים הבין-אפנדימליים12. תצפיות אלו הובילו לפיתוח פרוטוקול המאפשר בידוד תאי גזע ותאי אב במוח באמצעות פגיעה מבוקרת בשלמות דפנות החדר הצידי. בשלב ראשון, השחרור מהפרנכימה והזרימה שלאחר מכן של NSCs או OPCs בתוך CSF מושרים באמצעות הזרקת i.c.v של קוקטייל השחרור. הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי בקצב של 1 μL/min, דו-צדדי (2 μL לכל הזרקה) בחדרים הצדיים (קואורדינטות המכוונות ל-SEZ NSCs: AP = 0.3 מ"מ, L = ± 1.2 מ"מ, D = 3.5 מ"מ; קואורדינטות המכוונות ל-CC OPCs: AP = 1.5 מ"מ, L = ± 2 מ"מ, D = 3.5 מ"מ). השלב השני ("איסוף") כרוך בביצוע ביופסיות נוזליות CSF ממגנה cisterna. החולדות צריכות להיות מורדמות ואת הביופסיה ניתן לעשות עם מזרקים 1 מ"ל. השימוש במכשיר הסטריאוטקסי מאפשר הצלחה כמעט מוחלטת בשליפת כ-100 מיקרוליטר CSF, ללא צורך בחתכים. הביופסיה הנוזלית מתווספת למדיום תרבית קרה ונשמרת בטמפרטורה של 4°C עד לציפוי במשך <3 שעות (מדיום תרבית NSC מכיל את מדיום הנשר המעובד של דולבקו [DMEM], תוסף B27 [2%], תוסף N2 [1%], FGF2 [20 ננוגרם/מ"ל], וגורם גדילה אפידרמלי [EGF; 20 ננוגרם/מ"ל]).

הערכה היסטולוגית של האזור הפריוונטריקולרי לאחר הזרקת קוקטייל השחרור
קבוצת ניסויים ראשונה גילתה שכאשר מזריקים יותר מ-3 מיקרוליטר נוזל, החדרים עלולים להינזק כתוצאה מפגיעה מכנית לא ספציפית (איור 2B,C). הזרקה איטית של 2 μL של קוקטייל שחרור הובילה להופעתם של אשכולות של נוירובלסטים אימונופוזיטיבים Dcx על פני החדר. הצבירים האלה נשארו גלויים אפילו 8 חודשים לאחר ההזרקה (איור 2D). מכיוון שהשיטה נועדה למחקרי אורך, שמטרתם מעקב ארוך טווח אחר בעלי החיים, הוערך הנזק לרקמות שנגרם על ידי קוקטייל השחרור. Immunostaining בוצע על קטעי מוח cryostat בעובי 14 מיקרומטר עבור סמנים תאים אפנדימליים, כגון S100β ו- β-catenin13, והשלמות הכוללת של שכבת אפנדימל הוערכה. אתרים של דנודציה של השכבה האפנדימלית היו קיימים רק קרוב לרמה הרוסטרוקאודלית של הזריקות, עם ירידה הדרגתית בהפרעות בשכבת אפנדימל שהתגלו באזורים אחוריים וקדמיים יותר של SEZ (איור 2E,F) ונעדרו לאחר מרחק של ±2 מ"מ ממקום ההזרקה. התוצאות הנ"ל מראות כי הדנודציה החלקית של שכבת האפנדימל הנגרמת על ידי הזרקת i.c.v של קוקטייל השחרור היא מוקדית, מרוסנת בקרבת אתר ההזרקה, ומשאירה את שאר שכבת האפנדימל הפריוונטריקולרית ללא פגע.

פרופיל סמן והתנהגות חוץ גופית של תאים שנאספו
לאחר מכן הוערכו התנהגות החוץ גופית ופרופיל הסמן של התאים שבודדו באמצעות פרוטוקול החליבה. תפוקת התאים הממוצעת של כל ביופסיה נוזלית היא כ-300 ±-45 תאים (לכל ביופסיה של 100 מיקרוליטר)7. ביופסיות חליבה הניבו תרביות NSC עם פוטנציאל מעבר ממוצע של 3.17 ± 0.45. תאים שבודדו מחולדות שהוזרקו במי מלח יכלו לעבור בממוצע 1.92 ± 0.76 פעמים; לעומת זאת, אלה שבודדו באמצעות חליבה הגיעו אפילו לתשעה מעברים (P = 0.038, מבחן T) (איור 3A)7. יכולת המעבר הממוצעת של תרביות נוירוספריות סטנדרטיות לאחר המוות, שמקורן ב-SEZ, גבוהה מ-12 מעברים בידינו. מכיוון שפוטנציאל ההתפשטות in vivo של NSCs SEZ, כפי שנחשף בניסויי מיפוי גורל תאי in vivo 14, הוכח כמוגבל, חליבה מייצרת תאים עם התנהגות שונה באופן משמעותי במבחנה מזו של תאים בתרביות סטנדרטיות, אם כי הרבה יותר קרובה להתנהגות של NSCs אנדוגניים. התאים שנאספו צופו על בארות מצופות פולי-D-ליזין, שם הם גדלו גם כחד-שכבות דבקות וגם לעתים רחוקות יותר כנוירוספרות (איור 3B). תאים מבודדים טריים (שנאספו 3 ימים לאחר ההזרקה ותוקנו 24 שעות לאחר הציפוי) שהיו חיוביים לסמן האסטרוגליאלי GFAP היו גם הם חיוביים ל-ID3, סמן של שקט, והיו בעלי מאפיין למורפולוגיה דו-קוטבית של NSC (איור 3C). יתר על כן, כפי שדווח קודם לכן7, השוואה אימונוציטוכימית מפורטת יותר של תאים שמקורם בביופסיה ושל תאים שמקורם לאחר המוות מאותן חיות, 3 ימים לאחר ההזרקה (חיפוש אחר אסטרוציטים GFAP+, נוירובלסטים Dcx+, אבות אוליגודנדרוציטים PDGFRa+ ותאי SOX2+ של השושלת העצבית) הראתה שהפרופיל של תאים שנאספו היה דומה לזה של תאי SEZ אנדוגניים (איור 3D). יש לציין כי כאשר הושוו תאים שמקורם בביופסיה וברקמות בתנאים שונים (למשל, הזרקת קוקטייל שחרור עם ובלי FGF2), נמצא כי גורם הגדילה הביא לעלייה מקבילה ומשמעותית בנוכחות תאי SOX2+, כמו גם לירידה משמעותית בנוכחות נוירובלסטים Dcx+ בשתי הדגימות (איור 3D). נתונים אלה אישרו כי כל שינוי המופיע בפרופיל של אוכלוסיות אנדוגניות של NSCs משתקף בדגימות תאים שנוצרו על ידי חליבה.

איור 1: סיכום גרפי של החליבה. חתך קורונלי של חצי כדור מוח אחד עם ציוני הדרך האנטומיים העיקריים (החדר הצידי, כפיס המוח שמעליו, והקומיסורה הקדמית למטה [חומר לבן באפור], והאזור התת-אפנדימלי בדפנות הצידיות [בכחול]). קוקטייל השחרור מוזרק לחדר הצידי, מה שמוביל לפגיעה בשלמות הרקמה ולשחרור תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה בנוזל השדרה, ממנו ניתן לאסוף אותם באמצעות ביופסיות נוזליות. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; LV = חדר לרוחב; CSF = נוזל מוחי שדרתי; pbNSCs = תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה; β1-int = אינטגרין בטא1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הערכה היסטולוגית של ההשפעות של זריקות i.c.v. (A-D) תמונות בהגדלה נמוכה של המחצית הגבית של החדר הצידי לאחר צביעה חיסונית עבור Dcx (באדום, כדי לסמן נוירובלסטים). (A) החדרת i.c.v פשוטה של מזרק המילטון אינה מפריעה לארכיטקטורה הציטו-ארכיטקטואלית של ה-SEZ, בעוד שהזרקת i.c.v של 10 מ"ל (קצב עירוי של 1 מ"ל/דקה) מובילה לנזק חמור של דופן החדר ללא קשר לתכולתו. (B) מלוחים ו-(C) קוקטייל שחרור. (D) הזרקה של 2 μL של קוקטייל השחרור מובילה לפשרה מבוקרת של דופן החדר, שנצפתה גם לאחר 8 חודשים לאחר הניתוח. פרטים בהגדלה גבוהה יותר של דופן ה-SEZ לאחר 7 ו-14 ימים לאחר ההזרקה מוצגים ב-(E) וב-(F), בהתאמה. ישנו מבנה לא מאורגן, כאשר נוירובלסטים Dcx+ (בירוק) נחים על פני השטח של הקיר והתאים האחרים של הגומחה (Sox2+, בלבן) נחים עמוק יותר. הרקמה הפריוונטריקולרית נפגעת ברמה הרוסטרוקאודלית של הזריקה בנקודת הזמן של חודשיים (ב-G), בעוד הרקמה שלמה ברמה קאודלית יותר (ב-H) באותה חיה. דופן החדר מוערכת על ידי immunostaining עבור סמנים אפנדימליים S100β ו β-catenin. פירוט הארכיטקטורה הטיפוסית של הקיר מוצג ב-(I). צביעה גרעינית מבוצעת באמצעות DAPI (מוצג בכחול). פסי קנה מידה = 300 מיקרומטר (A-C,G,H, כניסה), 150 מיקרומטר (D), 30 מיקרומטר (E,F) ו-50 מיקרומטר (I). נתון זה שונה מ McClenahan et al.13. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = doublecortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הערכת התאים שבודדו באמצעות חליבה. (A) גרף המציג את מספר המעברים המרבי המתקבל לכל דגימת ביופסיה נוזלית מבעלי חיים המוזרקים במי מלח (פסים אפורים, סה"כ 12 דגימות), או לאחר חליבה (פסים שחורים, סה"כ 29 דגימות, קוקטייל שחרור עם נוירמינידז ונוגדן חוסם אינטגרין β1). (B) תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי מייצג של תאים ראשוניים המתקבלת באמצעות חליבה, לאחר 3 ימים לאחר ההזרקה, מוכתמים חיסון כנגד GFAP ו-ID3. (ג,ד) תמונות ברייטפילד של תאים שבודדו 3 ימים לאחר ההזרקה, מצופות על בארות מצופות פולי-D-ליזין והורשו לגדול בתווך התפשטות NSC במשך 7 ימים. (E) גרף המציג את פרופיל סוג התא של תאים שבודדו באמצעות חליבה של SEZ ושל האוכלוסייה האנדוגנית של NSCs SEZ מאותן חיות ניסוי. שברי SOX2+ ו-Dcx+ גדלו וירדו באופן משמעותי, בהתאמה, לאחר הזרקה משותפת של FGF2. (ניתוח ANOVA חד-כיווני לסמן, ואחריו ניתוח פוסט-הוק; n = 4-6 בעלי חיים לכל קבוצת ניסוי.) פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C,D) ו- 10 מיקרומטר (B). נתון זה שונה מ McClenahan et al.13. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; DPI = ימים לאחר ההזרקה; NSC = תאי גזע עצביים; Dcx = doublecortin; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים להצהיר.