מאמר שיטה

חישת מצע תא חשמלי להערכה בזמן אמת של פרופילים טוקסיקולוגיים של מסגרת מתכת-אורגנית

DOI:

10.3791/65313

⸱

26 במאי 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הבא מעריך את הפרופיל הטוקסיקולוגי של מסגרת מתכתית-אורגנית נבחרת המשתמשת בחישת עכבת תא חשמלי (ECIS), טכניקת סינון בזמן אמת ובתפוקה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסגרות מתכת-אורגניות (MOFs) הן הכלאות הנוצרות באמצעות תיאום של יוני מתכת ומקשרים אורגניים בממסים אורגניים. היישום של MOFs ביישומים ביו-רפואיים ותעשייתיים הוביל לחששות לגבי בטיחותם. כאן, הפרופיל של MOF נבחר, מסגרת אימידזול זאוליטית, הוערך על ידי חשיפה לתאי אפיתל ריאה אנושיים. הפלטפורמה להערכה הייתה טכניקה בזמן אמת (כלומר, חישת עכבת תא חשמלי [ECIS]). מחקר זה מזהה ודן בכמה מההשפעות המזיקות של MOF שנבחר על התאים החשופים. יתר על כן, מחקר זה מדגים את היתרונות של שימוש בשיטה בזמן אמת לעומת בדיקות ביוכימיות אחרות להערכות תאים מקיפות. המחקר מסכם כי שינויים נצפים בהתנהגות התא יכולים לרמוז על רעילות אפשרית הנגרמת על ידי חשיפה MOFs בעלי מאפיינים פיסיקוכימיים שונים ואת המינון של מסגרות אלה בשימוש. על ידי הבנת השינויים בהתנהגות התא, אנו צופים את היכולת לשפר אסטרטגיות בטוחות על ידי תכנון של MOFs שישמשו ליישומים ביו-רפואיים על ידי התאמה ספציפית של המאפיינים הפיזיקוכימיים שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסגרות מתכת-אורגניות (MOFs) הן הכלאות הנוצרות באמצעות שילוב של יוני מתכת ומקשרים אורגניים 1,2 בממסים אורגניים. בשל מגוון שילובים כאלה, MOFs הם בעלי מגוון מבני3, נקבוביות מתכווננת, יציבות תרמית גבוהה ושטחי פנים גבוהים 4,5. מאפיינים אלה הופכים אותם למועמדים אטרקטיביים במגוון יישומים, החל מאחסון גז6,7 ועד קטליזה8,9, ומסוכני ניגוד 10,11 ועד יחידות אספקת תרופות12,13. עם זאת, הטמעת MOFs ביישומים כאלה עוררה חששות ביחס לבטיחותם הן למשתמשים והן לסביבה. מחקרים ראשוניים הראו, למשל, כי תפקוד התאים וגדילתם משתנים עם חשיפת התאים ליונים מתכתיים או למקשרים המשמשים לסינתזה של MOF 1,14,15. לדוגמה, Tamames-Tabar ועמיתיו הראו כי ZIF-8 MOF, MOF מבוסס Zn, מוביל לשינויים תאיים רבים יותר בקו תאי סרטן צוואר הרחם האנושי (HeLa) ובקו תאי מקרופאג עכבר (J774) ביחס ל- MOFs מבוססי Zr ו- Fe. השפעות כאלה נבעו ככל הנראה מהרכיב המתכתי של ZIF-8 (כלומר, Zn), שעלול לגרום לאפופטוזיס של התא עם התפרקות המסגרת ושחרור יוני Zn1. באופן דומה, Gandara-Loe et al. הראו כי HKUST-1, MOF מבוסס Cu, גרם לירידה הגבוהה ביותר בכדאיות תאי רטינובלסטומה בעכברים כאשר נעשה בהם שימוש בריכוזים של 10 מיקרוגרם/מ"ל ומעלה. זה היה כנראה בגלל יון מתכת Cu ששולב במהלך הסינתזה של מסגרת זו, אשר, לאחר שחרורו, יכול לגרום לעקה חמצונית בתאים שנחשפו15.

יתר על כן, ניתוח הראה כי חשיפה MOFs עם מאפיינים פיסיקוכימיים שונים יכול להוביל לתגובות שונות של תאים חשופים. לדוגמה, וגנר ועמיתיו הראו כי ZIF-8 ו-MIL-160 (מסגרת מבוססת Al), המשמשים בחשיפת תא אפיתל אנושי אלמותי, הובילו לתגובות תאיות התלויות בתכונות הפיזיקוכימיות של המסגרות, כלומר הידרופוביות, גודל ומאפיינים מבניים16. באופן משלים, Chen et al. הראו כי ריכוז של 160 מיקרוגרם / מ"ל MIL-100(Fe) שנחשף לתאי כבד נורמליים אנושיים (HL-7702) גרם לאובדן הגדול ביותר בכדאיות התאית, ככל הנראה בשל המרכיב המתכתי של מסגרת ספציפית זו (כלומר, Fe17).

בעוד שמחקרים אלה מסווגים את ההשפעות המזיקות של MOFs על מערכות תאיות בהתבסס על המאפיינים הפיזיקוכימיים שלהם וריכוזי החשיפה, ובכך מעלים חששות פוטנציאליים ביישום מסגרת, במיוחד בתחומים ביו-רפואיים, רוב ההערכות הללו מבוססות על בדיקות קולורימטריות של נקודת זמן אחת. לדוגמה, הוכח כי כאשר (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium (MTT) ומלח tetrazolium מסיס במים (WST-1) בדיקות היו בשימוש, ריאגנטים ביוכימיים אלה יכלו להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות על האינטראקציות שלהם עם חלקיקים כי התאים נחשפו גם18. מלח טטרזוליום וריאגנטים אדומים נייטרליים הוכחו כבעלי ספיחה גבוהה או זיקה קשירה על פני השטח של החלקיקים, וכתוצאה מכך הפרעות אות סוכן19. יתר על כן, עבור סוגים אחרים של מבדקים, כגון ציטומטריית זרימה, אשר הוכח בעבר כמשמש להערכת שינויים בתאים שנחשפו ל- MOFs20,21, הוכח כי יש לעקוף בעיות מרכזיות אם יש לשקול ניתוח בר קיימא של ההשפעות המזיקות של חלקיקים. בפרט, יש להתייחס לטווחי גילוי של גדלי החלקיקים, במיוחד באוכלוסיות מעורבות כמו אלה המוצעים על ידי MOFs או הפניות של החלקיקים המשמשים לכיול לפני שינויים תאיים,22. כמו כן הוכח כי הצבע המשמש במהלך תיוג תאים עבור בדיקות ציטומטריה כאלה יכול גם להפריע לננו-חלקיקים שהתאים נחשפו אליהם23.

מטרת מחקר זה הייתה להשתמש בהערכת תפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להעריך שינויים בהתנהגות התא בעת חשיפה ל- MOF נבחר. הערכות בזמן אמת יכולות לסייע לספק תובנות לגבי השפעות תלויות זמן, הקשורות לחלונות החשיפות16. יתר על כן, הם מספקים מידע על שינויים באינטראקציות תא-מצע, מורפולוגיה של התא ואינטראקציות תא-תא, כמו גם כיצד שינויים כאלה תלויים בתכונות הפיזיקוכימיות של החומרים המעניינים וזמני חשיפה24,25 בהתאמה.

כדי להדגים את התוקף והישימות של הגישה המוצעת, נעשה שימוש בתאי אפיתל סימפונות אנושיים (BEAS-2B), ZIF-8 (מסגרת הידרופובית של אימידזולאט זאוליטי16) וחישת עכבת תא חשמלי (ECIS). תאי BEAS-2B מייצגים מודל לחשיפה לריאות 26 ושימשו בעבר להערכת שינויים בחשיפת תאים לננו-חימר ולתוצרי הלוואי המתפרקים תרמית שלהם26,27,28, כמו גם להערכת הרעילות של ננו-חומרים, כגון ננו-צינוריות פחמן בעלות דופן יחידה (SWCNTs)18. יתר על כן, תאים כאלה משמשים כבר יותר מ -30 שנה כמודל לתפקוד אפיתל ריאתי29. ZIF-8 נבחר בשל יישומו הרחב בקטליזה30 וכחומרי ניגוד 31 לדימות ביולוגי ואספקת תרופות32, ובכך בשל הפוטנציאל המורחב לחשיפה לריאות במהלך יישומים כאלה. לבסוף, ECIS, הטכניקה הלא פולשנית בזמן אמת, שימשה בעבר להערכת שינויים בהידבקות תאים, התפשטות, תנועתיות ומורפולוגיה 16,26 כתוצאה ממגוון אינטראקציות בין אנליטים (חומרים ותרופות כאחד) ותאים חשופים בזמן אמת 16,18,28. ECIS משתמש בזרם חילופין (AC) כדי למדוד את העכבה של תאים משותקים על אלקטרודות זהב, כאשר שינויי העכבה מספקים תובנות לגבי שינויים בהתנגדות וקיבול בממשק מצע התא-זהב, תפקוד המחסום המושרה על ידי אינטראקציות תא-תא, וכיסוי שכבת התא של אלקטרודות זהב כאלה33,34. השימוש ב-ECIS מאפשר מדידות כמותיות ברזולוציה ננומטרית באופן לא פולשני בזמן אמת26,34.

מחקר זה מעריך ומשווה את הפשטות והקלות של הערכה של שינויים הנגרמים על ידי MOF בהתנהגות התאית בזמן אמת עם הערכות של בדיקה נקודתית. מחקר כזה יכול להיות אקסטרפולציה נוספת להערכת פרופילי תאים בתגובה לחשיפה לחלקיקים אחרים בעלי עניין, ובכך לאפשר בדיקת חלקיקים בטוחה על ידי תכנון ולאחר מכן סיוע ביישום. יתר על כן, מחקר זה יכול להשלים בדיקות גנטיות ותאיות שהן הערכות נקודתיות. זה יכול להוביל לניתוח מושכל יותר של ההשפעות המזיקות של חלקיקים על אוכלוסיית התאים ויכול לשמש לסינון רעילות של חלקיקים כאלה באופן תפוקה גבוהה 16,35,36.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזת ZIF-8

  1. לצורך דוגמה זו, השתמש ביחס מסה של 1:10:100 (מתכת:מקשר:ממס) כדי לסנתז את ZIF-8. לשם כך, למדוד אבץ חנקתי hexahydrate, ולהקליט את המדידה. השתמש ביחס המסה לדוגמה כדי לחשב את הכמות הדרושה עבור המקשר, 2-methylimidazole, ואת הממס (כלומר, מתנול).
  2. מניחים את אבץ חנקתי hexahydrate ו linker לתוך שני בקבוקוני זכוכית שונים. הוסף מחצית מהכמות המחושבת של מתנול להקסהידראט אבץ חנקתי ואת המחצית השנייה למקשר. אפשר לכל פתרון להתמוסס.
  3. שלבו בין שני הפתרונות (כלומר, תמיסות המכילות את המתכת ואת המקשר, בהתאמה). מניחים את המיכל עם התמיסה המשולבת לתגובה על צלחת ערבוב ומערבבים במהירות 700 סל"ד במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר (RT).

2. קולקציית ZIF-8

  1. לאחר סיום התגובה הנ"ל (כלומר, לאחר 24 שעות), מקם את התמיסה בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 3,075 x גרם למשך 5 דקות (השתמש בכמויות שוות ואזן את הרוטור). הסר את כל הסופרנאטנטים מהצינורות הצנטריפוגים.
  2. מוסיפים מתנול (5-15 מ"ל) לצינורות הצנטריפוגות ומפזרים מחדש את החלקיקים.
  3. חזרו על שלבי הצנטריפוגה והשטיפה לפחות פעמיים עד ארבע פעמים נוספות. לאחר השטיפה האחרונה, לפרוק את supernatant.
    הערה: שלבי השטיפה מסירים מינים שאינם מושקעים.
  4. הסר את מכסי הצינורות ומניחים סרט פרפילם מעל החלק העליון; לאחר מכן, חורר חורים בפרפילם. הניחו את הצינור/ים המכילים את הדגימה בתא ואקום ב-RT לייבוש למשך 24 שעות.

3. מורפולוגיית פני השטח ZIF-8 (מיקרוסקופ אלקטרונים סורק [SEM])

  1. הרכיבו את האבקות היבשות של ZIF-8 על סרט פחמן והתפזרו במשך 120 שניות עם פלדיום זהב, כדי למנוע טעינה שעלולה להתרחש במהלך ניתוח ה-SEM.
  2. הגדר את מתח ההאצה של המיקרוסקופ ל -15 קילו וולט. הביאו את החלקיקים למיקוד והתאימו את ההגדלה (נעשה שימוש בהגדלות של 500x, 1,000x, 1,500x, 4,000x, 10,000x, 20,000x, 30,000x ו-40,000x).
  3. דמיינו את החלקיקים תחת הגדלה המאפשרת גם גודל חלקיקים ברור וגם הערכה מורפולוגית (מומלץ לקחת בחשבון טווחים לחלקיקים של 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר).
  4. אסוף נתונים משלושה שדות ראייה שונים לפחות, ועבור כל אחד מהם, שקול הגדלות שונות.

4. הרכב היסוד ZIF-8

  1. בצע את השלבים עבור הדמיית SEM.
  2. באמצעות יחידת ספקטרוסקופיית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה (EDX) של מיקרוסקופ SEM, לנתח את הרכב היסוד דגימה.
  3. ודא שהמתח המואץ וההגדלה של SEM תואמים לצג EDX. כבה את מצלמת האינפרא אדום במיקרוסקופ SEM.
  4. בצג EDX, עבור אל Collect Spectrum והזן זמן איסוף של 200 שניות. מומלץ להימנע מטעינה והתפוררות של חלקיקים שעלולה להוביל להערכות שגויות.
  5. אסוף נתונים משלושה שדות ראייה שונים לפחות. לאחר סיום האיסוף, נתח את הנתונים וזהה את מרכיבי העניין.

5. תרבית תאים

  1. תרבית אימורטלית של תאי BEAS-2B במדיה בתוספת 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-0.2% פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: יש להשתמש במעברים בין 5-10 כדי להבטיח שלא חלו בעבר שינויים פנוטיפיים באצוות התא הנמצאת בשימוש37 (כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים).
  2. קח צלחת תרבית תאים 100 מ"מ ומניחים 10 מ"ל של המדיה על הצלחת. הוסף 1 מ"ל של תמיסת תא BEAS-2B לצלחת.
  3. הכניסו את הצלחת לאינקובטור (37°C, 5% CO2) ואפשרו לתאים לגדול.
  4. בדוק את הצלחת לאחר 24 שעות כדי לקבוע אם התאים הגיעו למפגש של 80%. כאן, המפגש של 80% מתייחס לאחוז משטח המכוסה על ידי תאים דבוקים. אם לא, שנו את המדיה ואפשרו לתאים לגדול עד שמגיעים לרמת מפגש של 80%.

6. ספירת תאים

  1. לאחר שהתאים על הצלחת הגיעו למפגש של 80%, הסר את המדיה מהצלחת. לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל של מלוחים חוצץ פוספט (PBS).
  2. הסר את PBS מהצלחת. מוסיפים 2 מ"ל טריפסין לצלחת ומניחים אותו באינקובטור (37°C, 5% CO 2) למשך2 דקות.
  3. הוסף 2 מ"ל של מדיה לצלחת וצינורות את המדיה למעלה ולמטה כדי להסיר את התאים מהצלחת. מעבירים את התמיסה לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 123 x גרם למשך 5 דקות.
  4. הסר את supernatant מן הצינור ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה. פיזר את המדיה למעלה ולמטה כדי לפזר מחדש את התאים.
  5. באמצעות צינור 1.5 מ"ל, להוסיף 20 μL של טריפאן כחול ולאחר מכן 20 μL של תמיסת התא (יחס 1: 1 של טריפאן כחול: תמיסת התא).
  6. הניחו 10 μL מתערובת התאים על מגלשת זכוכית והניחו אותה על מונה תאים אוטומטי. המתן עד שהמסך יתמקד ולאחר מכן בחר צלם.
  7. המסך מציג את מספרי התאים החיים ואת יכולת הקיום של התא. טווח המדידה משתרע בין 1 x 104-1 x 107 תאים.
  8. לחלופין, לספור את התאים באופן ידני באמצעות המוציטומטר.
    1. לשם כך, להוסיף 15-20 μL של תמיסת התא הכחול טריפאן מטופל hemocytometer.
    2. השתמש במיקרוסקופ זקוף עם מיקוד אובייקטיבי פי 10 על קווי הרשת של ההמוציטומטר.
    3. ספרו את מספר התאים בארבעת הריבועים החיצוניים וחלקו את המספר בארבע. לאחר מכן, הכפל ב- 10,000 כדי לקבל את מספר ספירת התאים החיים.
    4. כדי לחשב את כדאיות התא, חבר יחד את ספירת התאים החיים והמתים כדי לקבל את ספירת התאים הכוללת, ולאחר מכן חלק את ספירת התאים החיים בספירת התאים הכוללת.

7. הכנת מנת ZIF-8

  1. הכינו תמיסת ציר ZIF-8 של 1 מ"ג/מ"ל. לשם כך, מדדו את כמות ZIF-8 והוסיפו מים שעברו דה-יוניזציה (DI) לחלקיקים כדי להגיע לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
  2. Sonicate (הגדר את הסוניקטור לסוניקטור) פתרון מלאי ZIF-8 למשך 2 דקות במרווחים של 30 שניות באמבט מים.
  3. בצע מינונים שונים של ZIF-8 עבור חשיפות תאיות על ידי חישוב כמות תמיסת המלאי ותווך הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) הדרוש כדי להגיע למינונים הרצויים באמצעות המשוואה C 1 V1= C 2 V 2. המינונים ינועו בין 0-950 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: בניסוי זה נבחרו מינונים של 0 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 50 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מק"ג/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל ו-950 מק"ג/מ"ל.

8. ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC 50)

  1. לאחר ספירת תאים, זרעו את תאי BEAS-2B בצפיפות של 4 x 104 תאים / מ"ל בצלחת של 96 בארות, עם נפח של 100 μL / באר.
    1. כדי להגיע לצפיפות של 4 x 104 תאים/מ"ל, השתמש ב- C 1V1 = C 2 V2כדי לחשב את כמות תמיסת התאים הדרושה לשילוב עם המדיה.
    2. הקפד לשמור על בארות ריקות עבור כל מנה; השאירו בארות אלה ריקות עד לחשיפת ZIF-8.
  2. הכניסו את צלחת 96 הבארות לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 ואפשרו לתאים לגדול לשכבה חד-שכבתית מתמזגת למשך 24 שעות.
  3. הסר את המדיה מהבארות וחשף את תאי BEAS-2B למנות ZIF-8 בטווח של 0-950 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 100 μL של ZIF-8 לבארות הריקות והסלולריות שלהם.
  4. מחזירים את לוחות 96 הקידוחים לאינקובטור לזמן חשיפה של 48 שעות.
  5. לאחר החשיפה, יש להוסיף 10 μL של 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) לכל באר (בארות ריקות ובארות תאים) ולדגור במשך 2 שעות. התקשורת נשארת בבארות; היחס הוא 1:10 (מגיב:מדיה).
  6. קרא את השינויים בספיגה בקורא לוחות באמצעות ספיגה של 485 ננומטר.
  7. חשב את כדאיות התא באמצעות התוכנה כדי לקבוע את ערך IC 50 (ראה סעיף10 ).

9. חישת עכבת תא חשמלי (ECIS)

  1. השתמש בלוח 96 בארות (96W10idf) כדי לבצע ניתוח ECIS. לוח28 מכיל אלקטרודות חיבור אצבע בין-ספרתיות המכסות שטח של כ-4 מ"מ2.
  2. ראשית, בדקו שכל הבארות נקראות על ידי החיישנים. לשם כך, הניחו את צלחת 96 הבארות על תחנת הבאר ולחצו על כפתור ההתקנה .
  3. אם הבארות מחוברות כראוי, ירוק יופיע; בארות שאינן מחוברות יזוהו כאדומות. אם מתעורר מקרה כזה, הסר והכנס מחדש את צלחת הבאר ולחץ שוב על כפתור ההתקנה , עד שכל הבארות יציעו קריאות ירוקות בנות קיימא.
  4. ייצב את האלקטרודות למשך 40 דקות עם 200 מיקרוליטר מדיה לכל באר כדי למנוע סחף פוטנציאלי. הוסף 200 μL של מדיה לכל באר בשימוש ולאחר מכן הנח את צלחת 96 בארות על תחנת ECIS. לחץ על הגדרה/בדיקה כדי לוודא שהלוחית מחוברת כראוי. לחץ על Stabilize.
  5. לאחר השלמת הייצוב, הסר את הצלחת מהתחנה והסר את המדיה מכל באר.
  6. זרעו את תאי BEAS-2B בצפיפות של 4 x 104 תאים/מ"ל, בנפח של 100 מיקרוליטר לבאר, לתוך הבארות המכילות את התאים והניחו את הצלחת על תחנת ECIS באינקובטור.
  7. על הצג, לחץ על בדוק כדי לקבוע שכל האלקטרודות נקראות על ידי החיישנים בתחנה.
  8. הגדר את מדידת מסלול הזמן על-ידי בחירה באפשרות Multiple Freq/Time (MFT). התוכנית תמדוד כל באר בשבעה תדרים שונים.
  9. לחץ על התחל ואפשר לו לפעול במשך 24 שעות כדי שהתאים יוכלו ליצור שכבה חד-שכבתית מתמזגת.
  10. לאחר 24 שעות, הבארות המכילות תאים יראו התנגדות מוגברת על הצג. זהו אינדיקטור לכך שהתאים התחברו לאלקטרודות.
  11. לחץ על השהה בצג כדי להפסיק את איסוף הנתונים.
  12. בצע את מנות ZIF-8 בערך, מעל ומתחת לערך IC50 המחושב על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 7 לעיל.
  13. חשוף את חלקיקי ZIF-8 לבארות הריקות והסלולריות שלהם בהתאמה בנפח של 100 μL לבאר והנח את הצלחת בת 96 הקידוחים בחזרה לתחנה.
  14. לחץ על בדוק שוב על הצג כדי לוודא שהחיישנים קוראים את כל האלקטרודות. לחץ על חידוש ואפשר למערכת לפעול במשך 72 שעות כדי לפקח על ההתנהגות הסלולרית והקובץ המצורף.
  15. לאחר סיום איסוף הנתונים, לחץ על סיום בצג. כדי לשמור את הקובץ, לחץ על קובץ > שמירה בשם. שמור את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני.
  16. כדי לקבל את פרמטרי אלפא, לחץ על דגם. בחלון הקופץ של המסך, לחץ על מדיה בלבד ולאחר מכן בחר את הבאר שיש בה מדיה בלבד.
  17. לחץ על Set Ref. על הצג, לחץ על חפש.
  18. אם הבאר המוצגת במערכת אינה זהה למה שנבחר, חזור על שלב 9.16.
  19. לחץ על סט. לחץ על התאם טווח T כדי לקבוע את טווח הזמן הרצוי לאיסוף נתונים.
  20. בזמן העיבוד, לחץ על אלפא. כאשר המערכת מסיימת את הניתוח, לחץ על שמור RbA ושמור אותו כקובץ גיליון אלקטרוני.
    הערה: עיין במדריך ECIS, שניתן למצוא באתר האינטרנט של היצרן38.

10. ניתוח נתונים

  1. SEM
    1. פתח את תוכנת ההדמיה כדי לנתח את תמונות SEM. לחץ על קובץ > פתח ולאחר מכן בחר את התמונה לניתוח.
    2. לחץ על > תמונה הקלד > 8 סיביות כדי להמיר את התמונה לגווני אפור לביצוע פעולת הסף.
    3. כיילו את מדידת המרחק של פיקסלים למיקרונים. לחץ על הכלי קו ישר ועקוב אחר אורכו של כל חלקיק המיועד למדידה.
    4. לחץ על נתח ולאחר מכן על הגדר קנה מידה. המרחק הידוע יוגדר לאורך הגודל של סרגל קנה המידה בתמונת SEM. יחידת האורך הידועה תוגדר למיקרונים. בדוק את גלובלי ולחץ על אישור.
    5. לחץ על הכלי קו ישר ועקוב אחר קוטר החלקיק, ולאחר מכן בחר נתח ומדוד. רשום את תוצאת האורך.
    6. חזור על הפעולה עבור כל התמונות שנאספו. ממוצע כל הקטרים של לפחות 60 חלקיקים להערכה סטטיסטית מתאימה.
  2. EDX
    1. ממוצע כל אחוזי המשקל של כל רכיב יחד מכל התמונות שנאספו (ראה סעיף EDX לעיל).
    2. בעזרת גיליון אלקטרוני, שרטט תרשים עמודות של כל רכיב על ציר x ואת אחוז משקל היסוד הממוצע שלו על ציר y.
  3. IC50
    1. ממוצע הבארות הריקות וממוצע בארות המינון עבור כל שכפול.
    2. חשב את הריק המותאם על-ידי הפחתת הממוצע הריק של הבקרה מהממוצע הריק של המינון. חשב את ערך התא האמיתי עבור כל מנה על-ידי הפחתת הערך הריק המותאם מערך המינון הממוצע.
    3. חסר את הערך הריק המותאם עבור כל מנה מערך הבקרה הממוצע. חשב את כדאיות התא של כל מנה באמצעות המשוואה: כדאיות התא = (ערך תא אמיתי/(ערך בקרה - ערך ריק מותאם)) x 100.
    4. חזור על פעולה זו עבור כל העותקים המשוכפלים האחרים.
    5. ממוצע את כדאיות התא עבור כל שכפול יחד כדי לקבל את הכדאיות התאית הסופית עבור כל מנה.
    6. בתוכנה, בחר את הכרטיסייה XY על המסך.
    7. הזן את ערכי הריכוז (מנה) בעמודה X ואת כדאיות התא (%) מכל מנה לעמודה Y.
    8. המר את ערכי X על-ידי לחיצה על Analyze > Transform > OK ו- Transform X = Log(X).
    9. נרמל את ערכי Y על-ידי בחירת גליון הנתונים שהשתנו , לחיצה על נתח ולאחר מכן בחירה באפשרות נרמל.
    10. בחר את גליון הנתונים Normalize of Transform , לחץ על Analyze, ובחר Nonlinear Regression (Curve Fit). בחר מנה-תגובה-עיכוב ולחץ על Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (ארבעה פרמטרים). לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות.
  4. ECIS
    1. מהגיליון האלקטרוני, קח את עמודות ההתנגדות (אוהם) עבור כל שכפול (בארות ריקות ובארות מינון) וממוצע אותן יחד מתדר 4,000 הרץ. תדר זה מאפשר הערכת מגע בין תאים38.
    2. חשב את ההתנגדות המתוקנת על-ידי הפחתת הריק הממוצע מהמינון הממוצע עבור כל שכפול. ממוצע ההתנגדות המתוקנת עבור המשכפלים עבור כל מנה.
    3. חזור על אותם שלבים עבור ערכי אלפא כדי לחשב את פרמטר האלפא הממוצע. התווה את ציר x כזמן (h) ואת ציר y כערכי התנגדות/אלפא ממוצעים עבור כל ערך מנה.

11. ניתוח סטטיסטי

  1. SEM
    1. בצע סטיית תקן בקובץ הגיליון האלקטרוני שבו חושבו הקטרים הממוצעים של חלקיקי ZIF-8.
    2. באמצעות הפונקציה STDEV בגיליון האלקטרוני, סמן את הנתונים של 60 החלקיקים ולחץ על Enter. גרף את סטיית התקן עבור כל קוטר ממוצע מחושב.
  2. EDX
    1. בדומה ל- SEM (שלבים 11.1.1-11.1.2), חשב את סטיית התקן עבור כל הרכב יסוד ממוצע באמצעות הפונקציה STDEV בגיליון האלקטרוני. גרף את סטיות התקן עבור כל הרכב יסוד ממוצע.
  3. IC50
    1. פתח את התוכנה המשמשת לחישוב IC50 ולחץ על גיליון נתונים מקובצים.
    2. הזן את מנות ZIF-8 בשורות המסומנות קבוצה A, קבוצה B וכו '. הזן את כדאיות התא הממוצעת עבור כל מנה ושכפל בעמודה המתאימה למנה ZIF-8.
    3. לחץ על ניתוח, ותחת ניתוחי עמודות, בחר ANOVA חד-כיווני (ולא פרמטרי או מעורב).
    4. בכרטיסיה עיצוב ניסיוני , בחר ללא התאמה או התאמה. תחת התפלגות גאוס של שאריות, בחר כן השתמש ב- ANOVA. לבסוף, בחר כן השתמש בבדיקת ANOVA רגילה תחת הנח SDs שווים.
    5. תחת הכרטיסיה השוואות מרובות , בחר השווה את הממוצע של כל עמודה לממוצע של עמודת פקד. לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מודל משותף במבחנה קו תא 39 (BEAS-2B), מחקר זה נועד להדגים את ההיתכנות והישימות של ECIS כדי להעריך שינויים בהתנהגות התא בעת חשיפה ל- MOF מסונתז במעבדה. הערכת שינויים אלה הושלמה על ידי ניתוח באמצעות בדיקות קולורימטריות קונבנציונליות.

המאפיינים הפיזיקוכימיים של המסגרת הוערכו תחילה כדי להבטיח את יכולת השחזור של השיטות שננקטו, את תקפות התוצאות שהושגו ואת הדיונים הרלוונטיים של תוצאות כאלה. ניתוח מורפולוגיית פני השטח של ZIF-8, למשל, בוצע באמצעות SEM; תמונות הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח קודם הראה כי ECIS יכול לשמש כדי להעריך את ההתנהגות של תאים שנחשפו לאנליטים (כלומר, ננו-צינוריות פחמן35, תרופות43, או ננו-חימר16). יתר על כן, Stueckle et al. השתמשו ECIS כדי להעריך את הרעילות של תאי BEAS-2B שנחשפו לננו-חימר ולתוצרי הלוואי שלהם ומצאו כי ההתנהגות התאית וההתקשרות היו תלויות במאפיינים הפיזיקוכימיים של חומרים כאלה42. כאן הצענו לקבוע את השינויים האפשריים של תאי BEAS-2B בתגובה לחשיפה ל-MOFs, ובכך לתרום לגוף הידע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) תוכנית T32 (T32 GM133369) והקרן הלאומית למדע (NSF 1454230). בנוסף, מתקני מחקר משותפים של WVU וסיוע ותמיכה ביופיזיקה יישומית מוכרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  4-[3-(4-אידופניל)-2-(4-ניטרופניל)-2H-5-טטרזוליו]-1,3-בנזן דיסולפונאט (בדיקת WST-1) Roche5015944001
0.25% טריפסין-EDTA (1x)Gibco25255-056
צלחות 100 מ"מקורנינג430167
1300 סדרה A2 קולט אדיםתרמו סיינטיפיק323TS
2510 סוניקטור אמבטיה ברנסוןציוד תהליך & אספקה בע"מ 251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%Alfa Aesar693-98-1
5 מ"ל מיקרו-שפופרת סטריליתArgos TechnologiesT2076S-CA
50 מ"ל  צינורות לוחות באר פלקון352098
96W10idfביופיזיקה יישומית 96W10idf PET
96 בארותצלחות פישרברנדFB012931
BiorenderBiorenderN/A
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתInvitrogenC10283
Countess II FL מונה תאים אוטומטיLife TechnologiesC0916-186A-0303
Denton Desk V מקרטע וציפוי פחמןDenton VacuumN/A
דימטלי סולפוקסיד קורנינג25-950-CQC
DPBS/CytivaSH30028.02
מדיום הנשר השונה של Dulbeccoקורנינג10-014-CV
ECIS-ZΘביופיזיקה יישומית ABP 1129
Excelמיקרוסופטגרסה 2301
שפופרות פלקון (15 מ"ל)קורנינג352196
סרום בקר עובריGibco16140-071
קורא צלחות FLUOstar OPTIMABMG LABTECH413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)GraphPad Software, LLCגרסה 9.0.0
HERAcell 150i CO2 חממהתרמו סיינטיפיק50116047
היטאצ'י S-4700 מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה מצויד בצילום רנטגן מפזר אנרגיה Hitachi High-Technologies CorporationS4700 ו-EDAX TEAM תוכנת
ניתוח ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותN/A
תאי אפיתל סימפונות אנושיים אימורטלייםאוסף תרביות מסוגאמריקאי CRL-9609
מקפיא איזוטמפפישר סיינטיפיק 
מתנול, 99%פישר כימיקל67-56-1
סרט איטום פרפילםמחסן המעבדהHS234526A
פניצילין/סטפטומיציןגיבקו15140-122
צנטריפוגה Sorvall Legend X1R תרמו סיינטיפיק75004220
סורוול T 6000BDU PONT  T6000B
טריפן כחול, תמיסה של 0.4% ב-PBSMP Biomedicals, LLC1691049
תא ואקוםBelart999320237
אבץ חנקתי הקסהידרט, 98% טהור במיוחדAcros אורגני101-96-18-9
שונה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211(2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80(2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709(2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367(2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683(2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107(2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6(2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174(2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40(2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MOF

מאמרים קשורים