מאמר שיטה

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 באפריל 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים 6,7,8.

זיהוי אזורי הבקרה הדיסטליים בגנום הוא עניין המוסכם על כולם, שכן אזורים אלה מכילים שינויים ספציפיים בהיסטון 9,10,11 ומכילים מוטיבים ספציפיים של זיהוי גורמי שעתוק, המשמשים כפלטפורמות גיוס עבורם12,13,14. חוץ מזה, במקרה של משפרים ומשפרי על 15,16, יש להם גם תפוסה נמוכה של נוקלאוזומים 17,18 והם משועתקים ל-eRNA לא מקודד 19,20.

עם זאת, קשה יותר לחזות את גני המטרה של כל אלמנט ויסטלי דיסטלי. לעתים קרובות יותר, אינטראקציות בין אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לבין המטרות שלהם הן סוג תא וגירוי ספציפיים 21,22, משתרעים על פני מאות קילו-בסיסים, מגשרים על גנים אחרים לכל כיוון 23,24,25, ואפילו יכולים להיות ממוקמים בתוך אזורים אינטרוניים של גן המטרה שלהם או גנים אחרים שאינם מתערבים 26,27. יתר על כן, אלמנטים רגולטוריים דיסטליים יכולים גם לשלוט ביותר מגן אחד בו זמנית, ולהיפך28,29. מורכבות מיקום זו מעכבת איתור קשרים רגולטוריים ביניהם, ולכן רוב המטרות של כל אלמנט רגולטורי בכל סוג תא נותרות בלתי ידועות.

בשנים האחרונות חלה פריחה משמעותית בפיתוח טכניקות לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) לחקר אינטראקציות כרומטין. השימוש הנפוץ ביותר בהם, Hi-C, מאפשר ליצור מפה של כל האינטראקציות בין כל קטע של גנוםהתא 30. עם זאת, כדי לזהות אינטראקציות משמעותיות ברמת מקטע ההגבלה, Hi-C מסתמך על ריצוף עמוק במיוחד, ואוסר על השימוש בו כדי לחקור באופן שגרתי את הנוף הרגולטורי של גנים בודדים. כדי להתגבר על מגבלה כלכלית זו, התפתחו מספר טכניקות 3C מבוססות העשרה, כגון ChIA-PET31, HiChIP 32, ומקבילו בעל הקלט הנמוך HiCuT33. טכניקות אלה תלויות בשימוש בנוגדנים להעשרה לאינטראקציות כלל-גנומיות המתווכות על ידי חלבון מסוים. עם זאת, התכונה הייחודית של טכניקות 3C אלה היא גם הנזק של היישום שלהם; המשתמשים סומכים על זמינותם של נוגדנים איכותיים לחלבון המעניין ואינם יכולים להשוות בין מצבים בהם קשירת החלבון היא דינמית.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היא טכניקת 3C מבוססת העשרה נוספת העוקפת מגבלות אלה34,35. על ידי שימוש במערכת העשרת גשושיות RNA ביוטינילציה, PCHi-C מסוגל ליצור ספריות ברזולוציה גבוהה של אזורים גנומיים ברחבי הגנום המקיימות אינטראקציה עם 28,650 מקדמי גנים מבוארים לבני אדם או 27,595 עכברים, הידועים גם בשם אינטראקטום מקדם. גישה זו מאפשרת לזהות אינטראקציות ארוכות טווח משמעותיות ברזולוציית מקטע ההגבלה של מקדמים פעילים ולא פעילים כאחד, ולהשוות באופן יציב אינטראקטומים של מקדמים בין כל תנאי שאינו תלוי בדינמיקה של שינויים בהיסטון או קשירת חלבונים. PCHi-C נמצא בשימוש נרחב בשנים האחרונות כדי לזהות ארגון מחדש של אינטראקטומים במהלך התמיינות תאים 36,37, לזהות את מנגנון הפעולה של גורמי שעתוק38,39, ולגלות גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים שעברו דה-רגולציה במחלה על ידי וריאנטים לא מקודדים 40,41,42,43,44,45,46,47,48, לצד מוטציות לא מקודדות של נהגים חדשים49,50. חוץ מזה, רק על ידי שינוי מערכת לכידה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת אישית על פי השאלה הביולוגית לחקור כל interactome (למשל, interactome משפר 51 או interactome של אוסף של שינויים שאינם קידוד41,52).

עם זאת, PCHi-C מסתמך על מינימום של 20 מיליון תאים כדי לבצע את הטכניקה, אשר מונעת מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המשמשים לעתים קרובות ביולוגיה התפתחותית ויישומים קליניים. מסיבה זו, פיתחנו קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חדשה חסכונית וניתנת להתאמה אישית המבוססת על מסגרת הניסוי של PCHi-C ליצירת אינטראקטומים מקדמים ברזולוציה גבוהה עם קלט תאים נמוך. על ידי ביצוע הניסוי עם שינויים מינימליים בצינור, החלפה או ביטול של צעדים מפרוטוקול PCHi-C המקורי, הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושינוי ריכוזי ריאגנטים, מורכבות הספרייה היא מקסימלית וניתן ליצור ספריות באיכות גבוהה עם מעט כמו 50,000 תאים53.

לכידת קלט נמוך Hi-C (liCHi-C) נבדקה כנגד PCHi-C ושימשה להבהרת חיווט מחדש של אינטראקטום מקדם במהלך התמיינות תאים המטופויטיים אנושיים, גילוי גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים הקשורים למחלות שאינם מוסדרים על ידי שינויים שאינם מקודדים, וזיהוי הפרעות כרומוזומליות53. פרוטוקול שלב אחר שלב ובקרות האיכות השונות באמצעות הטכניקה מפורטים כאן עד לדור הסופי של הספריות והניתוח החישובי שלהן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה.

1. קיבוע תאים

  1. תאים הגדלים בתרחיף
    1. קצרו 50,000 עד מיליון תאים והכניסו אותם לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל.
      הערה: סוגי התאים המשמשים למחקר הנוכחי מפורטים בסעיף התוצאות המייצגות.
    2. צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות ב 600 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant על ידי pipetting.
    3. יש להשהות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) בטמפרטורת החדר.
    4. מוסיפים 143 μL של פורמלדהיד 16% ללא מתנול כדי להגיע לריכוז של 2% ומערבבים.
    5. דוגרים על התאים במשך 10 דקות תוך כדי סיבוב בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
      הערה: נסה להיות מדויק ככל האפשר עם הדגירה של 10 דקות. קיבוע יתר או חסר של התאים עלול להוביל לירידה באיכות הספרייה.
    6. להרוות את התגובה על ידי הוספת 164 μL של גליצין 1M קר כקרח ולערבב. דוגרים על התאים במשך 5 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
    7. עוד לדגור את התאים במשך 15 דקות על קרח, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 5 דקות.
    8. צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות ב 1,000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant.
    9. שטפו את התאים על ידי השעיית הגלולה ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS).
    10. צנטריפוגו את התאים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופרנטנט.
      הערה: ניתן להקפיא את התאים הכדוריים בחנקן נוזלי או בקרח יבש ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C.
  2. תאים דבקים
    1. לשטוף את התאים בצלחת תרבית עם 1x PBS.
    2. הכינו מספיק RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ופורמלדהיד 2% ללא מתנול בטמפרטורת החדר כדי לכסות את צלחת התרבית.
    3. מוסיפים את תוספת המדיה לצלחת התרבית עם התאים ודגרים במשך 10 דקות, מתנדנדים בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
      הערה: נסה להיות מדויק ככל האפשר עם הדגירה של 10 דקות. קיבוע יתר או חסר של התאים עלול להוביל לירידה באיכות הספרייה.
    4. להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 M גליצין עד 0.125 M ולערבב על ידי נדנדה.
    5. דוגרים על התאים במשך 5 דקות, מתנדנדים בטמפרטורת החדר.
    6. עוד לדגור את התאים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ערבוב על ידי נדנוד כל 3-4 דקות.
    7. הסר את המדיה ושטוף את התאים עם קר 1x PBS.
    8. מגרדים את התאים ומעבירים אותם לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. נגבו את צלחת התרבית עם 0.5-1 מ"ל של PBS 1x קר.
    9. צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות ב 1,000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות צנטריפוגת רוטור זווית קבועה ולהסיר את supernatant. התאים הכדוריים יכולים להיות מוקפאים במהירות הבזק בחנקן נוזלי או קרח יבש ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.

2. ליזה ועיכול

  1. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של חיץ ליזה קר (טבלה 1) כדי לשבש את קרום התא. תוספת המאגר לבדה אמורה להספיק כדי להשעות מחדש את התאים, אך ניתן להשהות אותם מחדש במידת הצורך על ידי מערבולות אור.
  2. דוגרים על קרח במשך 30 דקות, מערבבים על ידי היפוך כל ~ 5 דקות. צנטריפוגו את הגרעינים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את הגרעינים עם 500 μL של חיץ הגבלה קר 1.25x 2 (ראה טבלת חומרים).
  3. צנטריפוגו את הגרעינים למשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם (ב-4°C) והוציאו את הסופר-נטנט. השהה מחדש את הגרעינים ב 179 μL של 1.25x חיץ הגבלה 2.
  4. הוסיפו 5.5 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS; ראו טבלת חומרים) וערבבו. התאים עשויים ליצור גושים; זה נורמלי וצריך לפרק אותו ככל האפשר על ידי מערבולת. לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב 37 ° C thermoblock, עם רעד ב 950 סל"ד.
  5. להרוות את SDS על ידי הוספת 37.5 μL של 10% Triton X-100 ולערבב. לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב 37 ° C thermoblock, עם רעד ב 950 סל"ד.
  6. לעכל את הכרומטין על ידי הוספת 7.5 μL של HindIII (100 U/μL; ראה טבלה של חומרים) ולערבב. יש לדגור על הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמו-בלוק, עם רעידות ב-950 סל"ד.
  7. למחרת בבוקר, הוסיפו עוד 2.5 μL של HindIII (100 U/μL) והמשיכו לדגור על הדגימה במשך שעה אחת ב-37°C בתרמו-בלוק, עם רעידות ב-950 סל"ד כדי להבטיח עיכול כרומטין תקין.
    הערה: כחלק מבקרות יעילות העיכול (ראה שלב 5.1), העבר את המקבילה של 20,000 עד 40,000 גרעינים לצינור אחר כדי לייצג את הבקרה הלא מעוכלת. לאחר העיכול, להעביר את אותו מספר של תאים לצינור אחר שוב כדי לייצג את הבקרה מעוכל. מומלץ לבדוק את יעילות העיכול כניסוי נפרד אם זמינות חומר המוצא מועטה.

3. קשירה ו decrosslinking

  1. מצננים את הדגימה על קרח. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי למלא ולבצע ביוטינילציה של מקטע ההגבלה: 3 μL של 10x restriction buffer 2, 1 μL של מים נטולי נוקלאז, 0.75 μL של 10 mM dCTP, 0.75 μL של 10 mM dTTP, 0.75 μL של 10 mM dGTP, 18.75 μL של 0.4 mM biotin-14-dATP, ו-5 μL של 5 U/μL Klenow (ראה טבלת חומרים). לדגור על הדגימה במשך 75 דקות ב 37 ° C, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 15 דקות.
  2. מצננים את הדגימה על קרח. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי לקשור את קצוות הדנ"א שמולאו: 50 μL של 10x חיץ קשירה, 2.5 μL של אלבומין בסרום בקר (BSA) של 20 מ"ג/מ"ל, 12.5 μL של 1 U/μL T4 DNA ligase, ו-173 μL של מים נטולי נוקלאז (ראו טבלת חומרים).
  3. לדגור על הדגימה במשך 4-6 שעות ב 16 ° C, ערבוב על ידי היפוך כל ~ 1 שעות. יתר על כן, לדגור את הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צלבו את הכרומטין על ידי הוספת 30 μL של 10 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K וערבבו. לדגור את הדגימה לילה ב 65 ° C.
  4. למחרת בבוקר, הוסף 15 μL נוסף של 10 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ולדגור עוד יותר את הדגימה במשך 2 שעות ב 65 ° C כדי להבטיח decrosslinking כרומטין תקין.

4. טיהור DNA

  1. מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר ומעבירים אותה לצינורית מתאימה לטיהור פנול-כלורופורם.
  2. הוסף נפח 1 (545 μL) של פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1) כדי לטהר את הדנ"א ולערבב על ידי ניעור נמרץ.
  3. צנטריפוגו את הדגימה למשך 5 דקות במהירות של 12,000 x גרם בטמפרטורת החדר והעבירו את הפאזה המימית העליונה (545 μL) לצינור DNA בעל קישור נמוך של 2 מ"ל.
  4. הוסף את הריאגנטים הבאים כדי לזרז את ה- DNA: 1,362.5 μL של 100% אתנול מקורר ל -20 ° C, 54.5 μL של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2), ו 2 μL של 15 מ"ג / מ"ל גליקוגן כמו cocipitant.
  5. לדגור במשך שעה אחת ב -80 ° C או לילה ב -20 ° C.
  6. צנטריפוגו את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 16,000-21,000 x גרם ב-4°C והוציאו את הסופרנטנט. גלולת הדנ"א חייבת להיות גלויה.
  7. שטפו את הגלולה על ידי הוספת 1 מ"ל של 70% אתנול, מערבולות וצנטריפוגות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 16,000-21,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
  8. מוציאים את הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש באוויר. השהה מחדש את גלולת הדנ"א ב 130 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  9. להעריך את הריכוז על ידי כימות פלואורומטרי (ראה טבלת חומרים). אחסן את חומר 3C המטוהר ב -20 ° C במשך מספר חודשים לפני שתמשיך עם הפרוטוקול.

5. בקרות איכות אופציונליות

  1. להעריך את יעילות העיכול. בצע decrosslinking ו phenol:chloroform טיהור DNA, כפי שתואר קודם לכן, לבקרות מעוכלות ומעוכלות שהתקבלו בשלב 2.13. השהה מחדש את גלולת הדנ"א ב -10 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. לכמת את הריכוז ולדלל את הדנ"א המתקבל, במידת הצורך, ל 4 ng / μL.
  2. בצע PCR כמותי עם 4 ננוגרם של דנ"א הן של הביקורת הלא מעוכלת והן של קבוצת הביקורת המעוכלת, עם פריימרים המתפרשים על פני מוקד כרומטין פתוח עם וללא מטרה הינדית (ראה טבלה 2 לתכנון פריימר). חישוב יעילות העיכול בעקבות דוח שפורסם בעבר35.
    הערה: יעילות הקשירה מחושבת כאחוז באמצעות הנוסחה: עיכול (%) = 100 -100/(2^[(Ct מעוכל עם HindIII - Ctdigested ללא HindIII) - (Ct undigested with HindIII - Ct undigested without HindIII)]) (ראה טבלה 3), אשר לוקח בחשבון את ההבדל בין Cts שונים המתקבלים עבור כל זוג פריימר בבקרות לא מעוכלות ומעוכלות.
  3. הערך את הרגישות של זיהוי האינטראקציה על ידי ביצוע תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR) (0.2 mM dNTP, 0.4 מיקרומטר הן פריימרים F + R, 0.1 ו- U/μL התחלה חמה פולימראז), עם פריימרים המשתרעים על אינטראקציות ארוכות טווח וקצרות טווח של תאים אינווריאנטיים (ראה טבלה 2 לתכנון פריימר). יש להשתמש ב-50-100 ננוגרם של חומר 3C (לאינטראקציות קצרות וארוכות, בהתאמה) ולהגביר באמצעות התנאים הבאים: 98°C למשך 15 דקות, ולאחר מכן 37°C למשך 98°C למשך 30 שניות, 60°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת, וסיימו ב-72°C למשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: אם כמות הדנ"א המתקבלת קטנה מ-2 מיקרוגרם, בדוק רק אינטראקציה לטווח ארוך וקצר במקום את כל לוח האינטראקציה.
  4. הפעל את המוצר על 1x tris-borate-EDTA (TBE) באמצעות 1.6% ג'ל agarose ולחפש את נוכחותו של אמפליקון PCRהמתאים 54.
    הערה: בשל "חיתוך והדבקה" בלתי צפוי של הגנום, להקות לא ספציפיות עשויות להופיע. כל עוד גודל הרצועה הנכון נצפה, הוא נחשב כנכון.
  5. להעריך את היעילות של מילוי וקשירת ביוטין על ידי עיכול דיפרנציאלי של מוצר PCR לטווח קצר עם HindIII, NheI (ראה טבלת חומרים), אנזימים או אף אחד (מים), והפעלת המוצר על ג'ל אגרוז 1x TBE 1.6%. מילוי וקשירה נכונים מבטלים את יעד HindIII הקודם ויוצרים יעד NheI חדש, ולכן יש לחתוך את האמפליקון רק בנוכחות NheI.
    הערה: כדי למזער אובדן חומרים, אחזר 2.5 μL של מוצר PCR לטווח קצר מפקדי האינטראקציה והגבר אותו מחדש חמש פעמים כדי לבצע את בקרות המילוי והקשירה.

6. סוניקציה

  1. מעבירים את 130 μL של הדגימה (ממלאים במים נטולי נוקלאז אם חלקם שימשו לבקרות) לקובט המתאים לסניקציה.
  2. הגדר סוניקטור אמבט מים וסוניק באמצעות הפרמטרים הבאים (מותאם לדגם ולקוביות המתוארים בטבלת החומרים): מקדם חובה: 20%; שיא הספק התחלואה: 50; מחזורים לפרץ: 200; זמן: 65 שניות; וטווח טמפרטורות: 6-10 °C (8 °C אופטימלי).
  3. העבירו את הדגימה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.

7. תיקון סופי

  1. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים כדי לתקן את הקצוות הלא אחידים של מקטעי הדנ"א שנוצרו במהלך הסוניקציה: 18 μL של חיץ קשירה 10x, 18 μL של תערובת dNTP של 2.5 mM כל אחד, 6.5 μL של 3 U/μL T4 DNA פולימראז, 6.5 μL של 10 U/μL T4 PNK, ו-1.3 μL של 5 U/μL Klenow (ראו טבלת חומרים).
  2. יש לדגור על הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20°C ולמלא אותה במאגר Tris-low EDTA (TLE) (ראו טבלה 1) עד 300 μL.

8. הורדת ביוטין

  1. מעבירים 150 μL של חרוזי סטרפטווידין C1 (ראו טבלת חומרים) לכל דגימה לצינור של 1.5 מ"ל, מניחים אותם על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור.
  2. שטפו את החרוזים עם 400 μL של חיץ טווין 1x (שחפת; ראו טבלה 1). כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף את החיץ ולהשהות אותם מחדש על ידי מערבולות רכות. מחזירים את הצינור למגנט וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור.
  3. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x ללא חיץ Tween (NTB; ראו טבלה 1). השהה מחדש את החרוזים ב-300 μL של 2x NTB (ראה טבלה 1).
    הערה: החרוזים עלולים ליצור שכבה מאובקת סביב דופן הצינור בעת שטיפה עם חוצצים ללא חומר ניקוי. זה נורמלי ולא משפיע על התוצאה של הפרוטוקול.
  4. שלב 300 μL זה של חרוזים ב 2x NTB עם 300 μL של הדגימה. דוגרים במשך 15 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר כדי למשוך למטה את מקטעי הדנ"א האינפורמטיביים עם ביוטין. הספרייה דבוקה כעת לחרוזי סטרפטווידין C1.
  5. שטפו את החרוזים עם 400 μL של 1x NTB. שטפו את החרוזים עם 100 μL של חיץ TLE ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-35.7 μL של חיץ TLE.

9. זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR

  1. הכינו מאסטרמיקס והוסיפו את הריאגנטים הבאים לדגימה לזנב dATP בקצות מקטעי הדנ"א המתוקנים: 5 μL של 10x חיץ הגבלה 2, 2.3 μL של 10 mM dATP, ו-7 μL של 5 U/μL Klenow exo-. לדגור את הדגימה במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  2. השבתת Klenow exo- על ידי דגירה נוספת של הדגימה למשך 10 דקות ב 65 ° C. מצננים את הדגימה על קרח. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x TB. שטפו את החרוזים עם 300 μL של 1x NTB.
  3. שטפו את החרוזים עם 100 μL של 1x חיץ קשירה ולאחר מכן השהו אותם מחדש ב 50 μL של 1x חיץ קשירה. הוסף 4 μL של 15 μM תערובת מתאם מראש (ראה טבלה 2) ו- 1 μL של 2,000 U/μL T4 DNA ligase (ראה טבלת חומרים) לדגימה.
  4. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שטפו את החרוזים עם 400 μL של 1x TB. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 1x NTB. לשטוף את החרוזים עם 100 μl של 1x חיץ הגבלה 2.
  5. שטפו את החרוזים עם 50 μL של 1x restriction buffer 2 ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-50 μL של 1x restriction buffer 2.
  6. ערבבו את הריאגנטים הבאים כדי להכין את תגובת ה-PCR להגברת הספרייה: 50 מיקרוליטר חרוזים עם הספרייה, 250 מיקרוליטר של 2x PCR מאסטרמיקס עם אנזים, 12 מיקרוליטר של פריימרים F + R (25 מיקרומטר כל אחד; ראו טבלה 2), ו-188 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  7. בצע את ה- PCR בתנאים הבאים (פצל את תערובת מגיב ה- PCR לתגובות של 50 μL): 98 ° C במשך 40 שניות, ואחריו X מחזורים של 98 ° C עבור 10 שניות, 65 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30 שניות, וסיים על ידי 72 ° C במשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: השתמש במספר המחזורים הבא כנקודת התחלה למיטוב הפרוטוקול בתאים דיפלואידים המכוונים לפלט של 500-1,000 ננוגרם לפני לכידת הספרייה: מיליון תאים למשך שמונה מחזורים; 250,000 תאים במשך 10 מחזורים; 50,000 תאים במשך 12 מחזורים.
  8. אגרו את כל התגובות של 50 μL מאותה דגימה לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, הניחו אותו על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, והמתינו 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (500 μL) לצינור DNA חדש בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. מלאו את מאגר TLE ל-500 מיקרוליטר אם חלק מהסופרנאטנט אבד. חרוזי סטרפטאבידין C1 אינם נחוצים עוד.
  10. בצע בחירה דו-צדדית55 באמצעות טיהור חרוזים פאראמגנטי (נפח 0.4-1). זה מאפשר חיסול סלקטיבי של שברים גדולים מדי (>1,000 bp) וקטנים מדי או פריימרים PCR (<200 bp), בהתאם לריכוז של פוליאתילן גליקול ומלח של חרוזים פאראמגנטיים הוסיף.
  11. הוסף 200 μL (0.4 כרכים) של חרוזי מלאי לספרייה וערבב על ידי מערבולת. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
  12. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (ללא השברים הגדולים יותר) לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  13. רכז את החרוזים על ידי לקיחת 750 מיקרוליטר של חרוזי מלאי, הנח אותם בצינור 1.5 מ"ל על מגנט, המתן 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש את החרוזים על ידי ערבול 300 מיקרוליטר של חרוזי מלאי חדשים.
  14. הוסף 300 μL של חרוזים מרוכזים לדגימה (1 נפח) וערבב על ידי מערבולת. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומסירים את הסופרנאטנט (המכיל את השברים הקטנים יותר ואת פריימר ה-PCR).
  15. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. כדי לעשות זאת, מוסיפים את האתנול בזמן שהצינור עם החרוזים עדיין על המגנט, מנסה לא להפריע לחרוזים, ולחכות 30-60 שניות. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים.
  16. אפשרו לחרוזים להתייבש באוויר והשהו אותם מחדש ב-21 μL של חיץ TLE על ידי מערבולת.
    הערה: ייבוש יתר של החרוזים יכול להפחית את התשואה בעת פליטת הדנ"א. המטרה היא להשעות אותם מחדש בחיץ TLE מיד לאחר שהם כבר לא "מבריקים" מהאתנול.
  17. דגרו על הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמובלוק כדי להוציא את הספרייה מהחרוזים. מניחים את הצינור במגנט ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  18. כימות הגודל והריכוז באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית (ראה טבלת חומרים). ניתן לאחסן חומר Hi-C מטוהר ב -20 °C במשך מספר חודשים לפני שתמשיך עם הפרוטוקול.

10. לכידת ספרייה

  1. עבודה עם 500-1,000 ננוגרם של הספרייה. רכז את הספרייה על ידי ייבוש הדנ"א באמצעות רכז ואקום והשעיה מחדש של החומר ב -3.4 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  2. הוסף את החוסמים הבאים מערכת העשרת היעד (ראה טבלת חומרים) לדגימה: 2.5 μL של Blocker 1, 2.5 μL של Blocker 2 ו- 0.6 μL של חוסם אוליגו מותאם אישית עבור המתאמים.
  3. להשהות ביסודיות, להעביר את התמיסה לרצועת PCR 0.2 מ"ל, ולדגור thermocycler במשך 5 דקות ב 95 ° C, ואחריו 5 דקות ב 65 ° C עם מכסה מחומם. השאר את הצינור דוגר ב 65 ° C.
  4. הכינו את פתרון ההכלאה על ידי שילוב הריאגנטים הבאים מערכת העשרת המטרה (ראו טבלת חומרים) לכל דגימה (13 מיקרוליטר). יש לשמור על הספסל בטמפרטורת החדר: 6.63 μL של Hyb 1, 0.27 μL של Hyb 2, 2.65 μL של Hyb 3 ו-3.45 μL של Hyb 4.
  5. יש לדלל 0.5 מיקרוליטר של בלוק RNase מערכת העשרת המטרה ב-1.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לדגימה. הפשירו 5 μL של RNA biotinylated לכל דגימה על קרח והוסיפו לו את 2 μL של בלוק RNase מדולל. יש לשמור על הספסל בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף את 13 μL של תמיסת הכלאה ל 7 μL של RNA biotinylated עם RNase ומערבבים היטב.
  7. בעוד על thermocycler ב 65 ° C, להעביר את פתרון הכלאה עם RNA biotinylated (20 μL) לספרייה חסומה. סגור את מכסה הצינור בחוזקה ודגור בתרמוסייקלר למשך הלילה ב 65 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי למזער את אידוי הדגימות (שעלול להוביל להכלאה תת-אופטימלית של RNA-DNA) בעת ביצוע דגימות מרובות בו-זמנית, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את ה-RNA הביוטינילי לכל ספרייה בו-זמנית.

11. משיכת ביוטין והגברת PCR

  1. מעבירים 50 μL של חרוזי סטרפטאבידין T1 לכל דגימה לצינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, מניחים אותם על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, וממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר. הסר את supernatant, משאיר את החרוזים מאחור. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של חיץ הקשירה מערכת העשרת המטרה.
  2. השהה מחדש את החרוזים ב 200 μL של חיץ קשירה. בעוד על thermocycler ב 65 ° C, להעביר את הדגימה לחרוזי סטרפטאבידין T1 resuspended ולדגור במשך 30 דקות, מסתובב בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו את החרוזים עם 200 μL של חיץ כביסה 1 מערכת העשרת המטרה. דוגרים במשך 15 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 200 μL של חיץ כביסה 2 מערכת העשרה המטרה מחומם ל 65 ° C. יש לדגור במשך 10 דקות ב-65°C בתרמו-בלוק, תוך רעידות ב-300 סל"ד בין השטיפות.
  4. שטפו את החרוזים עם 200 μL של 1x restriction buffer 2 ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-30 μL של 1x restriction buffer 2.
  5. ערבבו את הריאגנטים הבאים כדי להכין את תגובת ה-PCR להגברת הספרייה: 30 μL חרוזים עם הספרייה, 150 μL של 2x PCR mastermix עם אנזים, 7.2 μL של פריימרים F + R (25 מיקרומטר כל אחד; ראו טבלה 2), ו-112.8 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  6. בצע את ה- PCR בתנאים הבאים (פצל את תערובת מגיב ה- PCR בתגובות של 50 μL): 98 ° C במשך 40 שניות, ואחריו ארבעה מחזורים של 98 ° C עבור 10 שניות, 65 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30 שניות, וסיים עם 72 ° C במשך 10 דקות. החזק בטמפרטורה של 4°C.
  7. אגרו את כל התגובות של 50 μL מאותה דגימה לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל, הניחו אותו על מגנט צינור של 1.5 מ"ל, והמתינו 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר.
  8. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה (300 μL) לצינור DNA חדש בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל. ממלא עם מאגר TLE ל 300 μL אם חלק supernatant אבד. חרוזי סטרפטאבידין T1 אינם נחוצים עוד.
  9. בצעו טיהור DNA באמצעות חרוזים פאראמגנטיים (0.9 נפחים; ראו טבלת חומרים). הוסף 270 μL של חרוזי מלאי למדגם וערבב על ידי מערבולת.
  10. דוגרים במשך 10 דקות, מסתובבים בטמפרטורת החדר.
  11. מניחים על מגנט, ממתינים 2-3 דקות או עד שכל החרוזים נדבקים לקיר, ומסירים את הסופרנטנט.
  12. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. כדי לעשות זאת, מוסיפים את האתנול בזמן שהצינור עם החרוזים עדיין על המגנט, מנסה לא להפריע לחרוזים, ולחכות 30-60 שניות. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים.
  13. אפשרו לחרוזים להתייבש באוויר והשהו אותם מחדש ב-21 μL של חיץ TLE על ידי מערבולת.
    הערה: ייבוש יתר של החרוזים יכול להפחית את התשואה בעת פליטת הדנ"א. המטרה היא להשעות אותם מחדש בחיץ TLE מיד לאחר שהם כבר לא "מבריקים" מהאתנול.
  14. דגרו על הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמובלוק כדי להוציא את הספרייה מהחרוזים.
  15. מניחים את הצינור במגנט ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הספרייה לצינור DNA חדש בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל.
  16. כמת את הגודל והריכוז באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C מציעה את האפשרות ליצור ספריות אינטראקטום מקדמי גנום באיכות גבוהה וברזולוציה רחבה עם מעט כמו 50,000 תאים53. הדבר מושג על ידי – מלבד הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ"א לאורך כל הפרוטוקול – הסרת צעדים מיותרים מהפרוטוקול המקורי, שבהם מתרחשים הפסדים חומריים משמעותיים. אלה כוללים את טיהור פנול לאחר decrosslinking, הסרת ביוטין, ולאחר מכן טיהור פנול-כלורופורם משקעים אתנול. חוץ מזה, ארגון מחדש של שלבי הכנת ספריית Hi-C (משיכת ביוטין, זנב A, קשירת מתאם, הגברת PCR ובח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעיןHi-C 57 ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-C, ביוטין מוסר ממקטעי הגבלה שאינם קשורים כדי למנוע משיכת מקטעי DNA שלאחר מכן אינם אינפורמטיביים. דילוג על החלק הזה וטיהור הדנ"א שבא בעקבותיו אינו מתורגם לירידה משמעותית באחוז הקריאות החוקיות (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לשאר החברים ממעבדת Javierre על המשוב שלהם על כתב היד. אנו מודים לתוכנית CERCA, Generalitat de Catalunya ולקרן Josep Carreras על התמיכה המוסדית. עבודה זו מומנה על ידי פדר / משרד המדע והחדשנות הספרדי (RTI2018-094788-A-I00), האגודה ההמטולוגית האירופית (4823998) והאגודה הספרדית נגד סרטן (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ ממומן על ידי פרויקט Junior Leader של קרן הבנקאות La Caixa (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR ממומן על ידי מלגת AGAUR FI (2019FI-B00017), ו- LT-D ממומן על ידי מלגת FPI (PRE2019-088005). אנו מודים לתוכנית הדוקטורט בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית מהאוניברסיטה האוטונומית של ברצלונה על תמיכתה. אף אחד מהמממנים לא היה מעורב בשום שלב בעיצוב הניסוי או בכתיבת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4 מ"מ ביוטין-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 מ' EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002Sמוזכר כמאגר הגבלה 2 בכתב היד
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase מאגר תגובהניו אינגלנד BiolabsB0202S
16% תמיסת פורמלדהיד (w/v), ללא מתנולThermo Scientific28908
20 מ"ג/מ"ל סרום בקר אלבומיןניו אינגלנד BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock ג'ל צינורות אורQiuantabio2302820<חזק>לטיהור פנול-כלורופורם בסעיף 4 (טיהור DNA). צינורות ג'ל Phase Lock הם סוג מסחרי של צינורות שתוכננו במיוחד כדי למקסם את התאוששות ה-DNA לאחר טיהור פנול-כלורופורם תוך הימנעות מהעברת מזהמים בשלב האורגני על ידי הכילים שרף בצפיפות ביניים המתיישב בין השלב האורגני לשלב המימי ומבודד אותם. יש לסובב צינורות PLG ב-12,000 x גרם למשך 30 שניות לפני השימוש כדי להבטיח שהשרף ממוקם היטב בתחתית הצינור
מתאמים ופריימרים PCR להגברת הספרייהטכנולוגיות DNA משולבות-נקנו כפריימרים בודדים עם טיהור PAGE עבור
מגרדי תאיםNunc179693או כל
צנטריפוגה של מותג אחר (רוטור זווית קבועה לצינורות 1.5 מ"ל)כל מותג
חבילת CHiCAGO R1.14.0
חרוזי CleanNGSCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123Aאו כל צינור DNA LoBind של מותג אחר
, 1.5 מ"לצינור Eppendorf30108051
DNA LoBind, 2 מ"לEppendorf30108078
DNA פולימראז I גדול (Klenow) שבר 5000 יחידות/מ"לניו אינגלנד BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 חרוזיםInvitrogen65002למשיכת ביוטין של הספרייה שנלכדה מראש בסעיף 8 (נפתח ביוטין)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 חרוזיםInvitrogen65602<חזק>למשיכת ביוטין של הספרייה שלאחר הלכידה בסעיף 11 (נפתח ביוטין והגברת PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321Dאו כל מגנט אחר המתאים לצינור 1.5 מ"ל
אתנול מוחלטVWR20821.321
FBS, מוסמךGibco10270-106או כל מותג אחר
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515משמש להעתקת DNA בסעיף 4 (טיהור DNA)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ Lניו אינגלנד BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 יחידות/מ"לניו אינגלנד BiolabsM0212L
טיפים למסננים בעלי שימור נמוך ( 10 ומיקרו; L, 20 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L ו-1000 ומיקרו; L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 ממוקד אולטרסאונד500295
Micro TUBE AFA סיבים מכסה הצמד מקדים 6 x 16 מ"מ בקבוקוניםCovaris520045<חזק>לסוניקציה בקטע 6 (סוניקציה)
NheI-HF, 100 U/µ Lניו אינגלנד BiolabsR3131M
ביולוגיה מולקולרית ללא נוקלאז מים בדרגתסיגמא-אולדריץ'W4502
PCR פריימרים לבקרת איכותטכנולוגיות DNAמשולבות-רצועות
PCR  וכובעיםAgilent Technologies410022, 401425
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25:24:1, רווי ב-10 מ"מ Tris, pH 8.0, 1 מ"מ EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה עם מאגר HFניו אינגלנד BiolabsM0531L<חזק>להגברה של הספרייה בסעיפים 9 (זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR)
<חזק>ו-11 (משיכת ביוטין והגברת PCR)
קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA)Roche11873580001
Proteinase K, רקומביננטי, ערכתרגישות גבוהה Roche3115836001
Qubit 1x dsDNA בדרגת PCRInvitrogenQ33230לכימות DNA לאחר משקעים בסעיף 4 (טיהור DNA)
צינורות בדיקת QubitInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferניו אינגלנד BiolabsB6004S
RPMI בינוני 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010או כל מותג אחר
SDS - פתרון 10% לביולוגיה מולקולריתPanReac AppliChemA0676
נתרן אצטט pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect מותאם אישית 3-5.9 Mb ספרייהAgilent Technologies5190-4831מערכת לכידת עכבר או אדם בעיצוב מותאם אישית, המשמשת ללכידה
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645משמש ללכידה
SureSelect ערכת העשרת יעד ILM PE מתאם מלאAgilent Technologies931107<חזק>משמש ללכידה
T4 DNA ליגאז 1 U/µ LInvitrogen15224025<חזק>לקשירה בסעיף 3 (קשירה וקרוסלינק)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202Tלקשירה בסעיף 9 (זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR)
T4 DNA פולימראז 3000 יחידות/מ"לניו אינגלנד ביולאבסM0203L
T4 PNK 10000 יחידות/מ"למכשיר New England BiolabsM0201L
Tapestation 4200Agilent Technologiesלאלקטרופורזה אוטומטית בסעיף 9 (זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR) <חזק>ו
סעיף 11 (משיכת ביוטין והגברת PCR). כל מערכת אלקטרופורזה אוטומטית אחרת תקפה
ריאגנטים של TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, <חזק>לאלקטרופורזה אוטומטית בסעיף 9 (זנב dATP, קשירת מתאם והגברת PCR) <חזק>ו
סעיף 11 (משיכת ביוטין והגברת PCR). כל מערכת אלקטרופורזה אוטומטית אחרת תקפה
Triton X-100 לביולוגיה מולקולריתPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
NGS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16(2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384(2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610(2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161(2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121(2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222(2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923(2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165(2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526(2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154(2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615(2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81(2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268(2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923(2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86(2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310(2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175(2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127(2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859(2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924(2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938(2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Promoter Capture Hi CLow Input Capture Hi CDNA

מאמרים קשורים