Method Article

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

DOI:

10.3791/65323

⸱

July 14th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת ניתוח זרימה פלואורסצנטית דו-ערוצית בעלת שלושה ערוצים שימשה לפיתוח מערכת חיסון מרובת חרוזים המבצעת בו זמנית דגימות סרום עבור IgG ו- IgM שהופקו כנגד אנטיגנים מרובים של מיני בורליה שונים הגורמים לבורליוזיס ליים באירופה ובצפון אמריקה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לעקוב אחר התקדמות מחלות זיהומיות, כדאי להעריך תגובתיות חיסונית כנגד גורמים אנטיגניים שונים, ולמדוד איזוטיפים שונים של נוגדנים מכיוון שהם מופיעים בשלבים שונים של התגובה החיסונית של המארח. עם ליים borreliosis, סוכן פתוגני יכול להיות אחד החברים המרובים של המין Borrelia . לכן, סיווג דגימה נכון דורש הערכת תגובתיות חיסונית כנגד אנטיגנים שונים של מיני בורליה שונים. בנוסף, תגובות נוגדות פתוגן IgG ו- IgM יכולות להיות בעלות מסלולי זמן אליציטוט שונים במהלך התקדמות המחלה. כאן אנו מדגימים את הפיתוח של בדיקה חיסונית מרובת שני כתבים שיש לה תועלת בזיהוי תגובה חיסונית ספציפית לבורליה בדגימות נסיוב אנושי על ידי הערכה בו זמנית של תגובתיות חיסונית מסוג IgG ו- IgM כנגד אנטיגנים חיידקיים שונים באותה תגובה היטב. גישה זו של דיווח כפול שומרת על הביצועים האנליטיים של שיטות דיווח יחיד תוך חיסכון בזמן ובמשאבים והפחתת דרישות גודל המדגם. בדיקה זו מאפשרת למעשה להכפיל את המידע הסרולוגי שנוצר מדגימת דם במחצית הזמן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליים בורליוזיס היא המחלה הזיהומית הנפוצה ביותר המועברת על ידי קרציות באקלים מתון של חצי הכדור הצפוני1. זה נגרם על ידי חיידקי spirochete של הסוג Borrelia, עם חמישה פתוגנים אנושיים ידועים המשתנים בתפוצה גיאוגרפית2. מיני הבורליה הפתוגניים העיקריים באירופה הם B. afzelii ו-B. garinii, כאשר B. burgdorferi s.s., B. spielmanii ו-B. bavariensis מעורבים בתדירות נמוכה יותר. בצפון אמריקה, B. burgdorferi s.s. הוא הגורם הסיבתי היחיד של ליים borreliosis 2,3. פתוגנים של Borrelia מועברים על ידי חברי סוג הקרציות Ixodes, כאשר ההעברה יכולה להתרחש תוך 24 שעות מעקיצת הקרצייה4.

אבחון ליים בורליוזיס נעשה בדרך כלל על ידי סימפטומים קליניים ולאחר מכן אושר על ידי סרולוגיה. הן באירופה והן בצפון אמריקה, הנחיות האבחון ממליצות על סדרת בדיקות דו-שלבית המורכבת מבדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) עם אימונובלוט רפלקס להערכת תגובת נוגדנים כנגד אנטיגנים ספציפיים של Borrelia 1,5,6,7,8,9 . עם זאת, גישה זו חסרה רגישות והיא תת-אופטימלית, במיוחד בשלב המוקדם של ההדבקה כאשר המרת סרוקונפורמציה עשויה להיות חלקית וטיטרים נגד Borrelia IgG ו- IgM נמוכים מדי6.

בדיקות חיסוניות מולטיפלקס משפרות את הבדיקות החיסוניות המסורתיות המודדות רק מטרה אחת בכל פעם, ויכולות להעריך בו זמנית תגובות איזוטיפ נוגדנים מרובות כנגד אנטיגן אחד או יותר 10,11,12. בדיקות כגון ELISAs מוגבלות לזיהוי וכימות של אנליט יחיד לכל תגובה, במקרה הנוכחי או IgG במחזור או IgM המושרה כנגד אנטיגן חיידקי יחיד לאחר הדבקה בבורליה. דו"ח זה מדגים שימוש בטכנולוגיית פרופיל אנליטי מבוססת חרוזים לפיתוח בדיקה חיסונית מרובת משתתפים המזהה בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM כנגד כל אחד מהאנטיגנים של Borrelia שנבחרו כאן בדגימות סרום אנושיות. בחרנו ארבעה אנטיגנים המכסים יחד את מיני הבורליה הפתוגניים הנפוצים ביותר שמקורם באירופה (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) וצפון אמריקה (B. burgdorferi s.s.) (טבלה 1) 2,3. זה מאפשר זיהוי פתוגן מכריע ואת היכולת להבחין IgM מוקדם מאוחר יותר, עמיד יותר, IgG immunoreactivity בדגימות החולים.

איזוטיפ יעדערוץ הכתביםאנטיגןמיני בורליהזןריכוז צימוד אנטיגן
IgMPEOspCב. גאריני200475.0 מיקרוגרם/106 חרוזים
IgGBV421VlsEB. burgdorferi סB311.25 מיקרוגרם/106 חרוזים
IgGBV421DbpAB. burgdorferi סZS710.0 מיקרוגרם/106 חרוזים
IgGBV421DbpAב. אפזליפ.ק.וו5.0 מיקרוגרם/106 חרוזים

טבלה 1: אנטיגנים מייצגים של Borrelia המשמשים לפיתוח בדיקות מולטיפלקס.

בתחילה פיתחנו בדיקה חיסונית חד-מדווחת שזיהתה נוגדנים נגד אנטיגן Borrelia IgG או IgM בשתי תגובות נפרדות, ולאחר מכן מיזגנו את הבדיקות הללו לבדיקת מולטיפלקס דו-מדווחת המודדת את שני איזוטיפים של נוגדנים באותה תערובת תגובה. חרוזים מגנטיים מצומדים לאנטיגן מטרה פתוגן של עניין, ולאחר מכן מודגרים עם דגימות סרום המטופל. האנטיגן המצומד לחרוזים מזוהה על ידי, ולוכד, הן IgG במחזור והן IgM בסרום שנוצר בתגובה חיסונית נגד האנטיגן הפתוגן. בדיקת IgG לעומת ספציפיות IgM נקבעת על ידי בחירת נוגדן משני הנקשר ל- IgG או IgM, כל אחד עם אות פלואורופור ייחודי הקשור לשני הנוגדנים המשניים. כל אות פלואורסצנטי מזוהה באחד משני ערוצי הכתב של המכשיר (כלומר, דיווח כפול) שיש לו לייזר עירור שונה ולכידת פליטה ספציפית לפלואורופור היחיד המשמש לזיהוי IgG או IgM (כאן Brilliant Violet 421 או phycoerythrin, בהתאמה). ערוץ סיווג המכשירים מזהה את הצבע המקודד בצבע הטבוע במערכות חרוזים שונות. לפיכך, ניתן להצמיד אנטיגני מטרה מרובים לחרוזים צבועים באופן שונה, וערכות החרוזים מעורבבות יחד ומשמשות להערכה מקיפה של תגובתיות חיסונית אנטי-פתוגנית מגוונת בדגימות בסרום. ערוץ הסיווג מזהה כל קבוצת חרוזים בודדת (כלומר, אנטיגן ספציפי) ומודד את הפלואורסצנטיות הקשורה ל- IgG או IgM כנגד אנטיגן זה. בדיקת המולטיפלקס המתקבלת חוסכת זמן ומשאבים לעומת בדיקות קלאסיות פחות מקיפות ומקטלגת במדויק את תגובתיות החיסון של ליים בנפחי דגימה מוגבלים. בעוד שגישה דומה של דיווח כפול שימשה בעבר לסיווג תגובות חיסוניות בפתולוגיות אחרות כגון זיהום SARS-CoV-213, דו"ח זה מפרט את היישום של טכנולוגיית בדיקה פלואורסצנטית מרובת משתתפים לאפיון תגובתיות חיסונית בבורליוזיס ליים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקבל אישור מתאים של ועדת ביקורת מוסדית/ועדת אתיקה לשימוש בדגימות נסיוב אנושי בסדרת ניסויים זו. הדגימות היו חומרים שיוריים אנונימיים ממחקר לאומי גרמני על שכיחות SARS-CoV-214. האישור לשימוש בדגימות אנושיות ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה של האנובר, גרמניה (9086_BO_S_2020). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בסך הכל ב-21 דגימות נסיוב אנושי.

1. אישור אתי לשימוש בדגימות אנושיות

  1. להשיג אישורים אתיים מתאימים לשימוש בדגימות אנושיות.

2. ריאגנטים וציוד

  1. דגימות סרום אנושי: בצע אימות בדיקה טכנית ובקרת איכות באמצעות דגימות סרום מאנשים שאובחנו בעבר עם בורליוזיס ליים או ממצב חיסוני שלילי של Borrelia 12,14.
  2. מכשור לכתב יחיד. השתמש בכלי דו-ערוצי של כתב יחיד (Table of Materials) לפיתוח הבדיקה הראשונית ולאימות הטכני.
    הערה: למערכת המדווח היחיד יש שני לייזרים: 1) מזהה ומכמתת פלואורסצנטיות ספציפית לערכת חרוזים כדי להבחין בין קבוצות חרוזים שונות, אם נעשה בהן שימוש (ערוץ סיווג), ו-2) מזהה ומכמתת פלואורסצנטיות של פיקואריתרין ספציפי למטרה (PE) (ערוץ כתב; עירור 532 ננומטר, פליטה "כתומה" של 565-585 ננומטר). לפיכך, רק סוג איזוטיפ נוגדנים יחיד (למשל, IgG או IgM) ניתן לנתח בו זמנית באמצעות ערוץ Reporter יחיד.
    1. בצע מחקרי אימות ראשוניים כדי להעריך אנטי-Borrelia IgG ו- IgM בנפרד, בפורמט של דיווח יחיד 96-well המשתמש בריאגנטים לזיהוי עם תווית PE עבור שתי קבוצות הנוגדנים.
      הערה: הבדיקה הנוכחית מעריכה IgGs במחזור ספציפי עבור אנטיגן Borrelia VlsE ושתי גרסאות של DbpA, ובמחזור IgM ספציפי עבור אנטיגן OspC, כדוגמאות מייצגות. ניתן להרחיב את הבדיקה כדי להעריך תגובתיות חיסונית בסרום כנגד אנטיגנים אנטי-בורליה אחרים, לפי הצורך12.
  3. מכשור לכתב כפול. השתמש בכלי דיווח כפול תלת-ערוצי (Table of Materials) המאפשר ניתוח IgG/IgM במקביל באותה תגובה, לצורך פיתוח ותיקוף טכני של בדיקת IgM/IgG כפולה (מפורט להלן). למכשיר זה יש 3 ערוצי גילוי פלואורסצנטיים בסך הכל, מתוכם 2 ערוצי כתב המעריכים אותות ממוקדים הקשורים ל- Ig.
    הערה: מערכת הדיווח הכפול כוללת שלושה לייזרים: 1) מזהה ומכמתת פלואורסצנטיות ספציפית לערכת חרוזים (ערוץ סיווג); 2) מזהה ומכמת פלואורסצנטיות ספציפית למטרה של פיקואריתרין (PE) (כתב ערוץ 1; עירור 532 ננומטר, פליטה "כתומה" של 565-585 ננומטר), ו-3) מעריך פלואורסצנטיות ספציפית למטרה Brilliant Violet 421 (BV421) של אנליטת מטרה שנייה (כתב ערוץ 2; עירור 405 ננומטר, פליטה "כחולה" 421-441 ננומטר). מערכת הדיווח הכפול תואמת הן לתבניות בדיקת לוח מיקרוטיטר 96 באר והן לפורמט בדיקת 384 בארות (טיפול חצי אוטומטי). סכמת הבדיקה הכללית מוצגת באיור 1. שלבי הפרוטוקול מפורטים להלן.

3. צימוד אנטיגן

  1. חברו את האנטיגנים של Borrelia למיקרוספרות (חרוזים) מגנטיות, קרבוקסיליות ופלואורסצנטיות המקודדות בצבע 6.5 מיקרומטר; טבלת חומרים) באמצעות כימיה 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/sulfo-N-hydroxysuccinimide (sNHS).
    הערה: תיאור מפורט ניתן למצוא בהפניה11ובהפניה12. מצא את ריכוז הצימוד של כל אנטיגן בטבלה 1. יש לאחסן חרוזים מצומדים בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. כל המאגרים המשמשים בתגובות צימוד וזיהוי מפורטים בחומרים המשלימים.

4. הליך בדיקה: מדווח יחיד IgG או IgM בדיקה סרולוגית: פורמט 96-well

  1. לדלל את הדגימה בשני שלבים (2 שלבים, שניהם בלוחות 96 בארות; דילול דגימת סרום פי 200 במאגר בדיקה).
    הערה: הרכב חיץ הבדיקה הוא תערובת 1:4 של חיץ צלב נמוך: PBS המכיל 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר. Tween-20 מתווסף לתערובת לריכוז סופי של 0.05% (v/v).
    1. שלב 1 של דילול הדגימה: יש לערבב 5 μL של דגימת הסרום עם 120 μL של מאגר הבדיקה (דילול פי 25).
    2. שלב 2 של דילול הדגימה: דללו את דילול הדגימה פי 25 פי 8 על ידי ערבוב של 10 מיקרוליטר של הדילול עם 70 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה כדי להפוך את דילול הדגימה הסופי פי 200.
  2. דילול תערובת חרוזים מגנטית
    1. הכינו תערובת חרוזים המכילה 1.0 × 106 חרוזים/מ"ל לכל אוכלוסיית חרוזים (כלומר, לכל אנטיגן מטרה ייחודי).
    2. דללו את תערובת החרוזים המוכנה פי 25 במאגר הבדיקה כדי שריכוז החרוזים הסופי בתרחיף מדולל זה הוא כעת 4 × 104 חרוזים / מ"ל לכל אוכלוסיית חרוזים (כלומר, לכל אנטיגן מטרה ייחודי).
  3. דגירה מדגם בסרום עם חרוזים
    1. פיפטה 25 μL של תרחיף חרוזים מצומד מדולל (המכיל 4.0 × 104 חרוזים / סט / מ"ל) לתוך בארות מוקצות של צלחת מיקרוטיטר 96 באר חצי שטח (טבלה של חומרים).
    2. הוסף 25 μL של דגימת סרום מדוללת פי 200 (משלב 4.1 לעיל) לבארות מתאימות המכילות 25 μL של תרחיף חרוזים מצומד.
      הערה: זה מייצר דילול נוסף של פי 2, כך שדילול דגימת הסרום הסופית בבאר הוא פי 400 וספירת החרוזים הסופית היא 1000 חרוזים/סט חרוזים/תגובת 50-μL.
    3. כסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות באטם מיקרו-פלטה (רדיד אלומיניום או כיסויי צלחת פלסטיק).
    4. דגירה על צלחת במשך שעתיים ב-20°C, ב-750 סל"ד על שייקר צלחת.
  4. שטיפת חרוזים
    1. הסירו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו בזהירות את אטם הצלחת הדבק.
    2. הכניסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למכונת כביסה.
    3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ כביסה 100 μL (1× PBS + 0.05% v/v Tween 20) באמצעות מכונת הכביסה האוטומטית ללוחות מגנטיים.
  5. יש להשהות מחדש חרוזים שטופים ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה, לכסות את הצלחת בנייר כסף דביק או בכיסוי צלחת פלסטיק, ולנער את הצלחת על שייקר צלחות למשך דקה אחת ב-20°C ב-1000 סל"ד.
  6. לפצל את החרוזים השטופים
    1. הסירו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו בזהירות את אטם הצלחת הדבק.
    2. ערבבו תגובות על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים והעבירו 50 μL מכל נפח תגובה של 100 μL לכל אחד משני לוחות תגובה חדשים בעלי 96 בארות, צלחת אחת לזיהוי IgG וצלחת אחת לזיהוי IgM.
  7. זיהוי דגירה של נוגדנים/מגיבים
    הערה: בשלב זה, חרוזי מטרה מצומדים לאנטיגן הודגרו עם דגימות סרום כדי לחלץ נוגדנים במחזור בסרום (אם קיימים) המגיבים עם האנטיגן(ים). חרוזים מגיבים עם אימונוגלובולין קשור חולקו לשני לוחות, ו- IgG ו- IgM מזוהים כעת ומכומתים בלוחות הנפרדים שלהם באמצעות נוגדנים משניים ספציפיים לאיזוטיפ עם תווית PE. טיפול בצלחת מתנדנדת ב -20 דקות.
    1. שאפו את הסופרנאטנט מהבארות המכילות חרוזים מגנטיים באמצעות מכונת הכביסה של הלוח המגנטי.
    2. עבור כל צלחת, הכינו את תערובת מגיב זיהוי Ig המתאימה (אנטי-IgG או אנטי-IgM), המכילה IgG אנטי-אנושי של עז מצומדת PE (3 מיקרוגרם / מ"ל) או חמור מצומד PE IgM אנטי אנושי (5 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר הבדיקה. עבור כל באר המכילה חרוזים, 30 μL של מגיב זיהוי משמש. הכן מספיק נפחי מגיב IgG ו- IgM לגילוי בארות תגובה, עם תוספת מספקת כדי להכיל הפסדי צנרת.
    3. פיפטה 30 μL של מגיב זיהוי IgG לתוך כל באר המכילה חרוזים מגיבים על צלחת IgG ולכסות את צלחת התגובה 96 באר עם חותם microplate.
    4. פיפטה 30 μL של מגיב זיהוי IgM לתוך כל באר המכילה חרוזים מגיבים על צלחת IgM ולכסות את צלחת התגובה 96 באר עם חותם microplate.
    5. יש לדגור במשך 45 דקות ב-20°C תוך כדי ניעור ב-750 סל"ד על שייקר צלחת.
  8. שטיפת חרוזים
    1. הסירו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו בזהירות את אטם הצלחת הדבק.
    2. הכניסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למכונת כביסה מגנטית.
    3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ כביסה של 100 μL באמצעות מכונת הכביסה בעלת הצלחת המגנטית.
  9. להשהות חרוזים ב 100 μL של חיץ כביסה.
  10. נתח את התוצאות במכשיר הכתב היחיד.
    1. כסו את צלחת התגובה בת 96 הבארות באטם מיקרו-לוחית.
    2. נערו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למשך 3 דקות ב-20°C, ב-1,000 סל"ד על שייקר צלחת.
    3. מעבירים את לוחית התגובה בעלת 96 הקידוחים משייקר הצלחת ומכניסים למכשיר מנתח זרימה של כתב יחיד (Table of Materials).
    4. עבור כל דגימה, נתח את העוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI) באמצעות הגדרות המכשיר הבאות: נפח ספיגה = 80 μL, ספירה = 50/אוכלוסיית חרוזים, פסק זמן = 60 שניות, Gating = 7,500-15,000)12,13.

5. נוהל בדיקה: דיווח כפול IgG ובדיקה סרולוגית IgM: פורמט 96-well

  1. דילול דגימה (2 שלבים, שניהם בצלחות 96 באר; דילול דגימת סרום פי 200 במאגר בדיקה)
    1. שלב 1 של דילול הדגימה: יש לערבב דגימת סרום של 5 μL עם מאגר בדיקה של 120 μL (דילול פי 25).
    2. שלב 2 של דילול הדגימה: דללו את דילול הדגימה פי 25 פי 8 נוספים על ידי ערבוב 10 מיקרוליטר של הדילול הראשון (דגימה מדוללת פי 25 מסעיף 5.1.1) עם מאגר בדיקה של 70 מיקרוליטר (דילול פי 8), כדי לקבל דילול דגימה סופי עד פי 200.
  2. דילול תערובת חרוזים מגנטית
    1. הכינו תערובת חרוזים המכילה 1.0 × 106 חרוזי מטרה מצומדים לאנטיגן/מ"ל לכל אוכלוסיית חרוזים (כלומר, לכל אנטיגן מטרה ייחודי).
      הערה: בסדרת ניסויים זו, הערכנו הן את תגובתיות החיסון IgG והן את תגובתיות IgM כנגד ארבעה אנטיגנים ייחודיים של Borrelia בכל תגובה.
    2. מדללים את תערובת החרוזים המוכנה פי 50 במאגר המבחן. ריכוז החרוזים בתרחיף מדולל זה הוא כעת 2.0 × 104 חרוזים / מ"ל לכל אוכלוסיית חרוזים.
      הערה: מספר החרוזים בתגובת הבדיקה הדו-צדדית נחתך בחצי מזה ששימש בתגובת המדווח היחיד כדי לאפשר השוואה ישירה בין שתי הבדיקות ולחסוך במשאבים, לאחר שמחקרים ראשוניים אישרו כי האות הפלואורסצנטי נשמר בטווח הליניארי של הכימות בעת שימוש במחצית ממספר החרוזים.
  3. דגירה מדגם בסרום עם חרוזים
    1. פיפטה 25 μL של תרחיף חרוזים מצומד אנטיגן מטרה מדולל (המכיל 2.0 × 104 חרוזים / סט / מ"ל) לתוך בארות שהוקצו מראש של צלחת מיקרוטיטר 96 באר חצי שטח. המספר המדויק של בארות התגובה ומיקומם על הצלחת תלויים במספר הכולל של הדגימות שנבדקו על ידי המפעיל והאם יופעלו בארות בודדות או משוכפלות בכל דגימה.
      הערה: חרוזי המטרה המגנטיים המצומדים לאנטיגן יגיבו עם דגימות נסיוב אנושי. גם IgG חיסוני אנטי-בורליה אנטיגן וגם IgM, אם קיימים בדגימות, ייקשרו ויהיו משותקים על אותם חרוזים מצומדים לאנטיגן. לאחר מכן יבוצע כימות נוגדנים משני של IgG ו-IgM קשורים על אותם חרוזים באותן תגובות, תוך שימוש בפלואורופורים שונים לזיהוי IgG ו-IgM המאפשר את התמוינותם.
    2. הוסף 25 μL של סרום מדולל פי 200 (משלב 5.1 לעיל) לכל באר המכילה 25 μL של תרחיף חרוזים מצומד אנטיגן מטרה מעורב (שלב 5.2).
      הערה: זה מייצר דילול נוסף של פי 2, כך שדילול דגימת הסרום הסופית בבאר הוא פי 400, וספירת החרוזים הסופית היא 500 חרוזים/סט חרוזים/תגובת 50 מיקרוליטר.
    3. כסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות באטם מיקרו-צלחת (רדיד אלומיניום או כיסוי צלחת פלסטיק).
    4. לדגור צלחת עם חרוזים במשך 2 שעות ב 20 ° C, ב 750 סל"ד על שייקר צלחת.
  4. שטיפת חרוזים (להסרת דוגמית עודפת בסרום)
    1. הסירו את לוחית התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו את אטם הצלחת הדבק.
    2. הכניסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למכונת כביסה מגנטית.
    3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ כביסה של 100 μL באמצעות מכונת הכביסה בעלת הצלחת המגנטית.
  5. יש לשאוף לנפח כביסה סופי מחרוזים לאחר שלב הכביסה האחרון.
  6. גילוי נוגדנים (אינקובציה - חלק I)
    1. הכינו מגיב זיהוי כפול מסוג IgG ו-IgM טרי המכיל IgG אנטי-אנושי של עז ביוטינילציה (1 מיקרוגרם/מ"ל) יחד עם חמור מצומד PE אנטי-אנושי IgM (5 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר בדיקה. עבור כל באר המכילה חרוזים, 30 μL של מגיב זיהוי כפול משמש. הכינו מספיק נפחי מגיב גילוי כפול מסוג IgG ו-IgM עבור בארות תגובה, עם תוספת מספקת כדי להכיל הפסדי צנרת.
    2. פיפטה 30 μL של מגיב זיהוי כפול IgG ו- IgM לתוך כל באר שהוקצתה ולכסות את צלחת התגובה 96 באר עם חותם microplate.
    3. יש לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב-20°C תוך כדי ניעור ב-750 סל"ד על שייקר צלחת.
  7. שטיפת חרוזים (להסרת נוגדנים לגילוי עודפים)
    1. הסירו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו בזהירות את אטם הצלחת הדבק.
    2. הכניסו את לוחית התגובה בעלת 96 הבארות למכונת כביסה אוטומטית ללוחות מגנטיים.
    3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ כביסה של 100 μL באמצעות מכונת הכביסה המגנטית האוטומטית.
  8. יש לשאוף לנפח כביסה סופי מחרוזים לאחר שלב הכביסה האחרון.
  9. כתב מצומד סטרפטווידין (אינקובציה - חלק ב')
    1. יש לדלל סטרפטווידין טרי עם תווית BV421 במאגר הבדיקה לריכוז של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל. עבור כל באר המכילה חרוזים, 30 μL של Streptavidin המסומן BV421 משמש. הכינו נפח סטרפטווידין מספיק BV421 עבור בארות תגובה, עם תוספת מספקת כדי להכיל הפסדי צנרת.
    2. פיפטה 30 μL של BV421-Streptavidin מדולל לתוך כל תגובה היטב לכסות את צלחת התגובה 96well עם חותם microplate.
    3. יש לדגור על הצלחת למשך 30 דקות ב-20°C תוך כדי ניעור ב-750 סל"ד על שייקר צלחת.
  10. לשטוף חרוזים (כדי להסיר עודף BV421-Streptavidin)
    1. הסירו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות משייקר הצלחת והסירו בזהירות את אטם הצלחת הדבק.
    2. הכניסו את צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למכונת הכביסה של הפלטה המגנטית.
    3. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ כביסה של 100 μL באמצעות מכונת הכביסה המגנטית האוטומטית.
  11. יש להשהות חרוזים בתוך בארות לנפח סופי של 100 μL בחיץ שטיפה.
  12. ניתוח התוצאות במכשיר הדיווח הכפול
    1. כסו את צלחת התגובה בת 96 הבארות באטם מיקרו-לוחית.
    2. דגרו על צלחת התגובה בעלת 96 הבארות למשך 3 דקות ב-20°C, ב-1000 סל"ד על שייקר צלחת.
    3. העבירו את לוחית התגובה בעלת 96 הקידוחים משייקר הצלחת למכשיר ניתוח הזרימה בעל הדיווח הכפול (Table of Materials).
    4. הערכת עוצמת הפלואורסצנט החציונית של הדגימה (MFI) בהתאם להוראות היצרן (הגדרות מכשיר: מצב דיווח כפול, נפח ספיגה = 80 μL, ספירה = 50/אוכלוסיית חרוזים, פסק זמן = 60 שניות, Gating = 7,500-15,000).

6. כתב כפול IgG ומבחן סרולוגי IgM: פורמט חצי אוטומטי 384 באר

  1. בצע את בדיקת הכתב הכפול בפורמט צלחת 384 בארות באמצעות שלבי הבדיקה המפורטים בסעיף 5, אך עבד דגימות באמצעות רובוט פיפטינג ומכונת כביסה אוטומטית של לוחות מגנטיים (טבלה של חומרים). בפורמט 384 בארות, נערו את הצלחות במהלך הדגירות והשטיפות ב-1450 סל"ד, ולפני מדידת הפלואורסצנטיות נערו את הצלחת במשך 5 דקות ב-21°C וב-1800 סל"ד.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה ניסיונית
התוכניות הכלליות של מבחני Borrelia מבוססי חרוזים של כתב יחיד ודיווח כפול מוצגות באיור 1. עבור מטרות נוגדנים בודדות (כלומר, IgG או IgM) שנוצרו כנגד אנטיגן Borrelia נתון, שתי קבוצות הנוגדנים הוערכו באופן עצמאי בדגימות נסיוב אנושי באמצעות נוגדן אנטי-איזוטיפ מצומד PE לדיווח. עבור בדיקת המדווח הכפול עם ניתוח סימולטני של תגובתיות חיסונית IgG ו- IgM, זיהוי IgG ספציפי לאנטיגן Borrelia השתמש במערכת כתב IgG + BV421-labeled Streptavidin (פלואורסצנטיות כחולה) אנטי-אנושית ביוטינילציה, תוך שמירה על כתב מצומד PE (פלואורסצנטיות כתומה) לזיהוי IgM. זרימת העבודה של בדיקת המדווח הכפול דומה לבדיקת המדווח היחיד, למעט דגירה נוספת של מערכת זיהוי של 30 דקות עם מגיב זיהוי פלואורסצנטי בערוץ השני BV421-Streptavidin.

figure-results-1
איור 1: סכמטיות של מבחני Borrelia מבוססי חרוזים של כתב יחיד ודיווח כפול. (A) מכשיר הדיווח היחיד שימש לפיתוח ולאימות ראשוני של הבדיקה מבוססת החרוזים שאפיינה את IgG או IgM נגד בורליה בנפרד, שניהם באמצעות תווית כתב פלואורסצנטי של פיקואריתריטין (PE) הפולטת אות בספקטרום "כתום". ניתן להצמיד כל אנטיגן בורליה רצוי לחרוזים ולהשתמש בו כדי ללכוד ולכמת IgG או IgM הנמצאים בדגימות בסרום. יש צורך בשתי בדיקות חיסוניות נפרדות כדי להעריך הן תגובתיות IgG והן תגובתיות IgM כנגד אנטיגן נתון. (B) מערכת הדיווח הכפול אפשרה ניתוח סימולטני של דגימות סרום עבור נוגדני IgG ו- IgM כנגד כל אנטיגן Borrelia בודד באותה באר. גישה זו משתמשת באותו נוגדן זיהוי מצומד PE כדי להתמקד ב- IgM אנטי-בורליה , אך מחליפה את זיהוי IgG ממערכת מבוססת PE לשימוש בנוגדן זיהוי ראשוני ביוטינילציה וסטרפטאווידין המסומן BV421 (פולט "כחול") הזקוק לשלב דגירה נוסף של מערכת הזיהוי של 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיוק תוך בדיקה
ניתוח מתאם ספירמן עבור שלושה אנטיגנים מייצגים של Borrelia (איור 2) הדגים יכולת שחזור אחידה של ערכי MFI בעת זיהוי נוגדנים נגד Borrelia הנמצאים בסרליה אנושית.

figure-results-2
איור 2: דיוק תוך-מבחני של בדיקת Borrelia מבוססת חרוזים דו-מדווחת. ניתוח המתאם של ספירמן הראה דיוק תוך-מדווח גבוה של בדיקת הדיווח הכפול כאשר מערכת זיהוי PE שימשה לזיהוי נוגדני IgM ספציפיים לבורליה (A) ומערכת זיהוי BV421 שימשה לזיהוי נוגדני IgG ספציפיים לבורליה (B, C). בסך הכל נותחו 21 דגימות סרום בכפילויות באמצעות הליך חצי אוטומטי. בכל גרף, אותות MFI שורטטו זה כנגד זה ונותחו על ידי רגרסיה ליניארית. עקומה ליניארית (x=y) המוצגת כקו מקווקו אדום מציינת אותות MFI זהים עבור מערכות זיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיוק בין בדיקות
יכולת שחזור טובה של בדיקה לבדיקה נצפתה עם מבחן הדיווח הכפול. תרשימי לוי-ג'נינגס (איור 3) עם ערכי MFI של מדגם בקרת איכות שנמדדו במשך שבע ריצות עצמאיות הדגימו את הדיוק הגבוה בין הבדיקות עבור כל האנטיגנים המייצגים. אחוז מקדם השונות הממוצע (CV% = סטיית תקן/ממוצע × 100) מתוך ארבעת האנטיגנים המייצגים של בורליה היה 5.3%.

ליניאריות דילול
מאחר שהבדיקה המקורית של כתב יחיד והבדיקה החדשה של דיווח כפול משתמשות בפלטפורמות ציטומטריות שונות של זרימה, השווינו את התפוקות הפלואורסצנטיות החציוניות של אותו אנטיגן אימונואסאי בין שני מכשירי ציטומטריית הזרימה (איור 4). סדרת דילול הדגימות סיפקה עקומות דילול ליניאריות הן להערכת IgM והן להערכת IgG, עם הקבלה טובה של תגובת מינון בין מכשירים לאורך כל טווח הדילול שהוערך (1:100-1:12,800).

figure-results-3
איור 3: דיוק בין הבדיקות של מבחן Borrelia מבוסס חרוזים בעל כתב כפול. לצורך הערכת הדיוק הבין-מבחן, נותחה תגובת נוגדנים IgM (A) ו-IgG (B-D) ספציפיים לבורליה של דגימת בקרת איכות במשך שבע ריצות עצמאיות, בבארות כפולות בכל פעם. הבדיקות בוצעו באופן ידני. ערכי MFI שורטטו בתרשים של לוי-ג'נינגס. קו ירוק נותן את הממוצע של כל הערכים. שני קווים מקווקווים אדומים מציינים את טווח הסיבולת של הדיוק הבין-מבחן. זה חושב מהערך הממוצע ± פי 2.5 מסטיית התקן (2.5 S.D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ליניאריות דילול של בדיקת Borrelia מבוססת חרוזים בעלת שני כתבים. בדילול מדגמי של פי 100 עד פי 12,800, עקומות הדילול הן עבור זיהוי IgM (A) והן עבור זיהוי IgG (B) היו דומות כאשר בוצעו באופן ידני עם מכשיר הדיווח היחיד ומכשיר הדיווח הכפול. בכל הדילולים שנבדקו, ערכי MFI היו מעט גבוהים יותר באמצעות מכשיר הדיווח היחיד (סמלים אדומים) מאשר מכשיר הדיווח הכפול (סמלים כחולים). מוצגות עקומות דילול עבור 2 אנטיגנים מייצגים, כאשר כל נקודת דילול מייצגת את המדידה הממוצעת של בארות משולשות עם סטיית תקן (SD *) המסומנת על ידי קווי שגיאה. הערה: SDs קטנים אינם גלויים בקנה מידה זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו"ח זה מדגיש את הפיתוח של מערכת חיסון Borrelia מבוססת חרוזים בת שני כתבים, הקובעת באופן משכפל ורגיש פעילות חיסונית נגד Borrelia בדגימות סרום12. ניתן להבדיל בין מיני הבורליה הפתוגניים השונים הגורמים לבורליוזיס ליים על ידי הטרוגניות אנטיגן ספציפיתלגרסה 6,7,8,9. הבדיקה המרובבת מעריכה בו זמנית תגובתיות חיסונית אנטי-בורליה בתיווך IgG ו-IgM בתוך אותה תגובה היטב, ובכך משמרת ריאגנטים, עבודה וחומר לדוגמה הדרושים לביצוע שתי בדיקות סינגלפלקס בנפרד. השוואת תגובות IgM ו- IgG לאורך זמן עשויה לאפשר מעקב טוב יותר אחר התקדמות המחלה מכיוון שהמרת סרוקונפורמציה מסוג IgM ל- IgG מתרחשת לאחר זיהום6.

מערכת הדיווח הכפול משתמשת בשתי מערכות נוגדנים שונות13,15. ניסויים קשורים לא הראו תגובתיות צולבת משמעותית הניתנת לזיהוי בין מערכות זיהוי אנטי-IgM ואנטי-IgG של Borrelia כאשר שתי קבוצות הנוגדנים נותחו יחד באותה תגובה12. בהתחשב בזיקה הנמוכה יותר של נוגדני IgM לעומת נוגדני IgG16,17, בחרנו בנוגדן זיהוי מצומד PE לזיהוי IgM (ערוץ הדיווח הראשון של מכשיר הדיווח הכפול) מכיוון ש- PE הוא אחד הפלואורופורים הפולטים החזקים ביותר המשמשים באופן שגרתי בבדיקות חיסוניות18. לצורך הערכת IgG, השתמשנו בנוגדן לזיהוי ביוטינילציה שהואר לאחר מכן בסטרפטאווידין מצומד BV421 (ערוץ הכתב השני של המכשיר)19. למרות שלב הדגירה הנוסף של 30 דקות בהשוואה למערכת המדווח היחיד, מערכת הדיווח הכפול מניבה פי שניים מידע לכל תגובה. בסך הכל, הבדיקה המרובבת של המדווח הכפול דורשת פחות זמן מצטבר ותשומות חומרים מאשר הפעלת שתי בדיקות של כתב יחיד.

ביצועים חזקים ויציבות של בדיקת Borrelia מרובה הודגמו על ידי יכולת שחזור גבוהה במחקרי דיוק תוך ובין מבחנים, ועל ידי הדגמה של ליניאריות דילול ומקביליות דילול על פני מגוון רחב של ריכוזי מדגם הן עבור הערכת IgG והן עבור הערכת IgM. נצפו רמות גבוהות יותר של פליטת פלואורסצנטיות אבסולוטית עבור אותם פלואורופורים באמצעות המכשיר החד-ערוצי לעומת המערכת הדו-ערוצית (≈1.7× גבוה יותר עם PE), המיוחסים להבדלים באופטיקה ובהגדרות הכיול בין שני המכשירים (איור 4). עם זאת, עקומות הפליטה הפלואורסצנטיות עם שני הפלואורופורים נותרו בטווח הליניארי של שני המכשירים ברמות קיצון של דילול דגימות גבוהות ונמוכות, וכל פער בפלואורסצנטיות האבסולוטית שנמדדה לא השפיע על סיווג מצב החשיפה לבורליה . 12

יתרון עיקרי של בדיקת Borrelia multiplex מבוססת חרוזים זו היא הקלות שבה ניתן לשנות או להרחיב את הבדיקה כדי להעריך אנליטים שונים או נוספים, למשל, כדי לזהות נוגדנים נגד אנטיגנים של מיני Borrelia נוספים. ערכות חרוזים מגנטיים xMAP מכילות שילובי צבעים שונים שניתן להבחין ביניהם בערוץ הסיווג של המכשיר וניתן ליישם אותם באופן תיאורטי במבחני מולטיפלקס שיכולים להעריך בו זמנית עד 500 אנליטים ייחודיים באותה דגימה. בעוד שהמחקר הנוכחי מדגיש ארבעה אנטיגנים מייצגים של Borrelia כדי להדגים פונקציונליות ויציבות של הבדיקה ולהשוות בין מערכת הדיווח היחיד והכפול, הבדיקה הסופית חוקרת שמונה אנטיגנים שיחד יכולים לזהות את כל חמשת הפתוגנים הרלוונטיים מבחינה קלינית של Borrelia המסתובבים ברחבי אירופה וצפון אמריקה12.

ביצועים בתפוקה גבוהה אפשריים באמצעות לוחות מיקרוטיטר סטנדרטיים של 384 בארות בפורמט בדיקה אוטומטי למחצה. תאימות הבדיקות והמכשירים עם לוחות 96 ו-384 בארות מאפשרת להשתמש בבדיקת המולטיפלקס של Borrelia ככלי סינון יעיל לניתוח מהיר של קבוצות מדגם גדולות, כגון מחקרים לאומיים20. ביצועים ידניים של הבדיקה נשארים אפשריים עבור קבוצות מדגם קטנות יותר המשתמשות בלוחות קטנים יותר של 96 בארות.

מגבלות המחקר כוללות הערכה השוואתית של מטרות תגובתיות חיסוניות מעטות בלבד של Borrelia במספר קטן של דגימות נסיוב אנושי. עם זאת, המחקר המקורי אישר כי ביצועי הבדיקה הן עבור IgG והן עבור IgM נשמרו כאשר ניתחו שמונה אנטיגנים מכל חמשת מיני Borrelia הידועים בתוך מדגם גדול יותרקבוצה 12. כמו כן, מכשיר הדיווח הכפול יכול להעריך רק שני איזוטיפים של נוגדנים בו זמנית בתוך כל תגובה, כך שפרופיל איזוטיפ מלא יחייב ביצוע תגובות בדיקה נוספות13.

לסיכום, דו"ח זה מפרט את המיזוג וההמרה המוצלחים של בדיקות חיסון מבוססות חרוזים למבדקי דיווח כפול שיכולים להעריך בו זמנית נוגדנים מסוג IgG ו-IgM ספציפיים לבורליה פתוגניים בדגימות נסיוב אנושי. גישה משולבת זו חוסכת זמן כולל, חומר ותשומות עבודה כדי ליצור את אותו נפח נתונים כמו שני מבדקים עצמאיים של כתב יחיד. ניתן לשנות את גודל בדיקת המרבב מפורמט צלחת מיקרוטיטר 96 באר לפורמט צלחת מיקרוטיטר 384 באר וניתן לבצע אוטומציה למחצה על ידי שימוש בלוח רובוטי ומכשור לטיפול בנוזלים, מה שהופך אותו מתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון סקרי אוכלוסייה גדולים. מערכות בדיקת דיווח כפול מבוססות חרוזים הוכיחו בעבר תועלת בהערכה, למשל, של תגובות חיסוניות לפתוגנים נגיפיים וחיידקיים אחרים13,21, הערכת תגובות נוגדנים אלוגניים כנגד אפיטופים של HLA בהשתלת איברים22, וחקירת מנגנונים של מחלות אוטואימוניות23. הדו"ח הנוכחי מפרט את השימוש בטכנולוגיית מולטיפלקס לזיהוי חשיפה לפתוגנים של בורליה הגורמים למחלת ליים, כדוגמה לאופן שבו מעבדות יכולות להתאים גישה זו לחקר מנגנונים חיסוניים מורכבים בפתולוגיות מגוונות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו"ח זה מומן על ידי לומינקס (אוסטין, טקסס). המחברים מודים למתיו סילברמן PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) על סיוע בעריכה אנליטית ומדעית. המחברים מודים גם להראלד קליין ולכריסטוף פון אייכל-שטריבר מחברת tgcBIOMICS GmbH (בינגן, גרמניה) על אספקת האנטיגנים של בורליה ששימשו במחקר. דגימות נסיוב אנושי לאימות בדיקות טכניות ובקרת איכות התקבלו מ: 1) מחקר שכיחות רב-מקומי וסדרתי על נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בגרמניה באמצעות המחלקה לאפידמיולוגיה, מרכז הלמהולץ לחקר זיהום, בראונשווייג, גרמניה; ו-2) המחלקה לנוירולוגיה, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, גרמניה). האישור לשימוש בדגימות אנושיות ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה של האנובר, גרמניה (9086_BO_S_2020).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>נוגדנים וריאגנטים לזיהוימספרקטלוגי
עז ביוטינילטי, אנטי אנושי IgGJackson ImmunoResearch (Dianova)109-066-098 
סגול מבריק 421-סטרפטווידיןBD Biosciences563259
חמור אנטי אנושי IgM Jackson ImmunoResearch (Dianova)709-116-073
<חזק>בורליה אנטיגניםtgcBIOMICS (בינגן, גרמניה)
<ריאגנטים חזקים>צימוד
1-אתיל-3-[3-דימתיל-אמינופרופיל] קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)Thermo Scientific Pierce77149 ProteoChem (100 מ"ג)
10x PBSFisher ScientificBP399-4
BSACarl RothT844.3
MES (2-חומצה אתנסולפונית; חוצץ zwitterionic)קארל רות'4256.2
Na2HPO4Carl Roth4984.1
ProClin300Sigma48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Scientific Pierce24510 (500 מ"ג)
Triton X-100Thermo Scientific85111
<חזק>מכשור וציוד מעבדה נלווהמקור
384 בארות צלחתקורנינג, Cat# 3570
96 בארות צלחות באר עמוקותThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96 בארות חצי שטח קורנינג, Cat# 3690
BioTek 405 TS מכונת כביסה צלחותBioTek Instruments/Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה 
מכונת כביסה לצלחות BioTek MultiFlo FXBioTek Instruments/Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה 
מגנט ספין DynaMag (לבידוד חרוזים בצינורות מיקרוצנטריפוגה)ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (מכשיר דו-ערוצי, מדווח יחיד)Luminex Corp., אוסטין, טקסס
מעבד חלקיקים מגנטי KingFisher (לבידוד חרוזים בצלחות של 96 בארות) ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (מגנטי, פלורסנט, 6.5-ומיקרו; חרוזים בקוטר m)Luminex Corp., אוסטין, טקסס
SmartBlock PlatesEppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer CEppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTopEppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (מכשיר תלת-ערוצי, מדווח כפול)LuminexCorp., אוסטין, טקסס
מקור:

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906(2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859(2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355(2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241(2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385(2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 8/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Tags

Multiplex ImmunoassayDual Reporter AssayAntibody Class DetectionIgG IgM DetectionBorrelia SpeciesLyme BorreliosisSerological TestImmunoreactivity AssessmentHuman Serum SamplesInfectious Disease Monitoring

Related Articles