ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O2 של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO2 המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O2 המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O2 הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O2 על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O2 ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.
מבוא
היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים1, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים2, או את הסף ללחץ היפוקסי3.
ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים4. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (VO2), ייצור CO2 או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גידול ואיסוף זבובים
- יש לשמור על זבובים בטמפרטורה של 25°C בבקבוקונים צרים המכילים מזון דרוזופילה סטנדרטי.
הערה: גודל הדגימה עבור כל גנוטיפ צריך לכלול לפחות תשעה עותקים משוכפלים, שכל אחד מהם מורכב מתא רספירומטר יחיד המכיל 15-25 זבובים, המוגדרים כמתואר להלן. - מעבירים את הזבובים כל 2-3 ימים.
- מרדימים זבובים עםCO2, אוספים קבוצות של 15-25 זכרים מכל גנוטיפ, ומניחים כל קבוצה בבקבוקוני מזון טריים ללא שמרים.
הערה: זכרים שימשו כדי להפחית את השונות עקב מצב הרבייה. השיטה חלה על שני המינים. - אפשרו לזבובים להתאושש ב-25°C למשך 24 שעות לפחות.
הערה: בזמן הניסוי, הזבובים צריכים להיות בני 1-4 ימים. ניתן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הלחץ ותפוקות הזרם של בקר הרספירומטר מוצגים עבור תא אחד בניסוי אחד באיור 3A. פעימת הזרם הארוך הראשונה לחצה על התא מלחץ הסביבה (כ-992 hPa) לסף OFF שנקבע מראש של 1017 hPa. כאשר הזבובים שצרכו O 2 ו-CO 2 נספגו, הלחץ ירד לאט עד שהגיע לסף ON של 1016 hPa, אשר הפעיל זרם דרך מחולל O2. בדוגמה המוצגת, המשרעת הממוצעת של כל פעימה היא 50.1 mA, משך הזמן הוא 16.1 שניות, מה שמניב העברת מטען של כ-0.81 קולומבים (C) לכל פולס. העברת המטען הכוללת עבור תא זה הייתה 3.28 צלזיוס על פני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O2 ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O2 במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים 3,6.
צעדים קריטיים התייחסו לשתי הדרישות המוחלטות של השיטה: איטום אטום לגז ויציבות סביבתית. שמירה על סביבה אטומה לגז היא פשוטה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לד"ר לינדה רסטיפו מאוניברסיטת אריזונה על שהציעה לבדוק את צריכת O2 של מוטציות CASK ועל שליחת מוטנטי CASK והבקרות הקונגניות שלהם. דמי הפרסום ניתנו על ידי הקרן המחלקתית להשקעה מחדש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קולג' פארק. שטח וכמה ציוד סופקו על ידי האוניברסיטאות בשיידי גרוב.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 19/22 מתאם מדחום | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | תקע חיישן |
| 2 מ"ל צינורות הברגה | פישר | 3464 | O2 גנרטור |
| 2 פינים | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 גנרטור: חתוך למחבר נקבה 2 פינים |
| 4 פינים | TE Connectivity | 215299-4 | תקע חיישן |
| 5 מ"ל צינור פוליפרופילן | פלקון | 352063 | חתוך ל-5.5 ס"מ ומחורר |
| 50 מ"ל צינור שלנק 19/22 משותף | Laboy | HMF050804 תא | |
| 6 כבל מוליכים | זניט | 6 מוליכים 26 ga | כבל |
| 6 פינים נקבה Bulkhead | Connector Switchcraft | 17982-6SG-300 | בקר |
| 6 פינים נקבה מחבר | Switchcraft | 18982-6SG-522 | תקע חיישן |
| 6 פינים זכר מחבר | Switchcraft | 16982-6PG-522 | כבל |
| 800 ul צינור צנטריפוגה | פישר | 05-408-120 | מחסנית סודה ליים |
| ABS מארז פלסטיק | באד תעשיות | PS-11533-G | בקר |
| Arduino Nano כל | Arduino LLC | בקר ABX00028 | |
| BME 280 חיישן | DIYMall | FZ1639-BME280 | חיישן תקע |
| מעגל לוח | 5 X 7 ס"מ | בקר | |
| נחושת סולפט | ביופארם | BC2045 | O2 גנרטור |
| מחשב | Azulle | Byte4 | רכישת |
| נתונים לחמניות כותנה | Kajukajudo | #2 | חתוך לשניים כדי לחבר צינורות זבובים חתוך לרבעים ללחות |
| תא סביבתי | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| אפוקסי | JB Weld | פלסטיק בונדר | אלקטרודות מאובטחות ב O2< / sub> גנרטור |
| זבוב | מזון מעבדה אקספרס | סוג R | זבוב |
| טיפול Keck מהדקים | uxcell | a20092300ux0418 | מאבטח מפרק זכוכית של תא לתקע |
| צמיגות נמוכה אפוקסי | לוקטיט | E-30CL | חיישן תקע |
| OLED תצוגת | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | בקר |
| חוט פלטינה 24 ga | uGems | 14349 | גנרטור O2 |
| גריז סיליקון | Dow-Corning | שומן ואקום גבוה | חיבור תא תקע |
| סודה ליים | Jorvet | JO553 | CO2 ספיגה |
| מתג החלפת מתג | מתג E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | בקר |
| כבל USB | Sabrent | בקר CB-UM63 | |
| רכזת USB רכזת | אטולה | 3.0 | חבר בקרים למחשב |
| אמבט מים | אמרשם | 56-1165-33 | בקרת טמפרטורה |
| מיכל אמבט מים | כלובי זכוכית | 15 ליטר אמבטיה אקרילית ללא שוליים | עבור מד נשימה |
מקורות
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
