כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג'ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.
M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג'ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ"ג/מ"ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115+) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG35-55) המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4+ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.
מבוא
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם1. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג'ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4+ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE2 ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו (אישור מספר 290238) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לניסויים בבעלי חיים.
1. הערות כלליות על הניסוי
- אחסן את העכברים בכלובים נפרדים במתקן בעלי החיים בתנאים מבוקרים, נטולי פתוגנים ב 23 ° C ± 2 ° C עם 50% ± 10% לחות, ומחזור אור / חושך של 12 שעות עם גישה אד libitum למזון ומים.
- הזריקו לעכברים מלח חוצץ פוספט (PBS) ללא אנטיגן ו-CFA, והשתמשו בהם כבקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה.
2. הכנת אנטיגנים מיקובקטריאליים
- לגדל את ז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קבוצות של עכברי C57BL/6 (סה"כ n = 15/קבוצה) חוסנו ב-MOG35-55 בתחליב המכיל M. paratuberculosis או בשיטה הנפוצה עם CFA. כל קבוצות העכברים הפגינו מחלה מונופאזית חריפה המאופיינת בשיא נכות יחיד שנצפה לאחר 14-17 ימים, ואחריו החלמה חלקית של הסימפטומים במהלך 10 הימים הבאים (איור 1A). עכברים שחוסנו באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis, ללא קשר למין, הראו התפרצות מוקדמת יותר בין 8 ל-9 ימים לאחר החיסון, וחומרה גבוהה יותר בשלב החריף מאשר עכברי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG35-55 המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis10. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקובקטריה11. למעשה, בניגוד למיקובקטריה אחרים, M. paratuberculosis מייצר אנטיגן lipopentapeptide על פני דופן התא במקום glycopeptidolipids11. ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן CD115 נגד עכבר | Biolegend, ארה"ב | 135505 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נוגדן CD11b נגד עכבר | Biolegend, ארה"ב | 101215 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נוגדן CD11c נגד עכבר | Biolegend, ארה"ב | 117313 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נגד עכבר CD16/32 נוגדן | Biolegend, ארה"ב | 101302 | עבור ציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נגד עכבר CD4 נוגדן | Biolegend, ארה"ב | 116004 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נגד עכבר CD8a נוגדן | Biolegend, ארה"ב | 100753 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נוגדן I-A/I-E נגד עכברים | Biolegend, ארה"ב | 107635 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| נגד עכבר Ly-6C נוגדן | Biolegend, ארה"ב | 128023 | לציטופלואורימטריה 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC העשרה | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | BD 211886 | לבידוד וגידול מיקובקטריות |
| עכברי C57BL/6J | מעבדת צ'ארלס ריבר, יפן | 3 שבועות, זכר ונקבה | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, ארה" | 42F9155K | לתרבית תאים, חם ב-37 מעלות; C לפני השימוש |
| מכונת מייבש הקפאה | Eyela, טוקיו, יפן | FDU-1200 | לליופיליזציה של חיידקים |
| לא שלמה e Freund' s adjuvant | Difco Laboratories, MD, ארה" | 263810 | לשימוש באדג'ובנט |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, ארה" | 90003-876 | מסייע בצמיחה של Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, ארה" | חיידקי BAA-968 | ממקור בקר |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, מיובש | BD Biosciences, ארה" | 743-26880-EA | לשימוש באדג'ובנט |
| מיקובקטין J | Allied Laboratory, מיזורי, ארה" | מקדם צמיחה | |
| מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקוליפיד (MOG) 35-55 | AnaSpec, ארה" | AS-60130-10 | פפטיד אנצפלוטיגני |
| אובאלבומין (257-264) | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | S7951-1MG | אנטיגן בקרה שלילית לבדיקת פרוליפרטיבית |
| תמיסת רעלן שעלת | פוג'יפילם וואקו, אוסקה יפן | 168-22471 | מחיידק גרם שלילי Bordetella pertussi, מגביר את חדירות מחסום הדם-מוח |
| הומוגנייזר פוליטרון PT 3100 | Kinematica | לערבוב האנטיגן עם האדג'ובנט | |
| RPMI 1640 עם L-גלוטמין | Gibco Life Techologies, ארה"ב | 11875093 | לתרבית תאים |
| תימידין, [Methyl-3H], ב-2% אתנול, 1 mCi | PerkinElmer, WalthamMA, ארה"ב | NET027W001MC | לבדיקת התפשטות, שימוש (1 μ Ci/well) |
| Zombie NIR ערכת כדאיות ניתנת לתיקון | Biolegend, ארה"ב | 423105 | ציטופלואורימטריה, לכדאיות התאים |
מקורות
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
