מאמר שיטה

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

DOI:

10.3791/65422

⸱

12 במאי 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג'ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.

M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג'ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ"ג/מ"ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115+) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG35-55) המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4+ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם1. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג'ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4+ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE2 ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינציה בחומר הלבן ההיקפי והתאוששות מופחתת לאחר שיא המחלה1.

MOG-EAE מושרה על ידי חיסון עכברים רגישים עם הפפטיד MOG35-55 באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA), ואחריו הזרקה תוך צפקית של רעלן שעלת. זה מגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח ומאפשר לתאי T ספציפיים למיאלין המופעלים בפריפריה להגיע למערכת העצבים המרכזית (CNS), שם הם יופעלו מחדש3. CFA ממלא תפקיד מפתח בהשראת EAE על ידי שיפור ספיגת האנטיגן על ידי תאים מציגי אנטיגן וביטוי ציטוקינים הקשורים לתגובות הומור ותאיות4. מנגנון זה נובע בעיקר מנוכחות של Mycobacterium tuberculosis מומת בשמן, שמרכיביו מספקים גירוי חזק למערכת החיסונית5. למעשה, השראת EAE קשורה ישירות לכמות המיקובקטריום הקיימת במהלך האתגר האנטיגני6.

התוספת של מיקובקטריה מומתת אחרת, כגון Mycobacterium butyricum, לאדג'ובנט7 של פרוינד, כמו גם ההשפעה של שילובים אדג'ובנטיים8, יכולה לווסת את המהלך הקליני של EAE וכתוצאה מכך להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות. תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), הסוכן האטיולוגי של מחלת ג'ון במעלי גירה, נקשר להפרעות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית 9 האנושית, שכן מרכיביו האנטיגניים מסוגלים לעורר תגובה הומוריסטית ותאית חזקה בחולים עם טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה9. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מראים שיטה חלופית וניתנת לשחזור להשראת MOG-EAE על ידי החלפת M. tuberculosis ב- CFA ב- M. paratuberculosis.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו (אישור מספר 290238) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לניסויים בבעלי חיים.

1. הערות כלליות על הניסוי

  1. אחסן את העכברים בכלובים נפרדים במתקן בעלי החיים בתנאים מבוקרים, נטולי פתוגנים ב 23 ° C ± 2 ° C עם 50% ± 10% לחות, ומחזור אור / חושך של 12 שעות עם גישה אד libitum למזון ומים.
  2. הזריקו לעכברים מלח חוצץ פוספט (PBS) ללא אנטיגן ו-CFA, והשתמשו בהם כבקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה.

2. הכנת אנטיגנים מיקובקטריאליים

  1. לגדל את זן M. paratuberculosis K-10 במדיום נוזלי מידלברוק 7H9 מועשר ב-10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז), 0.005% טווין 80 ו-2 מ"ג/ליטר מיקובקטין J למשך שבועיים בצלוחיות תרבית רקמה T25 ב-37°C. להעריך את צמיחת המושבה באופן קבוע על ידי בדיקה חזותית.
    התראה: יש לטפל ב-M. paratuberculosis במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).
  2. לגדל את תרבית ההעשרה 500 מ"ל בקבוק Erlenmeyer עם תרחיף של 1.7 × 105 יחידות יוצרות מושבה (CFU) / מ"ל בנפח סופי של 200 מ"ל (אותו מדיום כמו שלב 2.1) באינקובטור רועד למשך שבוע אחד.
    הערה: מכיוון שאורגניזמים מזהמים עלולים להשפיע על התוצאות, יש לחסן את החיידקים על מדיה מוצקה Middlebrook 7H10 כדי לקבוע מורפולוגיית מושבה ולאמת טוהר על ידי ערכות זיהוי תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR) עבור M. paratuberculosis.
  3. נטרלו את המתלים החיידקיים למשך 5-10 דקות ב-70°C ואת הצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות. שטפו את הגלולה הנשקלת ב-PBS פעמיים, שיבשו על ידי סוניקציה, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
  4. מעבירים את הגלולה למיכל סטרילי ומקפיאים אותה עם קרח יבש או חנקן נוזלי. מעבירים מיד לתא ייבוש בהקפאה.
  5. יבש בהקפאה (4 שעות ב -50 ° C תחת ואקום) M. paratuberculosis על פי מדריך המכונה.
  6. בתום הליופיליזציה, הסר את מיכל הנירוסטה ממייבש ההקפאה והעבר אותו לספסל ניקוי ביולוגי. השתמש במרית נירוסטה כדי לעקור את גושי MAP המיובשים הנצמדים לדופן הפנימית של מיכל הנירוסטה וכתש אותם דק ככל האפשר.
  7. שוקלים את התאים המרוסקים באמצעות איזון אלקטרוני ומניחים אותם ידנית בבקבוקון אספטי של 10 מ"ל בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
    הערה: צפיפות התאים כומתה כגרמים של משקל יבש לליטר דגימה. לאחר 3 שבועות, 1 מ"ג (משקל רטוב) של גלולת תא חיידק מכיל כ 2.5 × 108 CFU.

3. הכנת תחליב MOG 35-55

  1. טוחנים את תכולת בקבוקון אחד של M. paratuberculosis מיובש (10 מ"ג) לאבקה דקה עם מכתש ומזיק ומוסיפים 10 מ"ל לאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לקבלת תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -4°C.
  2. לפני החיסון, לדלל את תמיסת המלאי לריכוז סופי של 4 מ"ג / מ"ל.
  3. לדלל את הפפטיד MOG35-55 ב ddH 2 O לריכוז סופי של2מ"ג / מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
  4. באמצעות הומוגנייזר, מערבבים את תמיסת MOG35-55 (2 מ"ג/מ"ל) עם נפח שווה של אדג'ובנט (4 מ"ג/מ"ל) משלב 3.2 בצינור של 5 מ"ל עד ליצירת תחליב עבה. לאחר כל 10 שניות של ערבוב, מניחים את התמיסה על קרח במשך 20 שניות, ומסובבים את הצינור כדי לשחזר את כל התמיסה.
  5. מעבירים את התחליב למזרק 1 מ"ל, מוציאים את כל האוויר ומוסיפים מחט 27 גרם. התחליב מוכן כעת להזרקה.
    הערה. מאז אובדן מסוים של תחליב צמיג של MOG35-55 מתרחשת במהלך ההכנה, עדיף להכין 1.5 פעמים את הסכום הדרוש.

4. חיסון בעלי חיים

  1. להרדים את בעלי החיים עם שאיפת isoflurane כדי למזער את הלחץ על בעלי החיים.
  2. הזריקו את התחליב (200 μL המכיל 200 מיקרוגרם/עכבר של MOG35-55) תת עורית לגב התחתון.
  3. יש לתת מנה של רעלן שעלת (100 מיקרוליטר המכיל 200 ננוגרם/עכבר) תוך צפקית בימים 0 ו-2 לאחר החיסון.
    זהירות: לרעלן שעלת יש השפעה מדכאת, מרובה, על מערכת החיסון; יש להימנע מבליעה וממגע עם העיניים והעור.

5. הערכה קלינית

  1. עקוב אחר העכברים מדי יום עבור משקל וסימנים קליניים. השתמש במערכת הניקוד הבאה: 0 = ללא סימנים קליניים; 1 = זנב רפוי; 2 = פגיעה ברפלקס הנכון וחולשת הגפיים האחוריות; 3 = שיתוק מוחלט של הגפיים האחוריות; 4 = שיתוק מלא של הגפיים האחוריות עם שיתוק חלקי של הגפיים הקדמיות; 5 = מת.
    הערה: עם התצפית הראשונית של סימנים קליניים, בעלי חיים מקבלים גישה מוגברת למים ולמזון. צ'או מכרסם מרוכך ומרטיב, ואז מונח על רצפת הכלוב מהופר המזון. במקרה של בעלי חיים מיובשים, תוספת נוזלים תת עורית מנוהל, או מכרסם צ'או slurry ניתן באמצעות gavage אוראלי. אם עכבר זקוק לסיוע מסוג זה במשך יותר משלושה ימים, תתבצע המתת חסד.
  2. כדי להימנע או למזער כאב ומצוקה של בעלי חיים, השתמש בנקודות הקצה האנושיות הבאות: ירידה במשקל הגוף מעל 20%, ציון קליני ≥4.0, היעדר רפלקס התיקון בציון 3, וכאשר בעל החיים אינו מסוגל לגשת למזון או למים במשך 24 שעות.
    הערה: העכברים הומתו ביום ה-30 לאחר השראת EAE על ידי זריקות תוך-פריטוניאליות של פנטוברביטל (≥150 מ"ג/ק"ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבוצות של עכברי C57BL/6 (סה"כ n = 15/קבוצה) חוסנו ב-MOG35-55 בתחליב המכיל M. paratuberculosis או בשיטה הנפוצה עם CFA. כל קבוצות העכברים הפגינו מחלה מונופאזית חריפה המאופיינת בשיא נכות יחיד שנצפה לאחר 14-17 ימים, ואחריו החלמה חלקית של הסימפטומים במהלך 10 הימים הבאים (איור 1A). עכברים שחוסנו באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis, ללא קשר למין, הראו התפרצות מוקדמת יותר בין 8 ל-9 ימים לאחר החיסון, וחומרה גבוהה יותר בשלב החריף מאשר עכברי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG35-55 המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis10. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקובקטריה11. למעשה, בניגוד למיקובקטריה אחרים, M. paratuberculosis מייצר אנטיגן lipopentapeptide על פני דופן התא במקום glycopeptidolipids11. ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן CD115 נגד עכברBiolegend, ארה"ב135505לציטופלואורימטריה 1:1,000
נוגדן CD11b נגד עכברBiolegend, ארה"ב101215לציטופלואורימטריה 1:1,000
נוגדן CD11c נגד עכברBiolegend, ארה"ב117313לציטופלואורימטריה 1:1,000
נגד עכבר CD16/32  נוגדןBiolegend, ארה"ב101302עבור ציטופלואורימטריה 1:1,000
נגד עכבר CD4  נוגדןBiolegend, ארה"ב116004לציטופלואורימטריה 1:1,000
נגד עכבר CD8a  נוגדןBiolegend, ארה"ב100753לציטופלואורימטריה 1:1,000
נוגדן I-A/I-E נגד עכבריםBiolegend, ארה"ב107635לציטופלואורימטריה 1:1,000
נגד עכבר Ly-6C  נוגדןBiolegend, ארה"ב128023לציטופלואורימטריה 1:1,000
BBL Middlebrook OADC העשרהתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"בBD 211886לבידוד וגידול מיקובקטריות
עכברי C57BL/6Jמעבדת צ'ארלס ריבר, יפן3 שבועות, זכר ונקבה
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, ארה"42F9155Kלתרבית תאים, חם ב-37 מעלות; C לפני השימוש
מכונת מייבש הקפאהEyela, טוקיו, יפןFDU-1200לליופיליזציה של חיידקים
לא שלמה e Freund' s adjuvantDifco Laboratories, MD, ארה"263810לשימוש באדג'ובנט
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, ארה"90003-876מסייע בצמיחה של Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, ארה"חיידקי BAA-968ממקור בקר
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, מיובשBD Biosciences, ארה"743-26880-EAלשימוש באדג'ובנט
מיקובקטין JAllied Laboratory, מיזורי, ארה"מקדם צמיחה
מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקוליפיד (MOG) 35-55AnaSpec, ארה"AS-60130-10פפטיד אנצפלוטיגני
אובאלבומין (257-264)סיגמא-אולדריץ', ארה"בS7951-1MGאנטיגן בקרה שלילית  לבדיקת פרוליפרטיבית
תמיסת רעלן שעלתפוג'יפילם וואקו, אוסקה יפן168-22471מחיידק גרם שלילי Bordetella pertussi, מגביר את חדירות מחסום הדם-מוח
הומוגנייזר פוליטרון PT 3100Kinematicaלערבוב האנטיגן עם האדג'ובנט
RPMI 1640 עם L-גלוטמיןGibco Life Techologies, ארה"ב11875093לתרבית תאים
תימידין, [Methyl-3H], ב-2% אתנול, 1 mCiPerkinElmer, WalthamMA, ארה"בNET027W001MCלבדיקת התפשטות, שימוש (1 μ Ci/well)
Zombie NIR ערכת כדאיות ניתנת לתיקוןBiolegend, ארה"ב423105  ציטופלואורימטריה, לכדאיות התאים
ב ב ב ב ב ב ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MOGTh1T

מאמרים קשורים