בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

חלבוני הובלת ממברנות הם קריטיים לתקשורת בין תאים, כמו גם לשמירה על הומאוסטזיס תאי. בין חלבוני הובלת הממברנה, תעלות יונים משמשות להנעת גדילה והתפתחות של תאים ולשמירה על מצב התאים בסביבות מאתגרות ומשתנות. כמו כן, דווח כי תעלות יונים מניעות ותומכות בהתפתחות גידולים מוצקים, הן מערכתית והן במערכת העצבים המרכזית (CNS)^1,2. לדוגמה, תעלות KCa3.1 אחראיות על ויסות פוטנציאל הממברנה ובקרת נפח התא, דבר חשוב בוויסות מחזור התא. תעלות KCa3.1 פגומות דווחו כתורמות להתרבות חריגה של תאי גידול³. יתר על כן, תעלות יונים עשויות לתרום להפצה גרורתית של סרטן. ערוצי פוטנציאל קולטן חולף (TRP), למשל, מעורבים בזרם Ca 2+ ו- Mg²⁺; זרם זה מפעיל מספר קינאזות וחלבוני הלם חום שתפקידם לווסת את המטריצה החוץ תאית המקיפה גידול, שהיא, בתורה, חשובה להתחלת גרורות סרטניות⁴.

מאחר שתעלות יונים יכולות לתרום להתפתחות סרטן, הן עשויות גם להיות מטרות לטיפול תרופתי בסרטן. לדוגמה, עמידות לשיטות טיפול, כולל כימותרפיה ואימונותרפיה חדשנית, קשורה לתפקוד לקוי של תעלות יונים ^5,6,7. בנוסף, תעלות יונים מתגלות כמטרות תרופתיות חשובות המעכבות צמיחה והתפתחות של סרטן, כאשר נבדקות תרופות למולקולות קטנות (מאושרות על ידי ה-FDA), כמו גם ביופולימרים, כולל נוגדנים חד-שבטיים 1,2,8,9. בעוד שחלה התקדמות רבה בחזית זו, גילוי תרופות לסרטן תעלות יונים נותר לא מפותח. זאת, בין היתר, בשל האתגרים הייחודיים של חקר תעלות יונים בתאים סרטניים. לדוגמה, ישנן מגבלות טכניות בהגדרת בדיקות אלקטרופיזיולוגיות עבור תרכובות בעלות פעולה איטית והבדלים זמניים בהפעלת ערוצים ובפעולת תרופות. יתר על כן, מסיסות התרכובות יכולה גם לעכב התקדמות, מכיוון שרוב מערכות האלקטרופיזיולוגיה האוטומטיות הנמצאות בשימוש כיום משתמשות במצעים הידרופוביים, אשר עשויים לתרום לממצאים כתוצאה מספיגת תרכובות. בנוסף, טיפולים מולקולריים ביו-אורגניים גדולים כגון מוצרים טבעיים, פפטידים ונוגדנים חד-שבטיים מאתגרים מבחינה טכנית לסינון באמצעות בדיקות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות¹⁰. לבסוף, התכונות הביו-חשמליות של תאים סרטניים עדיין אינן מובנות כראוי¹¹.

בינתיים, צביעת האימונופלואורסנציה של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת. זה נובע, בין השאר, מהמורכבות של המבנים שלהם וההקשר שלהם בקרום, המשפיעים על היכולת לייצר ולהשתמש בנוגדנים למחקרי מיקרוסקופיה. חשוב במיוחד שהנוגדנים המשמשים להכתמת תעלות יונים יאומתו עבור ספציפיות, אהדה ויכולת שחזור. יש לשקול נוגדנים מסחריים לתעלות יונים על סמך אסטרטגיית האימות שלהם והיסטוריית הפרסום שלהם. ניסויים צריכים לכלול בקרות שליליות כדי להדגים את היעדר קשירה לא ספציפית על ידי הפלה או נוקאאוט של חלבון המטרה. לחלופין, קווי תאים שבהם חלבון המטרה נעדר או בשפע נמוך בהתבסס על mRNA או קביעת חלבונים עשויים לשמש כבקרות שליליות. לדוגמה, מחקר זה מראה לוקליזציה של תת-יחידת קולטן (GABA) Gabra5 בקו תאי מדולובלסטומה (D283). תאי D283 עם הפלה של siRNA ותאי Daoy, קו תאי מדולובלסטומה צרבלרי נוסף, הוכתמו עבור Gabra5 ולא הראו צביעה ניכרת (הנתונים לא מוצגים).

כאן, שיטות מוצגות לנתח ולהעריך תפקוד ערוץ יונים, כמו גם את ההשפעה של אפנן ערוץ יונים על תאים סרטניים. פרוטוקולים מסופקים עבור (1) צביעת תאים עבור תעלת יונים, (2) בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, (3) ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ו (4) אימות תרופות במבחנה. פרוטוקולים אלה מדגישים מחקרים של קולטן חומצה גמא-אמינובוטירית מסוג A (GABA_A) 2,12,13,14,15,16^, תעלת אניון כלוריד וקולטן נוירוטרנסמיטר מעכב עיקרי. עם זאת, השיטות המוצגות כאן חלות על חקר תאים סרטניים רבים אחרים ותעלות יונים.

1. תיוג חיסוני של תעלות יונים בתאים בתרבית

1. הכנת התאים ומערך הניסוי
   1. לשמור על התאים כתרבות גידול פעיל ב 75 ס"מ² צלוחיות תרבית. עברו את התאים פעם אחת עד שהם הופכים ל-50%-90% נפגשים, תלוי בזמן ההכפלה של קו התא בו משתמשים.
      הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאי D283, קו תאי מדולובלסטומה מקבוצה 3.
   2. אספו את התאים מבקבוק התרבית לתוך צינור צנטריפוגה (15 מ"ל או 50 מ"ל), והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לנתק תאים דבקים. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 5 דקות, הקש על הבקבוק שלוש עד חמש פעמים כדי לעזור לנתק את התאים. לאסוף את התאים ב 10 מ"ל של בינוני עם 10% FBS כדי לעצור את הפעולה של טריפסין.
   3. צנטריפוגה ב 480 x גרם במשך 5 דקות ב RT. בעדינות לשאוף את המדיום. אין להפריע לכדורית התא.
   4. להשעות את התאים ב 5 מ"ל עד 10 מ"ל של בינוני, בהתאם לצפיפות של התרבית.
      הערה: הצפיפות חייבת להיות עקבית עם תאים הגדלים באופן פעיל והיא תלויה במפגש התאים בצלוחית. יש להשתמש בהערכה חזותית כדי להעריך בקירוב את צפיפות התאים האופטימלית; באופן ספציפי, התאים צריכים להיות בין 40%-90% קונפלונטיים ומפוזרים באופן שווה.
   5. הסר 100 μL של תאים, והוסף לצינור 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של 0.4% טריפאן כחול כדי לסמן תאים שאינם קיימא. יש לדגור 5-15 דקות ב-RT, בהתאם לקו התא.
   6. ספור את התאים באופן ידני באמצעות המוציטומטר (ראה טבלת חומרים) ב 10 μL של תמיסה. ספרו את התאים החיים והלא מוכתמים בכל אחת מארבע הפינות של 16 הריבועים של ההמוציטומטר. הכפל את מספר התא הממוצע עם גורם הדילול וב- 10,000 כדי לתת את התאים למיליליטר (תאים/מ"ל). לחלופין, ניתן להשתמש במונה תאים אוטומטי.
   7. לדלל תאים ל 1 x 10⁵ תאים/מ"ל לתוך מדיום התרבית שצוין עבור כל קו תא. זרע 1. 8 מ"ל תאים לכל באר של צלחת 6 בארות המכילה כיסוי 22 מ"מ x 22 מ"מ מצופה מראש בפולי-D-ליזין 0.1 מ"ג/מ"ל בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ייתכן שתרצה לבדוק את השימוש הן בפולי-D-ליזין והן בפולי-L-ליזין, מכיוון שישנם דיווחים על העדפות ספציפיות לקו התא^17,18. בחלק מקווי התאים יש פרוטאזות שיכולות לפרק פולי-L-ליזין, בעוד שישנם דיווחים כי פולי-D-ליזין רעיל לחלק מקווי התאים. לעומת זאת, תאים עצביים, כגון PC12, דווחו כבריאים יותר על משטחי פולי-D-ליזין.
   8. גדלו את התאים באינקובטור עם סביבה לחה של 5%_CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי. לבחון את החיבור של התאים תחת מיקרוסקופ הפוך עם מטרה 20x.
      הערה: התאים חייבים להיות מחוברים במלואם למכסה לפני הטיפול או immunostaining ישיר. בשלב זה, התאים יכולים להיות מטופלים עם תרופות (או בקרת רכב) על ידי תוספת של מלאי מרוכז (למשל, 600 μL של תמיסת מלאי 4x) או החלפת המדיום עם מדיום טרי המכיל את התרופה בריכוז הרצוי 1x; לאחר מכן ניתן להחזיר את התאים לאינקובטור עד 48 שעות נוספות. תאים המטופלים בממס נכללים כדי להעריך את ההשפעות של התרופה על רמת לוקליזציה של מולקולת היעד. במחקר הנוכחי, תאי D283 טופלו ב-600 μL של תמיסה של 3.2 מיקרומטר של אפנן אלוסטרי חיובי לקולטן GABA_A , QH-II-066¹⁴ (ראה טבלת חומרים), במשך 48 שעות. תאי הבקרה טופלו בנפח שווה ערך של DMSO.
2. הכנה לתיוג חיסוני: קיבוע, חלחול וחסימה
   1. שטפו את התאים עם 2.5 מ"ל של 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH₂PO₄, ראו את טבלת החומרים), ושאפו מיד את התמיסה.
   2. תקן את התאים באמצעות 1 מ"ל של 4% PFA ב- 1x PBS למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: בעוד 4% PFA הוא הקיבוע הסטנדרטי עבור צביעת חיסון, גלוטראלדהיד או גליוקסל יכול לשמש גם כדי לתקן חלבוני ממברנה עבור immunofluorescence. שיטות קיבוע מבוססות אלכוהול, כגון טיפולים במתנול קר כקרח, עלולות להוביל למורפולוגיה פחות שמורה היטב ולאובדן חלבוני ממברנה^19,20.
   3. יש לשטוף שש פעמים עם 2.0 מ"ל של 1x PBS (5 דקות לכל כביסה) על ידי תסיסה על שייקר. דגרו במשך שעה אחת ב-RT במאגר חוסם המורכב מ-1x PBS עם 0.8% Triton X-100 ו-10% סרום תקין התואמים למין המארח של הנוגדן הראשוני (לחלופין, ניתן להשתמש באלבומין 3% BSA או במקטע V בסרום בקר במקום בסרום רגיל).
      הערה: שלב זה משמש לחסימת איגוד לא ספציפי.
3. תיוג חיסוני
   הערה: לאחר הוספת הנוגדנים המצומדים לפלואורופורים, יש לבצע מדידות בהקדם כדי למנוע הלבנה. דגירות עם נוגדנים מצומדים צריכות להיות מוגנות מפני אור. השימוש באמצעי הרכבה המכיל חומרים המנטרלים רדיקלים חופשיים יפחית את ההלבנה. יש לאחסן את המגלשות בכלי אטום ואטום (בטמפרטורה של 4°C) לאחר איטום הכיסויים. בעת ההדמיה, ניתן למזער את ההלבנה על ידי הגבלת עוצמת תאורת העירור וזמני החשיפה.
   1. הכינו תא לח על ידי ריפוד תחתית צלחת תרבית בקוטר 150 מ"מ בנייר פילטר. מרטיבים את נייר הסינון במים מזוקקים סטריליים. ציירו רשת בגודל 3X2 על פיסת סרט מעבדה שנחתכה כך שתתאים לנייר הסינון, ותייגו אותה כדי לשמור על כיוון הכיסויים בלוח בעל 6 הקידוחים. הניחו את סרט המעבדה על גבי נייר הפילטר, וחשפו את הקצוות העליונים והתחתונים כדי ללחלח את החדר.
   2. יש להכין 100 μL לכל כיסוי של הדילול הרצוי של נוגדן ראשוני ב-1x PBS עם 3% BSA. כדי לזהות את תוצר חלבון הגן GABRA , השתמש בנוגדן ראשוני רקומביננטי רבוננטי של ארנב בדילול של 1:200 (נוגדן Gabra5, אזור האמצע; ראה טבלת חומרים).
      הערה: כדי לקבוע אמפירית את ריכוז הנוגדנים הראשוני המפיק את האות האופטימלי על הרקע, השתמש בסדרת דילול של הנוגדן הראשוני תוך שמירה על ריכוז משני קבוע. מומלץ לבצע דילולים של 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 ו-1:1,000 כדי לקבוע ריכוזי נוגדנים ראשוניים אופטימליים.
   3. העבר את תלוש הכיסוי מתמיסת הבלוקים בלוח 6 הקידוחים למיקום הנכון על הרשת המשורטטת על סרט המעבדה. השליכו את תמיסת הבלוקים מצלחת 6 הבארות, ושמרו את הצלחת לשלבי השטיפה.
   4. יש להוסיף בזהירות 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל למרכז כל כיסוי. הימנעו מהנחת התמיסה על קצה הכיסוי. לדגור במשך שעה אחת ב- RT.
   5. הוסף 2.5 מ"ל של 1x PBS לכל באר של צלחת 6 בארות. מעבירים את הכיסוי בחזרה למיקום המתאים בצלחת 6 הבארות.
   6. בצע שש שטיפות במשך 5 דקות כל אחת עם 2.5 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: אין לאפשר לכיסויים להתייבש במהלך שלבי השטיפה, מכיוון שהדבר עלול לתרום לאות פלואורסצנטי ברקע.
   7. החזירו את פתקי הכיסוי למיקום הנכון על סרט המעבדה. עבור כל כיסוי, הוסף 100 μL של נוגדן משני מדולל ב 1x PBS + 1%-5% BSA.
      הערה: בתחילה, נוגדנים משניים מצומדים ל-Alexa Fluor 488 (ראה טבלת חומרים) משמשים בדילול של 1:1,000 ב-1x PBS + 3% BSA. ריכוז הנוגדנים המשני עשוי להיות אופטימלי על ידי הגדלת הריכוז כדי לזהות חלבוני מטרה בשפע נמוך או הפחתת הריכוז כדי להפחית את הרקע, במידת הצורך.
   8. עבור השלבים הנותרים, מזערו את החשיפה לאור כדי למנוע הלבנה של הנוגדן המשני המצומד. מכסים את צלחת התרבית ברדיד אלומיניום, ודגרים במשך שעה אחת ב- RT.
   9. מעבירים את הכיסויים בחזרה לצלחת בעלת 6 הקידוחים. באמצעות שייקר, לבצע שש שטיפות במשך 5 דקות כל אחד עם 2.5 מ"ל של 1x PBS. הסר את PBS על ידי היפוך הצלחת מעל הכיור או כלי קיבול פסולת. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר את PBS בבאר כדי להקל על הסרת הכיסוי.
   10. תייגו שקופית מיקרוסקופ עבור כל תלוש כיסוי. הוסף טיפה של אמצעי הרכבה המכיל גליצרול עם DAPI (כדי להכתים את הגרעינים) (ראה טבלת חומרים) למרכז השקופית.
   11. בעזרת מלקחיים, הסירו את הכיסוי מהבאר, והניחו אותו בעדינות על טיפת אמצעי ההרכבה במרכז המגלשה.
       הערה: הימנע מהיווצרות בועות אוויר בתווך ההרכבה.
   12. השתמש בחתיכות קטנות של נייר סינון כדי להסיר אמצעי הרכבה עודפים. אטמו את שולי הכיסוי בלק והניחו ללק להתייבש לחלוטין לפני ההדמיה. אחסנו את מגלשות הזכוכית בטמפרטורה של 4°C בקופסת פלסטיק אטומה.
4. הדמיה ואנליזה
   1. קבל תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרה 40x עם שמן טבילה (ראה את טבלת החומרים).
   2. הציגו באופן חזותי את התמונות הפלואורסצנטיות בעזרת המסננים המתאימים.
   3. הערה: עבור Alexa Fluor 488, השתמש בעירור/פליטה של 496 ננומטר/519 ננומטר; עבור DAPI, השתמש בעירור/פליטה של 358 ננומטר/461 ננומטר.
   4. לכוד ושמור את קבצי התמונה הדיגיטלית. ערך איגוד של 4 x 4 משמש כדי להקל על קצב איסוף התמונות ולהקטין את הרקע.
   5. הכינו את התמונות הסופיות. ניתן לעבד את התמונות באמצעות ImageJ או תוכנה מסחרית. התוצאות מודגמות באיור 1.

2. בדיקת המצב המקוטב של המיטוכונדריה

הערה: פרוטוקול זה משתמש בבדיקת TMRE (tetramethylrhodamine, ethyl ester) כדי לתייג את פוטנציאל הממברנה במיטוכונדריה פעילה, תוך שמירה על מטען שלילי^21,22. TMRE הוא צבע אדום-כתום בעל מטען חיובי החדיר לתאים, המצטבר במיטוכונדריה פעילה בגלל המטען השלילי היחסי שלהם. אברוני מיטוכונדריה לא פעילים או דה-פולריים הפחיתו את פוטנציאל הממברנה ואינם מצליחים לבודד באופן פרופורציונלי TMRE. FCCP (קרבוניל ציאניד 4-[trifluoromethoxy] פנילהידראזון), מפרק יונופור של זרחן חמצוני (OXPHOS), מנטרל את הממברנות המיטוכונדריאליות, ובכך מונע הצטברות ותפיסה של TMRE²³. זה מומחש באיור 2.

1. הכנת התאים ומערך הניסוי
   1. לשמור על התאים 75 ס"מ² צלוחיות תרבית. שאפו את מדיום התרבית, ושטפו את התאים עם PBS 1x ללא סידן ומגנזיום.
   2. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים הדבקים. לדגור במשך 5 דקות ב RT, ולהשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של בינוני.
   3. אספו את התאים מבקבוק התרבית לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 480 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף את המדיום.
   4. Resuspend את התאים ב 5 מ"ל עד 10 מ"ל של בינוני, בהתאם למפגש המקורי של התרבית, כך ריכוז התא הוא 50-100 תאים לכל ריבוע על hemocytometer. התאם את עוצמת הקול, במידת הצורך, כדי לספק את צפיפות התאים הדרושה לספירה מדויקת.
   5. הסר 100 μL של תאים, והוסף לצינור 1.5 מ"ל המכיל 100 μL של 0.4% טריפאן כחול. ספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי. לדלל את התאים ל 3 x 10⁴ תאים / מ"ל בתווך תרבית ללא פנול אדום.
      הערה: מדיום DMEM חסר פנול אדום משמש מכיוון שחשיפה לאדום פנול מעכבת חדירות ממברנה ועשויה לתרום לאוטופלואורסצנטיות ברקע.
   6. זרעו 2.5 מ"ל של תרחיף התא (75,000 תאים) לכל באר לתוך צלחת בעלת 6 בארות המכילה כיסוי בקוטר 22 x 22 מ"מ המצופה מראש בפולי-D-ליזין בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   7. גדלו את התאים באינקובטור עם 5%_CO2 לח בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.
   8. לבחון את ההתקשרות של תאים תחת מיקרוסקופ הפוך עם מטרה 20x. התאים חייבים להיות מחוברים במלואם לתלוש הכיסוי לפני שממשיכים הלאה.
2. הכנת פתרונות מלאי
   1. להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"מ (1,000x) של TMRE (MW = 514.96 גרם/מול) (ראה טבלת חומרים), יש להמיס 1 מ"ג TMRE ב-1.94 מ"ל DMSO. Aliquot ולאחסן ב -20 °C מוגן מפני אור. יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים.
   2. כדי להכין תמיסת מלאי של 50 מילימטר (2,500x) של FCCP (MW = 254.17 גרם/מול) (מצמד זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי), יש להמיס 10 מ"ג של FCCP ב-786.9 מיקרוליטר של DMSO. Aliquot ולאחסן ב -20 °C מוגן מפני אור. יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים.
   3. הערה: תמיסות מלאי מוכנות הן חלק מערכת TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (ראה טבלת חומרים).
3. קביעת ריכוז TMRE עבור קווי התא
   1. הכינו פתרון TMRE עובד של 500 ננומטר בתווך תרבית תאים. הגן על פתרון העבודה מפני אור.
   2. יש להוסיף TMRE לתאים הגדלים על הכיסויים בטווח ריכוז בינוני עד סופי שבין 50-200 ננומטר. עשו זאת על ידי שאיפה ראשונית של מדיום התרבות והחלפתו במדיום תרבות המכיל TMRE.
   3. יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C. הקפד לקצר את זמני הטיפול כדי לאפשר הדמיה, שכן התאים נצפים בשידור חי.
   4. שטפו את התאים פעמיים עם 1x PBS, והפכו את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ המסומנת עם ריכוז TMRE הסופי.
   5. צלם מיד את התאים החיים (שיא E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      הערה: דמיינו מיד את הדגימות לאחר שהוסרו מתנאי התרבית, מכיוון שבריאות המיטוכונדריה נפגעת ברגע שהתאים מוסרים מהמדיום ומונחים על שקופית מיקרוסקופ. כחלופה לכיסויים, ניתן לדמיין את התאים בכלים בעלי תחתית זכוכית.
   6. צלם את התמונות באמצעות המיקרוסקופ והתוכנה הזמינים.
      הערה: קבע פרמטרים של הדמיה מיקרוסקופית ניסיונית במהלך תהליך מיטוב ריכוז TMRE, ושמור על אותם תנאים בניסויים הבאים כדי להבטיח השוואת נתונים מדויקת. הפרוטוקול המפורט השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה תואמת (ראה טבלת חומרים).
   7. בחר את ריכוז TMRE האופטימלי, שהוא תלוי בקו התא.
      הערה: ריכוז TMRE המספק את האות הטוב ביותר לפתרון שינויים ברמות TMRE במיטוכונדריה הוא בדרך כלל ריכוז ה-TMRE הנמוך ביותר, מה שנותן אות פלואורסצנטי אחיד וקל לזיהוי.
4. בדיקת המצב המקוטב של תא
   1. הכנת Assay
      1. הכינו את תמיסות מלאי הטיפול בריכוזים הרצויים, והכינו מדיה עם ריכוז התרכובת הסופי שיש לבדוק. עבור FCCP, פתרון המניות צריך להיות 20 mM (מוכן עם DMSO מתוך פתרון מלאי 50 mM).
      2. עבודה על כיסוי יחיד בכל פעם, להוסיף 1.8 מ"ל של מדיום בתוספת תרכובת הבדיקה לתאים.
      3. לדגור על התאים עם תרכובת הבדיקה ב 37 ° C ו 5% CO₂ בסביבה לחה למשך פרק הזמן הרצוי.
         הערה: זמני הטיפול ישתנו בהתאם למנגנון שבו תרכובת הבדיקה עשויה לשנות את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. פרוטונופורים חזקים כמו FCCP אשר מפרקים במהירות ובאופן ישיר את פוטנציאלי הממברנה המיטוכונדריאלית דורשים ניתוח זמן קצר לאחר הטיפול (תוך דקות). לעומת זאת, השפעות טיפול עם תרכובות המשפיעות בעקיפין על תפקוד שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, כגון אלה המשנות את הפעלת החלבונים או את תחלופת החלבונים או דורשות סינתזת חלבון, עשויות להימשך זמן רב יותר כדי להראות השפעה.
      4. במהלך הדגירה, הפעילו את המיקרוסקופ, והגדירו אותו לפרמטרי ההדמיה האופטימליים שנקבעו מראש, כולל מבחינת הרווח, עוצמת הלייזר, קצב לכידת התמונה, הממוצע וזמן החשיפה.
      5. לאחר תקופת הטיפול התרופתי, יש להוסיף 200 μL של 10x TMRE (ריכוז אופטימלי שנקבע לעיל) לתאי הבקרה והמטופלים.
      6. יש לדגור במשך 15-30 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 בסביבה לחה. שאפו בעדינות את המדיום, ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS.
      7. חזור על שלב השטיפה 1x PBS כדי למנוע רקע שנגרם על ידי מדיום תרבית התא או תרכובות הטיפול, והפוך את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ המסומנת עם תנאי הטיפול.
      8. תמונה התאים חיים ב- E_x/E_m = 549 nm/575 nm. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אסוף מספר שדות מחסנית z עם לכידת תמונה במהירות גבוהה (512 פיקסלים x 512 פיקסלים, ממוצע = 4) לפני אובדן שלמות התא.
      9. שמור ואחסן את קובץ התמונה לניתוח. ההליך חוזר על עצמו עבור מצב הניסוי הבא.
   2. בקרות ניסיוניות
      1. השתמש בבקרה ללא טיפול (שלילי), המבוצעת כמתואר לעיל (שלבים 3.1.1-3.1.8), ללא תרכובת הבדיקה בתווך.
      2. השתמש בבקרת הפרעה פוטנציאלית (חיובית) של הממברנה המיטוכונדריאלית המורכבת מתרכובת הפרוטונופור FCCP. הוסף 1.8 מ"ל של 20 מיקרומטר FCCP (ראה טבלת חומרים) בתווך לתאים. כמתואר לעיל (שלבים 3.1.1-3.1.2; והדמיית תאים, כמתואר בשלבים 3.1.3-3.1.8), יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 בסביבה לחה לפני הצביעה ב-TMRE.
         הערה: בקרות חיוביות ושליליות נדרשות עבור ניסויים אלה.
   3. כימות
      1. מדדו את עוצמות הפיקסלים שנלכדו של תאים בודדים מתמונה מייצגת אחת מהאזור המרכזי של כל ערימת z. בעבודה זו נבחר מישור מיקוד יחיד כדי להקל על הניתוח.
      2. נתח את עוצמות הפיקסלים מלפחות 30 תאים (בשלמותם) בכל טיפול. השתמש ב- Excel או בפריזמה כדי לחשב ממוצע של עוצמות הפיקסלים עבור כל טיפול, והצג בתבנית גרף עמודות עם שגיאת התקן של הממוצע.
         הערה: ImageJ יכול לשמש גם לכימות פלואורסצנטי. לחלופין, ניתן לכמת פלואורסצנטיות צביעה TMRE באמצעות פלטפורמות תוכנה מסחריות.

3. ביסוס תפקוד תעלת היונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה

הערה: ההליך בסעיף זה מתאר את השימוש בבדיקת אלקטרופיזיולוגיה אוטומטית כדי לסנן תרכובות בדיקה בקו תאים סרטניים (איור 3).

1. הכנת התאים
   1. קצרו תאים מתרבית בריאה שחסרה בה תאים מתים ו/או צמיחת יתר של תאים. השתמש בתמיסת ניתוק התאים הכימית TrypLE או במגרד תאים ידני כדי לקצור תאים דבקים ומקובצים. לנתק תאים הגדלים בגושים או בכדורים, אשר נפוצים במיוחד בקרב תאי סרטן CNS.
      הערה: דיסוציאציה עדינה של התאים מסייעת לשמור על שלמות חלבוני הממברנה החיוניים למוליכות יונים.
   2. צנטריפוגה את התאים ב 561 x גרם במשך 10 דקות ב RT. להשליך את supernatant, ולהשהות את הגלולה DMEM (ללא פנול אדום), HEPES, פניצילין/סטרפטומיצין עם 20% FBS ו 4 mM L-גלוטמין (ראה טבלה של חומרים) נשמר ב 37 ° C.
      הערה: נעשה שימוש במדיום DMEM חסר פנול אדום מכיוון שחשיפה לאדום פנול מעכבת את חדירות הממברנה.
   3. לוחים את התאים על מכסה מצופה פולי-L-ליזין בצפיפות נמוכה, כך שיש הפרדה בין התאים הבודדים.
      הערה: פולי-L-ליזין משמש כאן, ולא פולי-D-ליזין, כמו פולי-L-ליזין יש תכונות ציפוי טוב יותר.
   4. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ בתא לח במשך 12 שעות עד 24 שעות (זמן אופטימלי יהיה צורך לקבוע) לפני ביצוע הקלטה.
2. הקלטה אלקטרופיזיולוגית
   1. הסירו את המדיום מהכיסויים. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 1x PBS. הוסף ~ 300 μL של תמיסת TrypLE. בעזרת הפיפטה, פיפטה עדינה למעלה/למטה ארבע עד חמש פעמים עד שהתאים מנותקים.
   2. הוסף מדיום ללא סרום (DMEM) (ללא פנול אדום), ושמור על ספירת תאים סופית לכל נפח של לפחות 1 מיליון תאים/מ"ל. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, נטרלו את התאים לקבלת תרחיף תאים חסר אשכולות תאים.
   3. העבר את מתלה התא לצינור 1 מ"ל. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות כדי לייצב את קרום התא. שמור על התאים מסתובבים על שייקר (מחזור עדין) כדי למנוע היווצרות של גושי תאים.
   4. הכן את הגדרת Port-a-Patch (עיין בטבלת החומרים). הפעל את המחשב, המגבר ומערכת הזילוח. פתח את תוכנת Patch-Master וצור קובץ חדש.
   5. הבא את המאגרים (חוץ-תאיים ופנימיים) ל- RT, ולאחר מכן טען את המאגרים לצינורות הזילוח המתאימים.
      הערה: הקלטות של קולטן GABA_A דורשות הן "תמיסת אמבטיה חוץ-תאית" המכילה 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES ו-6 mM D-glucose (pH מותאם ל-7.4 באמצעות NaOH) והן "תמיסה פנימית" המכילה 120 mM KCl, 2 mM MgCl ₂, 10 mM EGTA, ו-10 mM HEPES (pH מותאם ל-7.2 באמצעות NaOH).
   6. מלא את החלק התחתון של שבב אלקטרודה (שסופק על-ידי היצרן) בתמיסה פנימית של 5 μL, והנח את שבב האלקטרודה על החלק העליון של פאראדיי של Port-a-Patch. הוסף 10 μL של תמיסה חיצונית לשבב, והתבונן בפולס המלבני על האוסילוסקופ באמצעות תוכנת Patch-Master (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ההתנגדות עשויה להיות בטווח של 2-3 MΩ, אך היא תלויה בקו התא.
   7. התחל להקליט ברגע שהפולס המלבני גלוי, לאחר ההתאמות האלקטרוניות הראשוניות, ולאחר שהתוכנה מבקשת מהמשתמש להוסיף תאים.
   8. הוסף בעדינות 20 μL של תרחיף חד-תאי לחלק המרכזי של האלקטרודה, והמתן לטלאי התא ואחריו חותם Giga-Ohm על ידי התבוננות בערכי ההתנגדות בתוכנה.
   9. ניתן לראות את ההתקדמות החיה של תיקון תאים בעמודה השמאלית של התוכנה. לאחר שהתא "נשמר במצב תא שלם", התחל את ההקלטות על ידי פתיחת פרוטוקול בתוך התוכנה.
   10. הגדר את פוטנציאל ההחזקה על -80 mV. הפעל פרוטוקול הקלטה רציף ללא פערים באמצעות תוכנת Patch-Master כדי להקליט את הזרם מהתא.
   11. השג קו בסיס יציב, ועבור לליגנד וליישום מורכב מתאים למשך זמן מוגדר באמצעות כרטיסיית הזילוח האוטומטית בחלונית השמאלית של התוכנה.
   12. קבל נתונים באמצעות תוכנת Patch-Master.
       הערה: הנתונים מסוננים במעבר נמוך ב- 1 kHz ודיגיטליים ב- 100 kHz.
   13. בצע ניתוח נתונים על-ידי חישוב המשרעת המרבית של התגובה הנוכחית באמצעות תוכנת Nest-o-Patch (ראה טבלת חומרים).

4. עוצמה במבחנה

הערה: הליך זה מפרט בדיקת MTS כדי לקבוע את עוצמת התרופה. One Solution Cell Proliferation Assay משלב את כל ריאגנטי הבדיקה הנדרשים לתמיסה מוכנה שניתן להוסיף בשלב אחד לבארות תרבית תאים כדי להעריך את הכדאיות וההתרבות של התא לאחר הטיפול בתרכובות ניסיוניות. המגיב נבנה מחדש בהתאם להמלצות היצרן (ראה טבלת החומרים), מקורו ומאוחסן ב -20 ° C. החלק מתאר את השימוש בבדיקה כדי לקבוע את IC₅₀ של תרכובות בדיקה בקו תאים מסוים (איור 4). מגיב MTS זה יכול לשמש גם לסינון בתפוקה גבוהה של מספר רב של תרכובות בריכוזים ידועים.

1. הכנת התאים
   הערה: מספר התא תלוי בגדילה ובחילוף החומרים של כל קו תאים בודד. קבע את מספר התא האופטימלי באופן ניסיוני לפני השימוש בבדיקה כדי להעריך טיפולים ניסיוניים כלשהם.
   1. קצרו תאים דבקים מהתרבית על ידי טריפסיניזציה, והשתמשו באקוטסאז (ראו טבלת חומרים) כדי לנתק את התאים שגדלים בגושים או בכדורים.
      הערה: גליובלסטומה וקווי תאים ראשוניים של מדולובלסטומה דורשים לעתים קרובות Accutase מכיוון שהם נוטים לגדול בגושים או בכדורים.
   2. ספרו את התאים, וצרו תמיסת תאים עם 10,000 תאים לכל באר בנפח של 75 מיקרוליטר. בצע דילול של המלאי עבור מספרי התאים להיבדק. להכין לפחות 1 מ"ל לכל דילול.
   3. צלחת 75 μL של כל דילול לתוך קבוצות של חמש בארות רצופות בצלחת 96 בארות. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך הלילה בסביבה לחה (כלומר, אינקובטור).
      הערה: קווי תאים עם גדילה איטית או חילוף חומרים (שמחמיצים את מדיום הצמיחה שלהם ביותר מ-3 ימים) עשויים לדרוש יותר מ-10,000 תאים כטווח מספרי התאים העליון, בעוד שקווי תאים שגדלים במהירות (בדרך כלל מהר יותר מ-20 שעות זמן הכפלה) דורשים פחות תאים. קווי תאים עם חילוף חומרים גבוה עשויים לדרוש פחות מ -1,000 תאים לכל באר. ניתן להתאים את טווח התאים כדי לקבוע את צפיפות הציפוי האופטימלית עבור בדיקת MTS עבור קווי תאים אלה.
2. בקרת טיפול מדומה
   1. הוסף 25 μL של בינוני לכל באר כדי לדמות את התוספת של תרכובת הבדיקה במבחן MTS.
      הערה: בבדיקת MTS בפועל, 25 μL מתוך מלאי פי 4 של ריכוז הטיפול שנבחר עבור תרכובת הבדיקה (כאן אפנן קולטן GABA_A , QH-II-066) יתווסף לתאים כדי לתת את ריכוז הטיפול הסופי 1x בנפח כולל של 100 μL לכל באר.
   2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 בסביבה לחה למשך 48 שעות. זה מדמה דגירה סטנדרטית בנוכחות תרופה.
3. בדיקת MTS
   1. הפשיר את aliquots הנדרש של מגיב MTS. הוסף 20 μL של מגיב MTS לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 בסביבה לחה למשך שעה אחת.
   2. צנטריפוגו את הצלחת (1,350 x גרם למשך 5 דקות) בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות, שעלולות להפריע לקריאת הספיגה.
      הערה: הסר בועות באמצעות מחט עדינה.
   3. קרא את הספיגה ב 490 ננומטר. שמור את הנתונים כקובץ Excel.
   4. להחזיר את הלוחות ל 37 ° C ב 5% CO₂, ולקרוא שוב ושוב בתוך 4 שעות טווח ליניארי של הבדיקה.
      הערה: אין צורך לבצע צנטריפוגה מחדש לפני קריאת הספיגה. נתונים מקריאות מאוחרות יותר, במיוחד קריאה של שעתיים, עשויים להיות חשובים לבחינת המהירות שבה קו תא מעכל את מגיב MTS והם שימושיים בבחירת מספר התאים לצלחת עבור הבדיקה.
   5. התווה את צפיפות הספיגה האופטית (OD) ב- 490 ננומטר (OD₄₉₀) לעומת מספר התא המצופה באמצעות Excel או Prism.
   6. בחר את מספר התא עבור הבדיקה. מספר התאים האופטימלי יהיה בטווח הליניארי ומתחת לרוויה (OD₄₉₀ = 1).
      הערה: עבור תאים עם צמיחה איטית, ניתן לכוונן את מספר התאים הגבוה ביותר המצופה ל- 20,000 תאים לבאר, וניתן להשאיר 500 תאים לבאר מחוץ לבדיקה.
4. קביעת IC₅₀
   1. יום 1: צלחת את התאים לבדיקת MTS
      1. רשום את שם שורת התא ומספר המעבר של כל שורה במחקר. כדי להתמודד עם אידוי במהלך הבדיקה, לכל הפחות, מלא את השורות החיצוניות ההיקפיות העליונות והתחתונות ואת העמודות ההיקפיות השמאליות והימניות הסופיות של לוח 96 הקידוחים עם 1x PBS, 100 μL לכל באר, כדי להתמודד עם אידוי במהלך הבדיקה.
      2. לוח את מספר התאים האופטימלי עבור כל קו תא כפי שנקבע לפני תחילת הבדיקה. צלחת את התאים ב 75 μL לכל באר של פנול אדום ללא אנטיביוטיקה מדיום שאינו מכיל חיץ HEPES. ניתן להגדיל את ה- FBS ל -20% כדי לתמוך בצמיחה של קווי התא.
         הערה: משתמשים באדום פנול חסר בינוני מכיוון שחשיפה לאדום פנול מעכבת את חדירות הממברנה.
      3. צלחת את הדגימה לפחות quintuplicate עבור ריכוז הטיפול. ספור את התאים באמצעות hemocytometer ידני או אוטומטי.
         הערה: כדי להשתמש בהמוציטומטר ידני, (1) להכין דילול 1:1 של תאים מרחפים בתווך בכחול טריפאן; (2) לדגור 5-15 דקות, בהתאם לקו התא; (3) להעמיס 10 מיקרוליטר של התאים בכחול טריפאן לתוך תא ספירת ההמוציטומטר; (4) לספור את התאים הקיימים בארבע הפינות ובריבועי האמצע, ולקבוע את מספר התאים הממוצע לריבוע; (5) לחשב את התאים בני קיימא למיליליטר באופן הבא:
         תאים קיימא למ"ל = תאים קיימא ממוצעים × 2 (גורם דילול) × 10⁴
      4. השתמש בנפח מספיק כדי להכין את ריכוז התאים הרצוי בתווך ללא פנול אדום, ללא אנטיביוטיקה שאינו מכיל חיץ HEPES (כלומר, 75 מיקרוליטר לבאר x 60 בארות לצלחת = 4.5 מ"ל תאים לצלחת).
         הערה: לכל לוח צריכה להיות בקרה בינונית בלבד עבור חיסור הרקע. הבקרה הבינונית יכולה להחליף את בארות PBS במידת הצורך.
   2. יום 2: הוספת תרכובת הטיפול
      1. הכינו את טיפולי הניסוי בריכוז הסופי הרצוי פי 4 מהריכוז הסופי הרצוי כדי לתת את הריכוז הסופי הרצוי כאשר מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסות טיפול לתאים המצופים ב 75 מיקרוליטר של תווך (= 100 מיקרוליטר נפח כולל לכל באר).
      2. הכן את פתרונות הבדיקה (במקרה זה, אפנן קולטן GABA_A QH-II-066) על ידי דילול סדרתי של המניות בריכוז הגבוה ביותר. לדוגמה, אם ריכוזי התרופה הסופיים צריכים להיות 5.0 מיקרומטר, 2.5 מיקרומטר, 1.25 מיקרומטר, 0.625 מיקרומטר ו-0.3125 מיקרומטר, הכינו דילולים סדרתיים ביחס של 1:1 החל מ-20 מיקרומטר כדי לקבל ריכוזים של 10 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 2.5 מיקרומטר ו-1.25 מיקרומטר, בהתאמה.
         הערה: כל צלחת דורשת שני פקדים מבוססי תאים בנוסף לבקרה בינונית בלבד: תאים לא מטופלים (בינוניים בלבד) ותאים שטופלו בממס (לעתים קרובות DMSO) בריכוז ידוע. מומלץ לוודא שהרכב אינו משפיע על התפשטות התאים בטווח הפעיל של התרכובת.
      3. לאחר הוספת תרכובת הבדיקה, לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ בסביבה לחה במשך 48 שעות.
   3. יום 3: ביצוע בדיקת התפשטות התאים (MTS)
      1. חשב את נפח מגיב MTS הדרוש (20 μL לכל 100 μL של תרבית בדיקה), והפשיר את הנפח הנדרש של מגיב MTS aliquoted (ראה טבלת חומרים).
      2. מערבולת, ולוודא כי מגיב הוא לגמרי פתרון לפני השימוש. פיפט את המגיב המופשר לתוך מאגר ריאגנטים סטרילי של 25 מ"ל.
      3. Pipet 20 μL של מגיב MTS (באמצעות פיפטה רב ערוצית) לתוך כל באר של צלחת 96 באר המכילה דגימות ב 100 μL של מדיום תרבית.
      4. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 בסביבה לחה למשך שעה עד 4 שעות. ניתן לקרוא צלחות במספר נקודות זמן. בדרך כלל, הלוחות נקראים בשעה אחת ובשעה 2 שעות או 3 שעות.
      5. בועות בתווך יכולות להוביל לתוצאות שגויות. לפני הקריאה בקורא הצלחות, סובבו את הצלחת במהירות של 1,350 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחט או קצה פיפטה ניתן להשתמש כדי להסיר את כל הבועות שנותרו לאחר צנטריפוגה.
      6. מדוד את הספיגה ב- 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות מתאים או ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים).
      7. שמור את הנתונים כקובץ Excel.
         הערה: זמן הדגירה בנוכחות תרכובת הבדיקה ישתנה בהתאם לקצב חילוף החומרים וצמיחת קו התאים הנחקר, בנוסף לתרכובת הנבדקת. תקופת דגירה של 48 שעות היא נקודת התחלה טובה עבור רוב קווי התאים ותרכובות הבדיקה.
5. ניתוח נתונים
   1. העבר את הנתונים בקובץ Excel וארגן את הנתונים עבור כל שכפול על-ידי הגדלת ריכוז תרכובת הבדיקה. ממוצע ערך הבקרה הבינוני בלבד, והפחת ערך זה מנתוני הניסוי.
   2. קבע את אחוז התפשטות התאים בבארות הטיפול בהשוואה לבארות הרכב (או בארות בקרה מטופלות בממסים) על ידי הגדרת הבקרה ל -100% התפשטות עבור כל שכפול.
   3. העבר את הנתונים שנוצרו ב- Excel לתוכנית לפי בחירה. המחברים משתמשים בדרך כלל בתוכנת פריזמה (ראו טבלת חומרים) כדי לקבוע את ריכוז התרופה המעכבת את התפשטות התאים ב-50% (IC₅₀).
   4. בתוכנת Prism, צור טבלת נתונים עם עמודת X כמספרי תאים ו- Y עמודה כ- OD הממוצע עבור חמישה ערכים משוכפלים בעמודות משנה זו לצד זו.
   5. הזן את ערכי ריכוז הטיפול בעמודה X בעת ניתוח טיפול תרופתי. תייגו את ציר ה-x בשם תרכובת הטיפול וביחידות הריכוז.
   6. הזן את ערכי הכדאיות התא המשוכפלים המחושבים מניתוח Excel לעמודות המשנה Y. תייגו את ציר ה-y כהתפשטות תאים (%).
   7. בעזרת כלי הניתוח, בחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) תחת ניתוחי XY.
   8. בחר מנה-תגובה [עיכוב] לעומת תגובה מנורמלת- שיפוע משתנה.
   9. בצע את פונקציית הניתוח. הצג את טבלת התוצאות כדי לראות את ערכי ההתאמה הטובה ביותר המחושבים עבור IC₅₀ וגרף התאמת העקומה. ניתן לשנות את ציר ה-x של הגרף לקנה מידה של יומן לפי הצורך.

למעלה ישנם הליכים נבחרים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין תעלות יונים בתאים סרטניים. הפרוטוקול הראשון מדגיש את הצביעה של תעלת יונים. כפי שמפורט, ישנם אתגרים רבים בעת צביעת תעלת יונים או, לצורך העניין, כל חלבון שנמצא בקרום החוץ תאי. באיור 1 מוצגת צביעה עבור תת-יחידה של קולטן GABAA הפנטמרי. הפרוטוקול השני מדגיש את תוצאות בדיקת המצב המקוטב של המיטוכונדריה בתאים סרטניים. מיטוכונדריה ממלאים תפקידים חיוניים לקיום התאים ולהתרבותם, כמו גם למוות תאי. בתאי יונקים, מיטוכונדריה מפעילים אפופטוזיס בתגובה לעקה תאית באמצעות שחרור חלבונים ממשפחת Bcl-2 הנמצאים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. בציטוזול, חלבונים ממשפחת Bcl-2 מפעילים פרוטאזות קספז, המתווכות מוות תאי מתוכנת. שינויים בתפקוד תעלת היונים של קרום הפלזמה יכולים לגרום להפרעה בהומאוסטזיס היונים התוך-תאי, כולל במונחים של רמות היונים בתוך המיטוכונדריה, מה שעלול להוביל לאובדן פוטנציאל הממברנה, ובכך לגרום לאפופטוזיס14. רמות Ca2+, K+, Na+ ו-H+ הן גורמים חשובים באיתות אירועים שיכולים לגרום למוות תאי יזום במיטוכונדריה. באיור 2 מוצג צביעה בצבע TMRE החדיר לתאים ובעל מטען חיובי כדי לתייג ולצלם את פוטנציאל הממברנה במיטוכונדריה פעילה, אשר שומרים על מטען שלילי21,22. TMRE הוא צבע אדום-כתום שנקשר למיטוכונדריה פעילה בגלל המטען השלילי היחסי שלהם. למיטוכונדריה דה-פולריים או לא פעילים יש פוטנציאל מופחת של הממברנה, ולכן הם אינם מצליחים לבודד TMRE. בניסוי זה, FCCP מפרק היונופורים הוא בקרה חשובה, שכן הוא מנטרל את הממברנות המיטוכונדריאליות, ובכך מונע הצטברות של TMRE23. הפרוטוקול השלישי מדגיש אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי חד-תאי. באיור 3 מוצגות הקלטות מייצגות של עקבות שהוקלטו מקו תאי המדולובלסטומה D283 שמקורו במטופל. לבסוף, הפרוטוקול הרביעי מדגיש בדיקה כדי לקבוע את מצב התפשטות התאים הסרטניים. באיור 4 מוצגים פרטים על אופן הפעולה של בדיקת MTS ואיור של הצלחת והקריאה כאשר היא מודגרת עם סוכן שפוגע ביכולת הקיום של התאים הסרטניים הנחקרים (במקרה זה, DAOY).

איור 1: צביעת תאים עבור תעלות יונים. (A) צביעה של החלבון Gabra5, תת-יחידה של קולטן GABAA, בתאי סרטן מדולובלסטומה D283. (B) תאים קבועים המטופלים בכתם פלואורסצנטי 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), הנקשר לדנ"א. (C) מיזוג של תאי סרטן מדולובלסטומה מוכתמים הן עבור Gabra5 והן עבור DAPI. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. האיור נלקח מתוך Kallay et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה . (A) תאי סרטן מדולובלסטומה חיים מסוג D283 מטופלים בריכוזים הולכים וגדלים של התרופה QH-II-066. לאחר מכן התאים מטופלים ב-TMRE טעון חיובית, חדיר לתאים (tetramethylrhodamine, ethyl ester), אשר מצטבר במיטוכונדריה פעילה (בעלת מטען שלילי). מיטוכונדריה דה-פולריים או לא פעילים הפחיתו את פוטנציאל הממברנה, ולכן אינם מצליחים לשמור על צבע ה-TMRE; כתוצאה מכך, הם מראים אות פלואורסצנטי נמוך. מצולם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי; FCCP (קרבוניל ציאניד 4-[trifluoromethoxy] פנילהידראזון). שיא: λex, 549 ננומטר; λem, 575 ננומטר. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) כימות צביעת TMRE (תמונות המוצגות בלוח A) באמצעות פלטפורמת התוכנה. הנתונים מוצגים כממוצע וכשגיאת התקן של הממוצע. האיור נלקח מתוך Kallay et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. (A) מוצג מתקן או מתקן Port-a-Patch, המורכב מכלוב פאראדיי (a), תא הקלטה (b) ויחידת יניקה (c, מימין). (B) מבט מלמעלה על מתקן Port-a-Patch המדגיש את תא ההקלטה המצויד בכניסת זילוח (a), שקע (b) ואלקטרודת ייחוס (c). (C) ה-Port-a-Patch מחובר למערכת זילוח מהירה להחלפת פתרונות עם מצבי פעולה אוטומטיים וידניים ומאגרי פתרונות. (D) מעקב זרם מייצג מהקלטה אלקטרופיזיולוגית של מהדק טלאי שלם באמצעות מתקן Port-a-Patch (Nanion) ותאי סרטן מדולובלסטומה D283. GABA (10 מיקרומטר) הוחל עבור 5 שניות עם פוטנציאל החזקה של -80 mV. (E) מעקב זרם מייצג מהקלטה אלקטרופיזיולוגית של מהדק טלאי שלם באמצעות מתקן Port-a-Patch (Nanion) ותאי סרטן מדולובלסטומה D283 עם יישום משותף של GABA (1 מיקרומטר) ואגוניסט קולטן GABAA (הרדמה כללית) פרופופול (50 מיקרומטר), אשר מגביר את הזרם המושרה על ידי GABA בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בדיקת MTS להערכת עוצמת התרופה. (A) תגובות כימיות העומדות בבסיס "בדיקת MTS" המשמשות להערכת עוצמתו של סוכן, כפי שהן משתקפות על-ידי הפחתה בהתפשטות תאים. הפחתה של MTS tetrazolium על ידי תאים כי הם קיימא, יצירת צבע formazan. (B) צלחת של 96 בארות המציגה את התוצאות הקולורימטריות של בדיקת MTS עם עלייה בריכוזי התרופות. בניסוי זה, תאי סרטן DAOY medulloblastoma מטופלים בריכוזים הולכים וגדלים של תרופה פרה-קלינית, KRM-II-08, אפנן אלוסטרי חיובי של קולטן GABAA. (C) עקומת מנה-תגובה הנוצרת עם בדיקת MTS (מכימות צלחת 96 בארות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: השוואה בין מערכות אלקטרופיזיולוגיה ידניות לעומת אוטומטיות למחצה ו/או אוטומטיות לחלוטין.

D.A.P.K. הוא מייסד שותף, נשיא ומנכ"ל של Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. הוא מייסד שותף של Amlal Pharmaceuticals Inc. ויושב במועצת הפיקוח על בטיחות התרופות של Bexion Pharmaceuticals, Inc. .