מאמר שיטה

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 ביוני 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca2+ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca2+, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.

מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים5. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לפיכך, שני תאים מימיים נוצרים על ידי ממברנות אלה: החלל intermembrane ואת המטריצה. ניתן לחלק עוד יותר את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לחלקים שונים. קרום הגבול הפנימי נשאר בסמיכות לקרום החיצוני, והקריסטה יוצרת פלישות. מה שנקרא צמתי קריסטה מחברים בין קרום הגבול הפנימי לבין הקריסטה (איור 1). יתר על כן, מיקרוגרפים אלקטרוניים של מיטוכונדריה מכווצים אוסמוטית מגלים כי קיימים אתרים שבהם קרומי המיטוכונדריה מחוברים באופן הדוק 6,7. אתרי המגע האלה כביכול נוצרים על-ידי קומפלקסים חלבוניים המשתרעים על פני שני הממברנות (איור 1). נהוג לחשוב כי אתרי אינטראקציה אלה חיוניים לקיום התא בשל חשיבותם לוויסות הדינמיקה והתורשה של המיטוכונדריה, כמו גם להעברת מטבוליטים ואותות בין הציטוזול למטריצה8.

קומפלקס MICOS בקרום הפנימי של המיטוכונדריה הוא כנראה המאופיין ביותר והמורכב הרב-תכליתי ביותר ליצירת אתרי מגע. MICOS תואר בשמרים בשנת 2011, והוא מורכב משש תת-יחידות 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 ו-Mic10. אלה יוצרים קומפלקס של כ 1.5 MDa אשר מתמקם לצמתיםcrista 9,10,11. המחיקה של אחת מתת-יחידות הליבה, Mic10 או Mic60, מובילה להיעדרו של קומפלקס 9,11, כלומר שתי תת-יחידות אלה חיוניות ליציבות של MICOS. באופן מעניין, MICOS יוצר לא רק אתר מגע אחד אלא גם אתרי מגע מרובים עם חלבונים וקומפלקסים שונים של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה: קומפלקס TOM 11,12, קומפלקס TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, קומפלקס Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM4510 ומירו 17. זה מצביע מאוד על כך שקומפלקס MICOS מעורב בתהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כגון ייבוא חלבונים, מטבוליזם של פוספוליפידים ויצירת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי18. הפונקציה האחרונה היא ככל הנראה הפונקציה העיקרית של MICOS, שכן היעדר קומפלקס MICOS המושרה באמצעות מחיקה של MIC10 או MIC60 מוביל לאולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי חריג שחסר כמעט לחלוטין קריסטה סדירה. במקום זאת, שלפוחיות קרום פנימיות ללא חיבור לקרום הגבול הפנימי מצטברות19, 20. חשוב לציין, MICOS נשמר בצורה ובתפקוד משמרים לבני אדם21. הקשר של מוטציות בתת-יחידות MICOS עם מחלות אנושיות קשות מדגיש גם את חשיבותו לאיקריוטים גבוהים יותר22,23. למרות ש-MICOS הוא רב-תכליתי ביותר, חייבים להתקיים אתרי קשר נוספים (בהתבסס על התצפיות שלנו שלא פורסמו). ואכן, זוהו מספר אתרי מגע אחרים, למשל, מכונות האיחוי המיטוכונדריאלי Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 או Mdm31-Por1, המעורבות בביוסינתזה של קרדיוליפין פוספוליפיד 27 ספציפי למיטוכונדריה. לאחרונה, שיפרנו את השיטה שהובילה אותנו לזיהוי MICOS לזיהוי Cqd1 כחלק מאתר קשר חדשני שנוצר עם קומפלקס הממברנה החיצונית Por1-Om1428. באופן מעניין, נראה כי אתר מגע זה מעורב גם בתהליכים מרובים כגון הומאוסטזיס של קרום המיטוכונדריה, מטבוליזם של פוספוליפידים והתפלגות קואנזים Q28,29.

כאן, השתמשנו בווריאציה של השבר שתואר קודם לכן של מיטוכונדריה 9,30,31,32,33. טיפול אוסמוטי במיטוכונדריה מוביל לשיבוש הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ולהתכווצות חלל המטריצה, מה שמשאיר את שני הקרומים רק בסמיכות באתרי מגע. זה מאפשר יצירת שלפוחיות המורכבות אך ורק מהקרום החיצוני של המיטוכונדריה או מהקרום הפנימי של המיטוכונדריה או באתרי מגע של שני הממברנות באמצעות סוניקציה קלה. בשל היחס בין חלבון לשומנים בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מציגות צפיפות גבוהה יותר בהשוואה לשלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה. ההבדל בצפיפות יכול לשמש להפרדת שלפוחיות הממברנה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ציפה סוכרוז. לפיכך, שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה מצטברות בריכוזי סוכרוז נמוכים, בעוד שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מועשרות בריכוזי סוכרוז גבוהים. השלפוחיות שמכילות אתרי מגע מתרכזות בריכוזי סוכרוז בינוניים (איור 2). הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט שיטה משופרת זו, הדורשת פחות ציוד, זמן ואנרגיה מיוחדים בהשוואה לשיטה32 שהוקמה בעבר, ומספק כלי שימושי לזיהוי חלבונים אפשריים באתר המגע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מאגרים ופתרונות מלאי

  1. הכינו תמיסת 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) במים שעברו דה-יוניזציה, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. הכן 500 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים deionized, pH 8.0. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו סורביטול 2.4 מ 'במים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
  4. מכינים סוכרוז 2.5 מ 'במים deionized. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
  5. הכינו 200 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) באיזופרופנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
    אזהרה: PMSF רעיל בבליעה וגורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
  6. הכינו 72% חומצה טריכלורואצטית (TCA) במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    אזהרה: TCA עלול לגרום לגירוי נשימתי, כוויות עור חמורות ונזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
  7. הכן את מאגר SM: 20 mM MOPS ו 0.6 M סורביטול, pH 7.4.
  8. הכינו את מאגר הנפיחות: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4.
  9. הכינו את מאגרי הסוכרוז ההדרגתיים: 0.8 M, 0.96 M, 1.02 M, 1.13 M ו-1.3 M סוכרוז ב-20 mM MOPS, ו-0.5 mM EDTA, pH 7.4.
    הערה: ניתן לאחסן את כל המאגרים ב- 4 °C; עם זאת, מומלץ לאחסן את המאגרים המכילים סוכרוז ב -20 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיחה פטרייתית. יש להוסיף את מעכבי הפרוטאז טריים לפני השימוש.

2. יצירת שלפוחיות הגשה

  1. בודדו את המיטוכונדריה של שמרים גולמיים טריים על פי פרוטוקולים 34,35 שנקבעו.
    הערה: עבור ניסוי זה, מיטוכונדריה בודדו מ Saccharomyces cerevisiae. אין צורך ביצירת מיטוכונדריה טהורה הדרגתית נטולת אברונים אחרים.
  2. השהה מחדש 10 מ"ג של מיטוכונדריה מבודדת טרייה במאגר SM של 1.6 מ"ל (4°C) על-ידי פיפטינג (איור 2, שלב 1).
  3. מעבירים את המתלה המיטוכונדריאלי לצלוחית Erlenmeyer מקוררת מראש בנפח 100 מ"ל.
  4. להוסיף לאט 16 מ"ל של חיץ נפיחות באמצעות פיפטה זכוכית 20 מ"ל. יש למרוח ערבוב עדין קבוע על קרח במהלך התוספת. טיפול אוסמוטי זה גורם לספיגת מים לחלל המטריצה. הנפיחות של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה תשבש את הקרום החיצוני. אולם שני הקרומים יישארו בקשר באתרי הקשר9 (איור 2, שלב 2).
  5. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין מתמיד במשך 30 דקות על קרח.
  6. הוסיפו באיטיות 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ"ל באמצעות פיפטת זכוכית 5 מ"ל כדי להעלות את ריכוז הסוכרוז בדגימות לכ-0.55 מ'. טיפול אוסמוטי זה גורם לשטף מים מהמטריצה36. התכווצות הקרום הפנימי נועדה למקסם את מרחקו לשברים השיוריים של הקרום החיצוני. זה מקטין את ההסתברות ליצור בועיות היברידיות מלאכותיות של קרומים פנימיים וחיצוניים באמצעות סוניקציה (איור 2, שלב 3).
  7. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין במשך 15 דקות על קרח.
  8. העבירו את המיטוכונדריה לסוניקציה כדי ליצור בועיות קרום כניעה (איור 2, שלב 4).
    1. מעבירים את התרחיף המיטוכונדריאלי לתא רוזטה מקורר מראש.
    2. הפעילו את המתלה המיטוכונדריאלי באמפליטודה של 10% למשך 30 שניות תוך קירור תא הרוזטה באמבט קרח.
    3. הניחו את המתלה למשך 30 שניות באמבט קרח.
    4. חזור על שלב 2.8.2 ושלב 2.8.3 שלוש פעמים נוספות.
      הערה: תנאי הסוניקציה ישתנו בהתאם לסוניק שבו נעשה שימוש. אופטימיזציה יהיה צורך עבור מכונות בודדות. סוניקציה קשה מדי תוביל להיווצרות מלאכותית של שלפוחיות המורכבות מממברנות פנימיות וחיצוניות של המיטוכונדריה.

3. הפרדת שלפוחיות submitochondrial

  1. יש להפריד את השלפוחיות שנוצרו מהמיטוכונדריה הנותרת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. המיטוכונדריה השלמים ייפלטו ואילו השלפוחיות יישארו בסופרנטנט.
  2. רכזים את תערובת השלפוחית.
    1. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה טריים.
    2. טען כרית של 0.3 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ 'בתחתית הצינור באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד צינורית 0.8 מ"מ x 120 מ"מ.
    3. צנטריפוגה ב 118,000 x גרם במשך 100 דקות ב 4 ° C.
      הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
  3. השלפוחיות יופיעו כדיסק בחלק העליון של כרית הסוכרוז לאחר הצנטריפוגה. השליכו כ-90% מהסופרנטנט. כעת, קצרו את הבועיות המרוכזות על ידי השעייתן מחדש במאגר שנותר כולל סוכרוז באורך 2.5 מ' על ידי פיפטציה מעלה ומטה. מעבירים את המתלה להומוגנייזר Dounce קר כקרח.
  4. הומוגניזציה של ההשעיה עם לפחות 10 שבץ באמצעות קדר polytetrafluoroethylene .
  5. מכינים את שיפוע הסוכרוז.
    1. עבור שיפוע מדרגות של 11 מ"ל עם חמישה שלבים (1.3 מ', 1.13 מ', 1.02 מ', 0.96 מ' וסוכרוז 0.8 מ' ב-20 מ"מ MOPS ו-0.5 מ"מ EDTA, pH 7.4), בכל שכבה יש 2.2 מ"ל של תמיסת סוכרוז.
      הערה: מומלץ להשתמש ברפרקטומטר כדי למדוד ולהתאים את ריכוזי הסוכרוז; עם זאת, זה לא חיוני. החל 10 μL של המאגר על הרפרקטומטר, וזהה את מדדי השבירה המתאימים. חישוב ריכוז הסוכרוז הוא כדלקמן:
      משוואת ריכוז סוכרוז במולריות; תרשים לניתוח מדידת מקדם שבירה.
      1.3333 מייצג את מדד השבירה של המים. 0.048403 הוא מדד המרה ספציפי לסוכרוז המתקבל מקנה מידה ליניארי של שבירה מולרית לריכוז סוכרוז בתמיסות מימיות 37.
    2. הוסף את ריכוז הסוכרוז הגבוה ביותר לצינור הצנטריפוגה, ושים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס. המתינו עד שהשכבה תוקפא לחלוטין לפני החלת השכבה הבאה. המשיכו בהתאם עד להוספת השכבה האחרונה, ואחסנו את מעברי הצבע ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: זכור להעביר את מעברי הצבע הקפואים ל- 4 ° C בעת תחילת הניסוי כדי לאפשר למעברי הצבע להפשיר. זה ייקח בערך 3 שעות. עבור הצנטריפוגה כאן, רוטור דלי מתנדנד עם קיבולת של 13.2 מ"ל שימש. כאשר משתמשים ברוטור אחר, יש להתאים את נפחי מדרגות השיפוע בהתאם.
  6. למדוד את ריכוז הסוכרוז של הדגימות באמצעות רפרקטומטר. אם אין גישה לרפרקטומטר, אפשר לחילופין להניח שריכוז הסוכרוז הוא 2 מ'. ריכוז סוכרוז משוער זה יהיה הבסיס לשלב הבא.
  7. כוונן את ריכוז הסוכרוז ל 0.6 M על ידי תוספת של כמות מתאימה של 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4. אם ריכוז הסוכרוז מוערך כ-2 מ' במקום להימדד, מומלץ לבדוק האם הריכוז נמוך מספיק לאחר ההתאמה. החל aliquot קטן של הדגימה (כ 50 μL) על גבי 200 μL של 0.8 M סוכרוז במבחנה. הדגימה חייבת להישאר על גבי סוכרוז 0.8 M.
  8. טען את הדגימות (כ -1 מ"ל) על גבי שיפוע הסוכרוז (שמור 10% להתייחסות מאוחרת יותר). צנרת זהירה חשובה כדי למנוע הפרעה של שיפוע (איור 2, שלב 5).
  9. להפריד את שלפוחיות על ידי צנטריפוגה ב 200,000 x גרם ו 4 ° C במשך 12 שעות. במידת האפשר, כוונו את הצנטריפוגה להאטה ולהאטה כדי למנוע הפרעה של השיפוע (איור 2, שלב 6).
    הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
  10. קצרו את השיפוע מלמעלה למטה בשברים של 700 מיקרוליטר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. התוצאה תהיה 17 שברים, מה שמאפשר רזולוציה מספקת.

4. ניתוח שלפוחיות submitochondrial

  1. רכז את החלבונים על ידי חשיפת כל שבר לשני משקעי TCA38 המבוצעים ברצף כדי להכין את דגימות SDS-PAGE.
    1. הוסף 200 μL של 72% TCA לשברים בודדים, וערבב עד התמיסה הומוגנית. לדגור על השברים במשך 30 דקות על קרח, ולזרוק את החלבונים המושקעים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת TCA 28%, ערבבו היטב וחזרו על שלב הצנטריפוגה.
    2. שטפו את הכדוריות עם 1 מ"ל אצטון (-20°C), וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20,000 x גרם ו-4°C. השליכו את הסופרנטנט, ותנו לכדוריות להתייבש. השהה מחדש את הכדוריות ב 60 μL של מאגר דגימת SDS, ודגר על הדגימות במשך 5 דקות ב 95 ° C.
      הערה: כמות גדולה של סוכרוז תישאר, במיוחד בשברים בעלי צפיפות גבוהה, לאחר משקעי TCA הראשונים. זה יוסר באמצעות משקעים TCA נוספים.
  2. נתח 20 μL של כל שבר על ידי SDS-PAGE39 ו immunoblotting40,41,42,43.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.

בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר בהשוואה למעברי צבע של צעדים. עם זאת, הייצור שלהם לשחזור הוא מייגע דורש ציוד מיוחד. לכן, ביססנו שיטה ליצירת שיפוע צעדים עם הבדלים קטנים יחסית בין השלבים הבודדים (ראה שלב 3.5). שיערנו כי שיפוע המדרגות יאוזן בצנטריפוגה, וכתוצאה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו32. כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המשאבות והקונסטרוקציות הבודדות ששימשו ליציקה ולקציר של השיפוע הליניארי ושינינו לשיפוע מדרגה. חשוב לציין שהבנו שלפחות כאשר מכינים אותו כפי שמתואר כאן, השיפוע הופך ליניארי במהלך הצנטריפוגה, מה שהופך אותו לתחליף תקף. שיטה זו (i) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H. מודה ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), פרויקט מספר 413985647, לתמיכה כספית. המחברים מודים לד"ר מיכאל קיבלר, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, על תמיכתו הנדיבה והנרחבת. אנו אסירי תודה לוולטר נויפרט על תרומתו המדעית, הדיונים המועילים וההשראה המתמשכת שלו. J.F. מודה לבית הספר למוסמכים במדעי החיים במינכן (LSM) על התמיכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
13.2 מ"ל, צינור פתוח דק דופן אולטרה-ברור, 14 x 89 מ"מBeckman Instruments, גרמניה344059
50 מ"ל, צינור פוליקרבונט פתוח עם קיר עבה, 29 x 104 מ"מBeckman Instruments, גרמניה363647
A-25.50 רוטור זווית קבועה- אלומיניום, 8 x 50 מ"ל, 25,000 סל"ד, 75,600 x גרםBeckman Instruments, גרמניה363055
Abbe רפרקטומטרZeiss, גרמניההופסקה,
ניתן להשתמש בכל רפרקטומטר Abbe
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, ארה"בBR26320הופסק,
כל בקר פיפט יספיק
1000 מ"לDWK Life Science, גרמניהC118.1
ברנסון  סוניפייר דיגיטלי W-250 Dברנסון אולטרסאונד, ארה"בFIS15-338-125
ברנסון אולטרסאונד 3 מ"מ TAPERED MICROTIPברנסון אולטרסאונד, ארה"ב101-148-062
ברנסון אולטרסאונד 200 ו-400 וואט: תא קירור רוזטהברנסון אולטרסאונד, ארה"ב15-338-70
צנטריפוגה אוונטי JXN-26בקמן אינסטרומנטס, גרמניהB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, גרמניה8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth , גרמניה6213
EDTA (חומצה אתילנדיאמין-טטראצטית דיסודיום מלח דיהידרט)Roth , גרמניה8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth , גרמניהX747.1
פיפטה מדורגת, ק"ל ב', 25:0, 0.1הירשמן, גרמניה1180170
פיפטה בוגרת, ק"ל ב', 5:0, 0.05הירשמן, גרמניה1180153
אמבטיית קרחneoLab, גרמניה  S12651
בוחש מגנטי RCT בסיסיIKA-Werke GmbH, גרמניהZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)גרבו, גרמניה1081
MyPipetman Select P1000גילסון, ארה"בFP10006S
MyPipetman Select P20גילסון, ארה"בFP10003S
MyPipetman Select P200גילסון, ארה"ב
Omnifix 1 מ"לבראון, גרמניה4022495251879
פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)סרווה, גרמניה32395.03
צינורית STERICAN 21 Gx4 4/5 0.8x120 מ"מבראון, גרמניהמוט
, 15 מ"מVWR, ארה"ב442-0366
סוכרוזמרק, גרמניהS8501
SW 41 Ti מתנדנד דלי רוטורבקמן אינסטרומנטס, גרמניה331362
מבחנותאפנדורף, גרמניה3810X
מטחנות רקמות, סוג פוטר-אלבהיים, כלי זכוכית 2 מ"לVWR, ארה"ב432-0200
מטחנות רקמות, סוג פוטר-אלבהיים, בוכנה 2 מ"ל עם קצה משונןVWR, ארה"ב432-0212
חומצה טריכלורואצטית ( TCA)סיגמא אולדריץ', גרמניה33731הופסק,
כל TCA יספיק (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, גרמניה4855
FP10005S ערבוב 4022495052414

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MICOSSDS Page

מאמרים קשורים