הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מניפולציה Tuina כדי להפחית דלקת ואובדן סחוס בחולדות osteoarthritis הברך

4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65451

⸱

30 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול למניפולציה של Tuina המבוצעת על חולדות אוסטיאוארתריטיס ברך המושרה על ידי גבס. בהתבסס על התוצאות הראשוניות, הוא הציע כי יעילות השיטה מסתמכת על הפחתת דלקת ואובדן סחוס.

תקציר

ניסויים קליניים מצביעים על כך שמניפולציה של Tuina יעילה בטיפול בדלקת מפרקים ניוונית של הברך (KOA), בעוד שנדרשים מחקרים נוספים כדי לגלות את המנגנון שלה. לכן, מניפולציה של מודלים בעלי חיים של osteoarthritis הברך הוא קריטי. פרוטוקול זה מספק תהליך סטנדרטי למניפולציה של Tuina על חולדות KOA וחקירה ראשונית של המנגנון של Tuina עבור KOA. שיטת מניפולציית הלחיצה והלישה (סוג של מניפולציה של טווינה המתייחסת ללחיצה ולישה של האזור הספציפי של משטח הגוף) מיושמת על 5 נקודות דיקור סביב מפרק הברך של חולדות. הכוח והתדירות של המניפולציה תוקנו על ידי רישומי לחץ אצבע, ומיקום החולדה במהלך המניפולציה מתואר בפירוט בפרוטוקול. השפעת המניפולציה ניתנת למדידה על ידי בדיקות התנהגות כאב וממצאים מיקרוסקופיים בסינוביאל ובסחוס. חולדות KOA הראו שיפור משמעותי בהתנהגות הכאב. ההסננה הדלקתית של הרקמה הסינוביאלית הופחתה בקבוצת טווינה, והביטוי של גורם נמק גידולי (TNF)-α היה נמוך משמעותית. בהשוואה לקבוצת הביקורת, אפופטוזיס כונדרוציטים היה פחות בקבוצת טווינה. מחקר זה מספק פרוטוקול סטנדרטי למניפולציה של Tuina על חולדות KOA והוכחה ראשונית לכך שההשפעות הטיפוליות של Tuina עשויות להיות קשורות להפחתת דלקת סינוביאלית ואפופטוזיס כונדרוציטים מאוחר.

מבוא

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא מחלה ניוונית המתבטאת בעיקר בכאבי מפרקים. פיברוזיס, סדקים, כיבים ואובדן סחוס מפרקי הם הגורמים העיקריים למחלה זו1. KOA יש שכיחות גבוהה עלולה לגרום השפעה עמוקה על חיי היומיום של החולים, גרימת נכות במקרים חמורים. בקרב אנשים בגילאי 45-84 שנים, שכיחות KOA עולה עם הגיל, והשכיחות בקרב אנשים בני 85 ומעלה היא 15%, עם דומיננטיות בקרב נשים 2,3. בנוסף, KOA עלול להביא נטל כלכלי רציני הן על הפרט והן על החברה. סקר הראה כי עלויות הבריאות הישירות על KOA לנפש הגיעו עד 8,858 $ ± 5,120 $ בשנה4. עם הזדקנות החברה, KOA הפך לבעיית בריאות עולמית ולנושא חברתי מרכזי, כמו גם נושא אקטואלי למחקר מדעי.

מחקרים מבוססי ראיות הראו את היעילות של מניפולציה Tuina בטיפול KOA5. מניפולציה Tuina יכול להקל על הכאב ולשפר תפקוד לקוי בחולי KOA, המנגנון של אשר קשור השפעות אנטי דלקתיות 6,7. חוקרים מצאו כי מניפולציה של Tuina עיכבה ביעילות את הביטוי של גורמים דלקתיים אינטרלוקין (IL)-β ו-5-hydroxytryptamine והאטה את התנוונות הסחוס המפרקי בארנב KOA מודל8. הוא הציע כי Tuina יכול לקדם את זרימת הדם ואת חילוף החומרים באתר הנגע, אשר עזר לנקות גורמים דלקתיים כגון IL-1, IL-6 וגורם נמק הגידול (TNF)-α, ובכך להקל על הסימפטומים הקליניים של KOA9. בנוסף, התנועה הפסיבית של המפרק באמצעות מניפולציה Tuina יכול לקדם את החדירה ואת הדיפוזיה של נוזל סינוביאלי לתוך הסחוס המפרקי ומשפר את חילוף החומרים המזינים רקמות10. מחקרים אחרים הצביעו על כך שמניפולציה של טווינה יכולה לשפר ביעילות את המדדים הביומכניים בחולי KOA11. מניפולציות המופעלות על רקמות רכות יכולות לשפר את פיזור הלחץ על הגפיים ולשפר את תפקוד שיווי המשקל12,13. יחד עם זאת, עם כמה מניפולציות התאמה משותפת, יישור הגפיים התחתונות יכול גם להיות מותאם לתקן הליכה חריגה14,15.

מנגנון הפעולה של מניפולציה Tuina בטיפול KOA עדיין צריך להיחקר, ולכן, מחקר ניסיוני הוא הכרחי. המפתח ליישום של טווינה בחיות ניסוי הוא סטנדרטיזציה של דוגמנות, קיבוע בעלי חיים ושיטות התערבות16. שיטת המידול קובעת אם חיית הניסוי יכולה להציג את מאפייני המחלה. בינתיים, שיטות קיבוע מתאימות יכול להקל על התערבות של מניפולציה Tuina לשקף טוב יותר את ההשפעה של Tuina. הסטנדרטיזציה של שיטות התערבות היא החלק הקשה ביותר של מניפולציה Tuina. בשנת 2010, המערכת הבסיסית של תקני הדיקור הסיני הזכירה את תקני נקודת הדיקור לבעלי חיים ניסיוניים, המספקים אפשרות לדיקור סיני וניתוחי טווינה בניסויים בבעלי חיים17. עם זאת, עדיין קיימים קשיים בסטנדרטיזציה של מניפולציה של טווינה. ישנם מספר סוגים של מניפולציה Tuina18. הבחירה במניפולציה הספציפית תלויה בעיקר במחלה שיש לטפל בה ובתיאוריות הטיפוליות שהמבצע מעדיף. במחקר של Tuina for KOA, תשומת לב רבה יותר הוקדשה למניפולציה של לחיצה נקודתית (לחיצה על נקודות הדיקור הספציפיות עם האגודל או המרפק), מניפולציית דחיפת Yizhichan (מניפולציית דחיפה על ידי נענוע האגודל), ומניפולציית לחיצה ולישה (המתייחסת ללחיצה ולישה של האזור הספציפי של משטח הגוף באמצעות אצבע או כף יד)19. מניפולציה של לחיצה ולישה היא אחת המניפולציות הנפוצות ביותר של טווינה, המשלבת לחיצה ולישה כדי להזיז את הרקמה התת עורית20. מניפולציה של לחיצה ולישה המיושמת על נקודות דיקור יכולה לקדם את זרימת הדם ולהקל על הכאב ומייצגת את ההשפעה הטיפולית של טווינה על KOA19.

בפרוטוקול זה יתוארו בפירוט פעולות המניפולציה של לחיצה ולישה על חולדות KOA, כולל נקודות דיקור נבחרות, עוצמת ותדירות המניפולציה ותנוחת הגוף של החולדה, כדי לספק התייחסות למחקר עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה עבר את סקירת האתיקה של בעלי חיים שנערכה על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים ניסיוניים של בית החולים Yueyang של רפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת המסונפת לאוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (YYLAC-2022-166).

1. הכנה וקיבוץ ניסיוניים של בעלי חיים

  1. הכנת בעלי חיים
    1. מאחור סך של 10 חולדות בריאות SPF SD של 200-220 גרם בטמפרטורת החדר (18-21 מעלות צלזיוס), לחות 40%-50%, 12 שעות: 12 שעות חילופי שעון ביולוגי. לערוך ניסויים בבעלי חיים הקשורים לכאב תוך ציות קפדני להוראות הרלוונטיות של הנחיות והנחיות אתיות של בעלי חיים.
  2. קיבוץ בעלי חיים
    1. חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצת טווינה ולקבוצת ביקורת. לטפל חולדות של קבוצת Tuina עם לחץ ולישה מניפולציה במשך 21 ימים לאחר דוגמנות. שימו חולדות מקבוצת הביקורת באותו חדר טווינה והניחו אותן בשקית בד שחורה בו זמנית בזמן שקבוצת טואינה עוברת טיפול.

2. דוגמנות של בעלי חיים

  1. הרדמת בעל החיים
    1. השתמש isoflurane להרדמה גז. הכניסו את החולדה לקופסת האינדוקציה עם ריכוז אינדוקציה של 3%. נדנדו את הקופסה לאחר הנחת החולדה ואשרו את ההרדמה כאשר החולדה מתהפכת ללא ניסיון לחזור למצב נוטה.
    2. הוציאו את החולדה מקופסת האינדוקציה וקיבעו את אפה במסכת ההרדמה. התאם את ריכוז האיזופלורן ל -2% כדי לשמור על הרדמה. אשרו את ההרדמה כאשר החולדה אינה מגיבה בעת צביטת כפותיה. מרחו משחת עיניים על החולדות כדי למנוע יובש כאשר חולדות מורדמות, מכיוון שלא ניתן לסגור את העפעפיים.
  2. שיטת מידול21
    1. השתמש במכונת גילוח כדי להסיר את שיער הגפה האחורית הימנית. הניחו כרית צמר גפן רפואית בין קרסול ימין למפרק הירך של החולדה. תקן את מפרק ברך ימין בהארכה של 180 מעלות עם 5-6 שכבות של תחבושת גבס רטובה באופן שווה. ספירלה עוטפת את תחבושת הגבס החל מהקרסול ומכסה 1/3 מקודמתה. השתמשו במייבש שיער כדי לייבש ולהקשיח את הטיח.
    2. עוטפים את הטיח בחומר בסיס תותבות לאחר שתחבושת הטיח מתייבשת ומתקשה כדי לקבע את הטיח ולמנוע ממנו לכרסם.
    3. ערבבו את חומרי הבסיס של התותבות כדי להפוך אותה לדביקה והדביקו את התערובת לחלק החיצוני של הטיח (התערובת לא תעלה על קצה התחבושת, איור 1). לאחר שהתערובת הופכת קשה, כבו את מכונת ההרדמה והמתינו עד שבעל החיים יתעורר באופן טבעי. השגיחו על החולדות כדי למנוע תאונות הרדמה לפני שהחולדות מתעוררות.
    4. קבע את הגבס כראוי על הגפה האחורית הימנית של החולדה, שכן קיבוע הדוק מגביל את זרימת הדם, בעוד קיבוע רופף נוטה ליפול. שימו לב למחזור הדם באיבר הטרמינלי. אם מתגלה נפיחות בגפיים הסופיות או בגוון עור סגול, יש לחתוך מיד חלק מהטיח כדי לסייע בשחזור זרימת הדם. צור מחדש את הטיח אם הוא שבור ולא מצליח לשמור על הארכת הגפה התחתונה.
    5. הסר את הטיח לאחר 3 שבועות של אימוביליזציה מתמשכת. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את חומר הבסיס תותבת בחוץ תחבושת גבס. שוטפים את הגפה התחתונה של החולדה במי מלח ומייבשים אותה בגזה. אם יש נגעים מקומיים בעור, לעקר עם יודופור.
  3. אימות דגם22
    1. אימות מבוסס רנטגן
      1. בצע בדיקת רנטגן של ברך ימין 1 יום לאחר סיום הדוגמנות. בצע צילומי רנטגן אנטרופוסטריוריים במצב שכיבה עם כיפוף מפרק הירך ב-30°, הארכת ברך ב-0°, וחטיפת מפרק הירך ב-15°. שמור את הפטלה ישירות מול הברך ושים את צינור הרדיאטור 110 מ"מ ממפרק הברך.
      2. קח צילומי רנטגן לטרליים במצב דקוביטוס לטרלי ימני עם כיפוף ירך ימין ב-30° והארכת ברך ימין ב-0°. בצע את כיפוף ירך הגפה השמאלית ב- 70°, וכיפוף הברך ב- 45°, והרחיקו את צינור הרדיאטור 110 מ"מ ממפרק הברך. הגדר את פרמטרי הזיהוי כמתח חשיפה 50 kV, זרם 250 mA, מינון חשיפה 32 mAs, וזמן חשיפה 128 ms.
      3. השוו עם צילום רנטגן רגיל של חולדות, בדקו שצילום הברך המעוצב מראה חלל מפרק צר יותר עם היפרפלזיה אוסטאופיטית בקצה.
    2. Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ציון23
      1. הכניסו את החולדה לקופסת המתת חסד ונתלוCO2 בקצב של 30%-70% נפח כלוב לדקה. הפסיקו לבלבלCO2 לאחר שהבחינו שהחולדה אינה ניידת, אינה נושמת, ושהאישון מורחב. שימו לב עוד 2 דקות כדי לאשר את המוות.
        הערה: נקע צוואר הרחם יכול להתבצע לאחר המתת חסד מבוססת CO2 כצורה משנית כדי לאשר את המוות. תקנו את החולדה על השולחן ואחזו בזנבה ביד אחת. לחץ כלפי מטה על ראשה של החולדה עם האגודל והאצבע המורה של היד השנייה. אשר את המוות בעת שמיעת צליל של סדק, והחולדה מאבדת תנועה ופעימות לב בו זמנית.
      2. תקן את החולדה במצב שכיבה עם מחט מזרק על לוח קצף עם הגפה האחורית הימנית מכופפת בחטיפה ובסיבוב חיצוני. צבטו את העור סביב מפרק הברך במספריים כירורגיים. חשוף את השרירים סביב מפרק הברך על ידי חיתוך העור ולאחר מכן חיתוך הפאשיה התת עורית.
      3. חותכים את עצם הירך ואת diaphysis השוקה עם מספריים עצם להסיר את מפרק הברך הימנית. הסר בעדינות את הרקמות הרכות הנוספות, כגון שרירים ורצועות, מחוץ למפרק.
      4. תקן את המפרק ב 4% paraformaldehyde במשך 24-48 שעות ב 4 ° C. decalcize את המפרק בתמיסת 10% חומצה פורמית במשך 3 ימים עד רקמת העצם ניתן לדקור בקלות עם מחט.
      5. מניחים וחותכים את הרקמה המסוידת במכסה האדים ומעבירים אותה לקופסת התייבשות במכונת ההתייבשות. הוסף 75% אתנול במשך 4 שעות, ואז 90% אתנול במשך 2 שעות, ואחריו 95% אתנול במשך 1 שעות, אתנול מוחלט במשך 30 דקות, סיבוב נוסף של אתנול מוחלט טרי במשך 30 דקות, בנזן אלכוהול במשך 5-10 דקות, קסילן במשך 5-10 דקות, סיבוב נוסף של קסילן טרי במשך 5-10 דקות, שעווה במשך 1 שעות, סיבוב נוסף של שעווה טרייה במשך 1 שעות, וסבב אחרון של שעווה טרייה למשך שעה להתייבשות וטבילת שעווה שקופה.
      6. לאחר מכן, הניחו את הרקמה במכונה להטמעה. חותכים את גוש השעווה לפרוסות שעווה של 4 מיקרומטר לאחר שהפרפין התייצב ומשטחים את הפרוסה במים חמים. מניחים את הפרוסה על מגלשת זכוכית ומייבשים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      7. התבונן בדגימת הסחוס ותן לה ציון בהתאם להערכת ציון היסטופתולוגיה של סחוס OA (טבלה 1)23. אם ציון החולדות לאחר הדוגמנות גבוה משמעותית מזה של החולדות הרגילות, הדוגמנות הייתה מוצלחת.

טבלה 1. הערכת ציון היסטופתולוגיה סחוס OA. דרגה היא התקדמות עומק לסחוס. ציון כולל = ציון x בימוי. 0 למפרקים תקינים, 24 לדלקת פרקים חמורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

figure-protocol-1
איור 1. חולדות משותקות בגבס. לאחר שהחולדות הורדמו, גפיהן התחתונות הימניות נעטפו בתחבושות גבס, קובעו במצב היפר-מורחב וכוסו בשכבה של חומרי בסיס תותבות בחוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מניפולציה Tuina

  1. אזור יישום
    1. בחרו בסך הכל 5 נקודות דיקור בגפה האחורית הימנית של חולדות, כולל ST34, ST35, SP10, EX-LE4 ו-BL40 (איור 2). אתר את נקודות הדיקור על פי עקרונות מיקום הדיקור ב 24.
  2. עמדה ליישום
    1. חותכים מטלית שחורה לשקית בגודל 9X15 ס"מ עם פתח צד אחד ומהדקים את הפתח בחבל. לפני המניפולציה של טווינה, משכו בעדינות את זנבה של החולדה כדי לגרום לה להתחפר בשקית ולחשוף את איבריה האחוריים מחוץ לתיק.
    2. השתמשו ביד אחת כדי להחזיק את החולדה במצב נוטה, להחזיק את הזנב ואת הרגל האחורית שלה, בעוד היד השנייה מפעילה מניפולציה של לחיצה ולישה על נקודת דיקור מסוימת (איור 3).
  3. מניפולציה של טווינה
    1. הפעל מניפולציה של לחיצה ולישה על 5 נקודות הדיקור בגפה האחורית הימנית למשך 2 דקות כל אחת. הניחו את האגודל של המבצעים על נקודת הדיקור שנבחרה כדי לבצע לחיצה ולישה קצובה, תוך הנעת העור והרקמה התת עורית יחד בתנועה מעגלית.
    2. השתמש בהקלטות לחץ אצבע (יחידות בניוטון) כדי להבטיח עוצמה ותדירות עקביות של המניפולציה. שמרו על העוצמה שבין 3-5 N והתדר על 2 הרץ (איור 4). החל את המניפולציה פעם ביום במשך 21 יום.

figure-protocol-2
איור 2. מיקום נקודות דיקור. SP10 ממוקם 5 מ"מ מעל מפרק הברך הפנימי בחולדות. ST34 ממוקם 5 מ"מ מעל מפרק הברך החיצוני בחולדות. EX-LE4 ממוקם בצד המדיאלי של רצועת הברך בחולדות. ST35 ממוקם בצד הצדדי של רצועת הברך בחולדות. BL40 ממוקם בנקודת האמצע של הפס הפופליטלי הרוחבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3. מניפולציה Tuina מוחל על חולדות. החולדות הוחזקו בשקית שחורה כשגפיהן האחוריות חשופות. המבצע החזיק את זנב החולדה ביד שמאל בעוד יד ימין ביצעה את המניפולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4. הקלטות לחץ אצבע. מכשיר המתעד את הכוח והתדירות של לחץ האצבע משמש למשוב בזמן אמת על העוצמה והתדירות בתהליך מניפולציית טווינה. (A) חיישן לחץ וציוד שידור. (B) רישומי לחץ אצבע. (ג) הכוח שנרשם במהלך מניפולציה של טווינא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מבחני התנהגות כאב

  1. בדיקת התנהגות כאב לפני ואחרי מידול, ויום אחד אחרי (D1), 7 ימים אחרי (D7), 14 יום אחרי (D14) ו-21 יום אחרי (D21) מניפולציית טווינה, כולל סף נסיגה מכני ובדיקות חביון משיכה כפות.
  2. סף משיכה מכני (MWT)
    1. הניחו את החולדות בחדרון זכוכית מחוסמת שקוף בגודל 20 ס"מ על 10 ס"מ על 20 ס"מ הממוקם על במה בגובה 40 ס"מ המורכבת מסריג תיל בגודל 10 מ"מ על 10 מ"מ צמצם. שמור על טמפרטורת החדר ב 23 °C ± 2 °C (75 °F).
    2. יישבו את החולדות במעבדה ההתנהגותית לפחות שעתיים ביום במהלך שלב הבדיקה ההתנהגותית כדי למנוע הפרעה לתוצאות הבדיקה עקב חוסר הסתגלות של בעלי החיים לסביבה בתחילת הבדיקה הרשמית. הכניסו את החולדות למעבדה התנהגותית למשך 30 דקות לפני תחילת הבדיקה הרשמית כדי להקל על הסתגלותן לסביבה ולהפחית גורמים מסיחי דעת.
    3. השתמש בסיבי Von Frey אלקטרוניים כדי למדוד את MWT. לגרות את החולדה עם הסיב במרכז כף הרגל שלה ולמשוך את הסיב כאשר החולדה מראה תנועות ברורות כגון הרמת הרגל והימנעות. המכשיר יכול להקליט באופן אוטומטי את ערך הלחץ המרבי (N) ברגע זה.
    4. התחל את הגירוי הבא באותה חולדה לפחות 15 שניות לאחר הגירוי הנוכחי. אין לחרוג מ-5 שניות במהלך כל גירוי כדי למנוע רגישות לגירויי מישוש בכפותיהן של חולדות. חזור על הבדיקה 5x עד שההפרש בין שלוש המדידות העוקבות אינו משמעותי (בטווח של 10 N).
    5. מחק את הערכים עם הבדלים גדולים (ערכי המקסימום והמינימום) וקח את הממוצע של שלושת הערכים הנותרים כסף משיכה מכני.
  3. חביון משיכת כפות (PWL)
    1. הניחו את החולדות בתא קטן של זכוכית מחוסמת שקופה בגודל של 20 ס"מ x 10 ס"מ x 20 ס"מ. מכסים את החלק העליון של התא בכיסוי זכוכית שקוף עם חורי אוורור. שמור על הטמפרטורה של צלחת זכוכית שקופה על 28-30 ° C, שבו התא ממוקם.
    2. יישבו את החולדות בסביבה זו לפחות 30 דקות כדי להתאקלם לפני תחילת כל מבחן רשמי. אם חולדות משתינות או עושות את צרכיהן בתא, נקו אותו עם נייר סופג בזמן כדי למנוע השפעה על מעבר החום של קרינת האור לאחר מכן.
    3. מקדו את הזרקור במרכז כף הרגל של החולדה ולחצו על לחצן התחל . לחצו על כפתור העצירה כאשר החולדה מראה התנהגויות ברורות כמו נסיגת כף הרגל או ליקוק כפות ותיעדו את השעה בשלב זה. זמן הקרנת הזרקור לא יעלה על 20 שניות כדי למנוע נזק לעור החולדה.
    4. בצעו את ההקרנה הבאה על אותה חולדה לאחר 10 דקות לפחות כדי למנוע רגישות. מדדו פי 5 על כל חולדה.
    5. הסר את הערכים עם הבדלים גדולים (הערך המרבי והערך המינימלי). קח את הממוצע של הערכים הנותרים כ- PWL.

5. הכנת מדגם

  1. בצע המתת חסד על העכבר כמתואר ב- 2.3.2.1.
  2. הכנת קרום סינוביאלי
    1. תקן את החולדה במצב שכיבה עם מחט מזרק על לוח קצף עם הגפה האחורית הימנית מכופפת בחטיפה ובסיבוב החיצוני. צבטו את העור סביב מפרק הברך עם מספריים כירורגיים וחשפו את השרירים סביב מפרק הברך של חולדות על ידי חיתוך העור ולאחר מכן חיתוך הפאשיה התת עורית.
    2. קח את הרצועה הפטלרית כציון דרך כדי להפשיט את קבוצות השרירים מעל הרצועה הפטלרית. חותכים בזהירות את קצה הרצועה הפטלרית (בטוברוזיות הטיביאלית) ומוצאים את הקרום הסינוביאלי כאשר הרצועה נצבטת כלפי מעלה מלמטה.
    3. בזהירות לחתוך את הרקמה הסינוביאלית עם מספריים אופתלמיים ולשטוף את הדם ואת הנוזל הסינוביאלי עם מלוחים מקורר מראש. תקן את הממברנה הסינוביאלית ב 4% paraformaldehyde לפחות 48 שעות לאחר ספיגת מים מפני הרקמה עם גזה נקייה.
    4. הכן את הדגימה כמו בשלבים 2.3.2.5- 2.3.2.6. בצע ניקוד כמו בשלב 2.3.2.7.
  3. ביצוע המטוקסילין וצביעת אאוזין
    1. יש להוריד למים עם קסילן למשך 20 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של קסילן טרי למשך 20 דקות, ולאחר מכן לטפל באתנול נטול מים למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול נטול מים טרי למשך 5 דקות, ואז להוסיף 90% אתנול בנפח למשך 5 דקות, 80% אתנול בנפח למשך 5 דקות, 70% אתנול בנפח למשך 5 דקות, ולבסוף מים מזוקקים במשך 5 דקות.
    2. טבלו את המגלשה בתמיסת צביעת המטוקסילין למשך 3-8 דקות. הסירו את המגלשה ושטפו את הכתם במים מזוקקים. העבר אותו לנוזל ההתמיינות (1% חומצה הידרוכלורית אלכוהול) במשך כמעט 30 שניות, כך שהשקופית תדעך לכחול בהיר. שטפו אותו במים מזוקקים, והכניסו לתמיסת צביעת אאוזין למשך 1-3 דקות.
    3. יש לייבש את המגלשה עם חלק נפח אתנול 95% למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול טרי 95% למשך 5 דקות, ולאחר מכן אתנול נטול מים למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול נטול מים טרי למשך 5 דקות.
    4. הפוך את השקופית לשקופה על ידי הוספת קסילן למשך 5 דקות, החלף אותה בסיבוב נוסף של קסילן טרי למשך 5 דקות, ולאחר מכן אטם אותה עם שרף ניטרלי.
  4. Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) על סחוס
    1. יש לייבש את דגימת הסחוס באתנול נטול מים, 90% אתנול, 85% אתנול ו-75% אתנול עד להשלמת ההידרציה. משרים ב-PBS למשך 5 דקות. יש להוסיף 3% H2 O2 טיפות למשך 10 דקות.
    2. יש להוסיף את תמיסת העבודה proteinase K בטיפה ולעכל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חיץ תיוג לכל פרוסה כדי לשמור על לחותה ונערו את עודפי הנוזלים לאחר הכנת תמיסת העבודה. הוסף 20 μL של פתרון עבודה לכל שקופית ודגר במשך שעתיים ב 37 ° C בקופסה רטובה.
    3. מוסיפים 50 μL של תמיסת הסגירה, טיפה אחר טיפה וסוגרים למשך 30 דקות. לאחר מכן יש להוסיף 50 μL של נוגדן אנטי-דיגוקסין מדולל ביוטינילציה (דילול 1:100) ולדגור ב-37°C למשך שעתיים בקופסה רטובה. יש להוסיף 10 μL של דילול נוגדני SABC (דילול 1:100) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים בקופסה רטובה.
    4. הוסף תמיסת פיתוח צבע DAB (50 μL כל אחד מגיבים A, B ו- C ב- 1000 μL של מים מזוקקים) טיפה למשך 10-15 דקות. התפתחות הצבע משלימה כאשר הוא גרגירי חום-צהוב.
    5. מכתים מחדש עם hematoxylin במשך 3 שניות. לאחר התייבשות הדרגתית וטיפול שקוף, יש לייבש בטמפרטורת החדר ולאטום את המגלשה בזהירות עם חניכיים ניטרליות. שימו לב כדי להימנע מהשארת בועות ודבק עולה על גדותיו.
  5. אנליזה אימונוהיסטוכימית של IL-1β ו-TNF-α
    1. טווקס את המגלשות באופן שגרתי בקסילן ולחות אותן באלכוהול הדרגתי. להשבית את peroxidase אנדוגני בקטעים עם 3% H 2 O2. הניחו את מחזיק המגלשה במאגר ציטראט בטמפרטורה של 95°C (pH 6.0) ודגרו באמבט מים מעל 95°C למשך יותר מ-20 דקות. הוציאו את קופסת הדגירה והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.
    2. יש לדגור על סרום עיזים 5% רגיל עם PBS למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ולנער את עודפי הנוזלים. להוסיף 150 μL של נוגדן אני טיפה אחר טיפה ולתת לעמוד על 37 ° C במשך 1 שעה, ולאחר מכן לאחסן לילה ב 4 ° C. למחרת, התחממו מחדש ב 37 °C (77 °F) במשך 45 דקות.
    3. שטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. כסו את הרקמה במגלשה ב-3% BSA ואטמו אותה ב-37°C למשך 30 דקות. הוסף 150 μL של נוגדן II טיפה אחר טיפה ולתת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ולהוסיף 150 pL של נוזל לפיתוח צבע DAB טיפתית. שימו לב למידת הכתמים מתחת למיקרוסקופ עד שהדגימה הופכת חומה-צהובה אפילו לעין בלתי.
    4. יש לשטוף מיד עם PBS במשך 10 דקות. מכתימים שוב בהמטוקסילין, מייבשים באלכוהול הדרגתי, הופכים את השקופיות לשקופות בקסילן ואוטמים במסטיק ניטרלי.
  6. ניתוח סטטיסטי
    1. חלקים מוכתמים אימונוהיסטוכימית עם ביטוי חיובי של החלבון הקשור הם צהובים או חומים-צהובים. ציון עוצמת הביטוי החיובי על ידי תוכנת Image J עבור כל קבוצה של חתכים אימונוהיסטוכימיים והשתמש בקריטריוני ההערכה של צפיפות אופטית ממוצעת (AOD), המחושבים על ידי IOD חלקי שטח.
    2. השתמש בתוכנת ניתוח לניתוח סטטיסטי. השתמש במבחן t אם הנתונים תאמו להתפלגות נורמלית וריבוע חי, והשתמש במבחן לא פרמטרי אם הם לא התאימו להתפלגות נורמלית. נתח נתוני מדידה חוזרים על ידי משוואות אומדן כלליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבחני התנהגות כאב
תוצאות MWT הראו כי MWT של הגפה האחורית הימנית לאחר הדוגמנות היה נמוך משמעותית מבעבר (עמ '<0.05). בהשוואה לקבוצת הביקורת, MWT של חולדות היה גבוה באופן משמעותי לאחר Tuina (p<0.05; איור 5 וטבלה 2).

figure-results-1
איור 5. תוצאות מבחן סף נסיגה מכני (<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מספק פרוטוקול למניפולציה של Tuina על חולדות KOA. באמצעות בדיקות התנהגות כאב וממצאים היסטומורפולוגיים, הוא הציע כי סדרה כזו של מניפולציה Tuina המיושמת על חולדות KOA יכולה להפחית דלקת סינוביאלית ואפופטוזיס סחוס, אשר יכול להיות התייחסות של מניפולציה Tuina על מודלים בעלי חיים של KOA.

ישנם מספר הליכים קריטיים במהלך הפרוטוקול. ראשית, חשוב לבחור שיטה מתאימה להשראת מודל KOA. ישנן שיטות שונות לזירוז מודל KOA, כולל הזרקת חלל מפרק25, ניתוח תוך מפרקי 26,27, שיטת בלימת מפרקי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Shanghai Critical Clinical Specialties Construction Project (מספר מענק: Shslczdzk04001); תוכנית השיט של ועדת המדע והטכנולוגיה של שנגחאי (מספר מענק: 22YF1444300); פרויקטים במסגרת תקציב אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (מספר מענק: 2021LK091).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול מוחלטSupelcoPHR1070להכנת דגימה
מכשיר מדידה ALMEMOahlborn2450-1לבדיקת סף נסיגה מכנית
נוגדן נגד דיגוקסיןSigma-AldrichSAB4200669לכתם HE IHC או TUNEL
Anti-IL-1 betaabcamab283818עבור ערכת מצע כתם HE IHC או TUNEL
DABSolarbioDA1010HE IHC או TUNEL
שנחאי New Century20000356לייצור דגם
eosinbioswamp PAB180016 עבור כתם HE IHC או TUNEL
הקלטות לחץ אצבעותSuzhou Changxian טכנולוגיה אופטו-אלקטרוניתCX1003wלמניפולציה של Tuina
תמיסת חומצה פורמיתSigma-Aldrich695076להסרת אבדן
H2O2Sigma-Aldrich386790-Mעבור כתם HE IHC או TUNEL
hematoxylinbioswamp PAB180015עבור כתם HE IHC או TUNEL
Isofluraneשנחאי Yuyan Scientific Instrument CompanyS10010533להרדמת גז
שרפים ניטרלייםbioswamp PAB180017עבור כתם HE IHC או TUNEL
Paraformaldehyde Fix SolutionSigma-Aldrich100496להיסטולוגיה
PBSSigma-AldrichP3813עבור כתם HE IHC או TUNEL
מכשיר בדיקה פלנטריIITC מדעי החיים/בדיקת חביון נסיגת כפות
של תחבושת פריזWANDE20150023לייצור דגמים
Proteinase KSigma-Aldrich124568עבור כתם HE IHC או TUNEL
TNF נוגדן אלפא חד שבטיProteintech60291-1-Igעבור כתם HE IHC או TUNEL
TUNEL ServicebioGDP1042עבור כתם HE IHC או TUNEL
שעווהסיגמא-אולדריץ'327204להכנת דגימה
קסילןשנחאי סינופארם קבוצה100092להכנת דגימה
עבור חומרי בסיס תותבות עבור טיח

מקורות

  1. Joint Surgery Group of Chinese Orthopaedic Association, Chinese Association of Orthopaedic Surgeons, National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese Journal of Orthopaedics. Chinese Osteoarthritis Treatment Guidelines (2021 Edition). Chinese Journal of Orthopaedics. 41 (18), 24(2021).
  2. David, S., et al. Epidemiology of knee osteoarthritis in general practice: a registry-based study. BMJ Open. 10 (1), 031734(2020).
  3. Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, Socioeconomic, and Geographic Disparities in the Epidemiology of Knee and Hip Osteoarthritis. Rheumatic Disease Clinics of North America. 47 (1), 1-20 (2021).
  4. Wang, K., Dong, X., Lin, J. H. Investigation of Medical Costs of Disease In Patients With Osteoarthritis of the Knee Joint. National Medical Journal of China. 97 (1), 4(2017).
  5. Perlman, A., et al. Efficacy and Safety of Massage for Osteoarthritis of the Knee: a Randomized Clinical Trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
  6. Xing, H., et al. Therapeutic massage for knee osteoarthritis: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Acupuncture and Tuina Science. 19 (5), 354-363 (2021).
  7. Seo, B. R., et al. Skeletal muscle regeneration with robotic actuation-mediated clearance of neutrophils. Science translational medicine. 13 (614), (2021).
  8. Wu, J. H., Zhang, C., Dong, S. J., Yin, H. Effects of Massage with #34;Relaxing Tendons" Technique on the Interleukin-1B and 5-hydroxytryptamine Levels in the Joint Fluid of a Rabbit Knee Osteoarthritis Model. Chinese General Practice. 21 (6), 688-693 (2018).
  9. Luo, R. The effects of IL-1B,IL-6,IL-13,IL-26,TNF-a by patellar manipulations on rabbit knee osteoarthritis model. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine. , (2017).
  10. Qiu, F., Li, C., Wu, X., Liu, Y., Zhang, X. Effect of Massage on the Function of Foot-Yangming Meridian-Muscle in Patients with Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 36 (3), 649-655 (2021).
  11. Yang, B., Li, S. Research Progress of Massage in Improving Biomechanical Indexes of Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 37 (12), 2571-2576 (2022).
  12. Li, C., Qiu, F., Ding, J., Hu, G., Zhang, X. Curative Observation of Retaining of Heated Needle at Trigger Points Combined with Manipulation for Muscles along Meridians in Treating Knee Osteoarthritis. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 37 (11), 2157-2162 (2020).
  13. Ding, X., Zhang, X., Hou, Y., Zhao, Z., Ye, X. Effect of massage manipulation on joint stiffness of knee osteoarthritis patients based on "spine-pelvis-knee" holistic diagnosis and treatment pattern. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. 55 (08), 54-57 (2021).
  14. Fu, Y., Gong, L., Li, Y. The clinical studies of Rolling combined with Pulling Manipulation on Early and Middle-term. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (07), 958-962 (2020).
  15. Jiang, J., Hu, X., Tang, R., Qiu, F., Huang, L. Change of lower limb force line in treating knee osteoarthritis with manipulation. Journal of Changchun University of Chinese Medicine. 34 (01), 129-132 (2018).
  16. Liang, Y., et al. Some issues on animal experiments standardization of acupuncture and moxibustion. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 25 (09), 2299-2300 (2014).
  17. Guo, Y., Liu, Y., Liu, Q., Chen, Z., Zhao, X. Basic System of Chinese Acupuncture Standard. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 31 (6), 549-550 (2011).
  18. YAN, X., Yan, J. Study on the Standardization of Classification of Tuina Manipulation. Acta Chinese Medicine. 32 (5), 875-878 (2017).
  19. Aikebaier, G., Lu, X., Liu, J., Liu, l, Wang, S. Analysis on Manipulation and Acupoint Selection Laws of Massage for Treatment of Knee Osteoarthritis Based on Data Mining Technology. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 29 (5), 23-29 (2022).
  20. Gong, L., Wuquan, S., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  21. Qian, J., Xing, X., Liang, J. Two Methods to Establish Rat Model of Osteoarthritis of the Knee. Research and Exploration in Laboratory. 33 (11), 23-27 (2014).
  22. Liu, J., et al. Experimental study of a modified Videman method for replicating knee osteoarthritis on rabbit. Rehabilitation Medicine. 30 (03), 212-219 (2020).
  23. Moskowitz, R. W. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 1-2 (2005).
  24. Shen, M., Li, Z., Shen, J. Preliminary Exploration of Experiment Teaching on Experiment Acupuncture Science. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 7 (02), 130-131 (2009).
  25. Jeong, J., et al. Anti-osteoarthritic effects of ChondroT in a rat model of collagenase-induced osteoarthritis. BMC complementary and alternative medicine. 18 (1), 131(2018).
  26. Hulth, A., Lindberg, L., Telhag, H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report. Acta orthopaedica Scandinavica. 41 (5), 522-530 (1970).
  27. Tawonsawatruk, T., Sriwatananukulkit, O., Himakhun, W., Hemstapat, W. Comparison of pain behaviour and osteoarthritis progression between anterior cruciate ligament transection and osteochondral injury in rat models. Bone & Joint Research. 7 (3), 244-251 (2018).
  28. Zhou, Q., et al. Cartilage matrix changes in contralateral mobile knees in a rabbit model of osteoarthritis induced by immobilization. BMC musculoskeletal disorders. 16, 224(2015).
  29. Zeng, J., et al. Establishment and identification of experimental rabbit model of knee osteoarthritis. Chinese Journal of Clinical Research. 29 (5), 679-682 (2016).
  30. Shang, P., et al. Comparison with two kind osteoarthritis animal models reduced by plaster immobilization in extend excessive position and bend excessive position respectively. Orthopaedic Biomechanics Materials and Clinical Study. (1), 11-14 (2006).
  31. He, Y., et al. Evaluation of the effect of improved cast immobilization method on rabbit knee osteoarthritis model. Chinese Imaging Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 18 (2), 198-219 (2020).
  32. Pengfei, S., et al. Possible mechanism underlying analgesic effect of Tuina in rats may involve piezo mechanosensitive channels within dorsal root ganglia axon. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (6), 834-841 (2018).
  33. Wang, Y. Mechanisms of Massage Mediating Chondrocyte Apoptosis in Knee Osteoarthritis Through Piezo 1/JAK2 Signaling Pathway. Shandong University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  34. Liu, J. Effect of Massage on TLR4/MyD88 Signal Transduction Pathway in Rat Knee Osteoarthritis Model. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  35. Yu, S., Zhou, J., Pang, X. Advances in induced animal models of knee osteoarthritis. Journal of Guangxi University of Chinese Medicine. 25 (5), 50-55 (2022).
  36. Tan, Q., et al. Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. 26 (11), 1714-1719 (2022).
  37. Zhang, Z., et al. A Review of Massage Therapy for Knee Osteoarthritis. Henan Traditional Chinese Medicine. 39 (1), 146-149 (2019).
  38. Gong, L., Sun, W., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  39. Chen, C., Zhang, H. Research on the rules of acupoint selection for the treatment of knee osteoarthritis with massage based on data mining. Hainan Medical Journal. 29 (18), 2617-2619 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דלקת סינוביאליתמבחן התנהגות כאבמיקום נקודות דיקוראפופטוזיס של כונדרוציטיםהעברת אותות מכניתשיטת לחיצה ועיסויקיבוע חולדה
מניפולציה Tuina כדי להפחית דלקת ואובדן סחוס בחולדות osteoarthritis הברך
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.