הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תיחום הפנוטיפ המטבולי של תאי כליה שמקורם בביופסיה

637 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לביצוע פרופיל מטבולי של תאי כליה שמקורם בביופסיה. הגישה שהוצגה עברה אופטימיזציה בחזירים זכרים בוגרים בריאים ויש לה פוטנציאל לשפר את ההערכה בזמן אמת של כדאיות השתלת הכליה. שיטה זו עשויה גם לעזור לחשוף ביולוגיה חדשה על פני מחלות כליות מרובות המבוססות על חילוף חומרים.

תקציר

השתלת כליה היא הטיפול האופטימלי למחלת כליות סופנית; עם זאת, כליות מושתלות אובדות לרוב בטרם עת, עם אובדן של עד 50% מהשתל 10 שנים לאחר ההשתלה. אחד הגורמים העיקריים לאובדן שתל מוקדם הוא הפגיעה שנגרמה על ידי השתל בזמן ההשתלה, המכונה פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI). תפקוד השתל המושהה (DGF), המוגדר כצורך בדיאליזה בשבוע הראשון לאחר ההשתלה, הוא ביטוי של IRI חמור המראה מאפיינים תפקודיים והיסטולוגיים של פגיעה כלייתית חריפה (AKI). בעוד שהמנגנונים המניעים AKI נותרו לא ברורים, עדויות מצטברות מצביעות על כך ששינוי בתפקוד המטבולי באלוגרפט מתווך AKI ועשוי להיות הסיבה ל-DGF. לפיכך, פענוח וניטור היסודות המטבוליים של IRI ישפרו את יכולתנו לאבחן ולמנוע AKI. מאמר זה מתאר שיטה ייחודית להערכת נשימה מיטוכונדריאלית (באמצעות קצב צריכת חמצן), גליקוליזה (קצב החמצה חוץ-תאית) ורמות ATP תוך תאיות בתרחיפים של תאי כליה שמקורם בביופסיית מחט. המתודולוגיה עברה אופטימיזציה בחזירים זכרים בוגרים בריאים ותוקף במודל חזירי של השתלה אוטומטית. לגישה המוצגת יש פוטנציאל לשפר את ההערכה בזמן אמת של כדאיות השתלת הכליה במרפאה. פרופיל חילוף החומרים בביופסיות שמקורן בחולה עשוי גם לחשוף ביולוגיה חדשה במחלות כליות אחרות המבוססות על חילוף חומרים.

מבוא

השתלת כליה היא הטיפול האופטימלי למחלת כליות סופנית 1,2,3,4; עם זאת, כליות מושתלות אובדות לעתים קרובות בטרם עת, עם אובדן של עד 50% השתלה ב-10 שנים לאחר ההשתלה5. חולים שנפגעו הגדילו את התחלואה והתמותה ומהווים נטל כלכלי גדול על מערכות הבריאות6. סיבה עיקרית לאובדן שתל מוקדם היא הפציעה שנגרמה על ידי השתל בזמן ההשתלה, המכונה פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI). IRI היא פציעה בלתי נמנעת הנגרמת על ידי ירידה בזרימת הדם, ואחריה רפרפוזיה7. איסכמיה מאופיינת בהצטברות סוקסינט של רקמות, המניעה זרימת אלקטרונים הפוכה בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, מה שמוביל לייצור סופראוקסיד ולפציעה לאחר מכן מוקדם לאחר רפרפוזיה8. IRI באיברים מושתלים מעלה את הסיכון לאי תפקוד ראשוני, עיכוב בתפקוד השתל (DGF), דחייה ותוצאות שתל נחותות 8,9. DGF, המוגדר כצורך בדיאליזה בשבוע הראשון לאחר ההשתלה9, הוא ביטוי של IRI10 חמור. מבחינה היסטולוגית, DGF הקשור ל-IRI מתבטא כנמק צינורי חריף (ATN), ופגיעה במיקרו-כלי הדם. מבחינה תפקודית, יש ירידה בקצב הסינון הגלומרולרי (GFR) ובתפוקת השתן, מאפיינים של פגיעה כלייתית חריפה (AKI) באלוגרפט11. למרות חשיבותו, אין כיום טיפולים ל-AKI לאחר ההשתלה הקשור לאיסכמיה-רפרפוזיה. המחסור בטיפולים נובע מהבנה לא מלאה של מנגנוני המחלה וממחסור בסמנים לזיהוי חולים בסיכון הגבוה ביותר לתפקוד לקוי של השתל בנקודות הזמן הקריטיות שבהן הפגיעה עלולה להיות הפיכה12.

עדויות מצטברות מצביעות על כך ששינוי בחילוף החומרים האנרגטי באלוגרפט מתווך AKI ועשוי לתמוך ב-DGF 13,14,15. תאי הכליה מייצרים אנרגיה באמצעות שני מנגנונים עיקריים: נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה16. ב-IRI, רפרפוזיה גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה17. כתוצאה מכך, גליקוליזה הופכת למקור האנרגיה העיקרי 13,18,19,20. השינוי המטבולי ב-IRI מקדם מוות של תאי אנדותל צינוריים ומיקרו-וסקולריים, מה שמוביל ל-AKI 21,22,23,24. בעבודה קודמת, ATN היה קשור לביטוי מוגבר של אנזימים גליקוליטיים ורמות משתנות של חלבונים מיטוכונדריאלים25, בהתאם ל-IRI בשתל 13,18. יתר על כן, במודל השתלה עצמית של כליה חזירית, איסכמיה ואחריה אחסון בקירור הובילו לרמות מופחתות של חלבונים מיטוכונדריאלים בכליות ולהפרשת לקטט מוגברת26. בסך הכל, ממצאים אלה מחזקים את החשיבות הקלינית של ניטור הפנוטיפ המטבולי של השתלות כליה, עוד לפני ההשתלה, מכיוון שתכונות מטבוליות בסיסיות באלוגרפט יכולות לנבא תפקוד לקוי של אלוגרפט27.

פותחו מודלים קליניים לחיזוי סיכון לטווח קצר לדחייה ואובדן אלוגרפט 28,29. עם זאת, מודלים אלה חסרים דיוק ואינם לוקחים בחשבון את התכונות המולקולריות של השתל 30,31,32. מחקרים אחרונים נועדו לענות על צורך בלתי מסופק זה באמצעות זיהוי דפוסים מולקולריים ברמת הרקמה הקשורים לתוצאות שתל נחותות, כגון תפקוד לקוי של אלוגרפט ודחייה 13,14,15,25,33,34. מחקרים אלה מסתמכים על מדידות מולקולריות במצב יציב בגן 33,34,35, חלבון 25,26 ורמת מטבוליט13,14, מה שמשאיר תמונה חלקית של הפנוטיפ המטבולי של האלוגרפט. פער זה בידע נובע בחלקו מחוסר יכולת למדוד את התפקוד המטבולי ואת מצב האנרגיה של דגימות שמקורן בכליות ברגע מסוים בזמן. יש צורך בפיתוח פרוטוקול סטנדרטי לקביעת הפנוטיפ המטבולי של תאי כליה שמקורם בביופסיה, שעשוי להיות מתורגם למחקר של דגימות חולים. מאמר זה מתאר זרימת עבודה ייחודית להערכת נשימה מיטוכונדריאלית (באמצעות קצב צריכת חמצן), גליקוליזה (קצב החמצה חוץ-תאית) ורמות ATP תוך-תאיות בתרחיפים של תאי כליה שמקורם בביופסיה. המתודולוגיה עברה אופטימיזציה באמצעות ליבות ביופסיה של כליות מחזירים זכרים בוגרים בריאים. כדי להקל על יישום קליני עתידי, ליבות הביופסיה הושגו באמצעות מחט 18 גרם, כמו בפרוטוקולים הקליניים הסטנדרטיים של דגימת שתל כליה36,37. לבסוף, התועלת של יישום הפרוטוקול בתנאי ניסוי מבחינים אומתה במודל חזירי של השתלה אוטומטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר הכללי של טורונטו (מספר פרוטוקול שימוש בבעלי חיים: 3652). בעלי החיים טופלו בהתאם לאגודה הלאומית למחקר רפואי ומדריך לטיפול בחיות מעבדה, המכון הלאומי לבריאות (NIH), אונטריו, קנדה. במחקר זה נעשה שימוש בחמישה חזירי יורקשייר זכרים בני 3 חודשים, במשקל של כ-30 ק"ג כל אחד. הפרוטוקול למתודולוגיה זו מחולק לשלבים הבאים: (1) דיסוציאציה של ליבות ביופסיה של כליה בודדת לתרחיפים של תאים; (2) פרופיל מטבולי של תאי כליה שמקורם בביופסיה; ו-(3) מדידת תכולת ATP בתאי כליה שמקורם בביופסיה. כל דגימות הביופסיה שנאספו למדידות תפקוד מטבולי או תכולת ATP פורקו תוך 3 שעות מהשליפה בארון בטיחות ביולוגית. זרימת העבודה של המתודולוגיה מוצגת באיור 1. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. דיסוציאציה של ליבות ביופסיה של כליה בודדת לתרחיפי תאים

  1. אסוף שלוש ליבות ביופסיה של רקמה מקליפת הכליה, באמצעות מערכת האקדח של המחט הקואקסיאלית (כלומר, מחט מנחה חיצונית ומחט ביופסיה פנימית)38. לתרגום קליני, מומלץ להשתמש באקדח מחט ביופסיה 18 גרם39.
    הערה: היה עקבי עם זווית אקדח מחט הביופסיה (~45 מעלות צלזיוס) ועומק הניקוב (~20 מ"מ) בעת ביצוע ביופסיות של קליפת הכליה.
  2. הנח בזהירות כל ליבת ביופסיה בצינור של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל RPMI 1640 על קרח.
    1. מפרקים רקמת ביופסיה לחתיכות קטנות (באורך ≤2 מ"מ) באמצעות אזמל על צלחת פטרי בגודל 6 ס"מ המונחת על קרח. בעזרת פינצטה מעוקלת בקצה דק במיוחד, הנח את שברי הרקמה מכל ביופסיה לתוך צינור אחר של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חומר דיסוציאציה.
      הערה: אמצעי הדיסוציאציה מורכב ממדיום RPMI 1640 המכיל 0.1 מ"ג/מ"ל DNase I, 10 מ"ג/מ"ל קולגנאז ו-2990 יחידות/מ"ל פרוטאז ניטרלי מ-Bacillus polymyxa. דיסוציאציה של ביופסיות כליה אנושיות באמצעות הרכב מדיה זה הוכחה כממקסמת את כדאיות התאים ומשמרת על ייצוג של אוכלוסיות תאים נדירות ושבריריות40.
  3. אפשר להתרחש דיסוציאציה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (בלוק חימום) עם תסיסה לסירוגין (מומלץ מערבולת הצינורות כל 5 דקות).
  4. לאחר דיסוציאציה, סנן את מתלי התאים דרך צינורות מסננת תאים של 35 מיקרומטר.
  5. שטפו את המסננת בנפח 1:1 של סרום 100% בקר עוברי (FBS).
  6. אגד את שלושת תרחיפי תאי הכליה שמקורם בביופסיה לצינור אחד של 15 מ"ל.
  7. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס), והשעו אותם מחדש ב-1 מ"ל של RPMI 1640 המכיל 10% FBS. תרחיף תאים זה מניב בדרך כלל 0.8-1.2 × 106 תאים.

2. פרופיל מטבולי של תאי כליה שמקורם בביופסיה

הערה: שלב הפרופיל המטבולי משלב מדידת גליקוליזה (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) במנתח תפקוד מטבולי, כמו גם את רמות ה-ATP התוך תאיות באמצעות ערכה מסחרית.

  1. הידרציה וכיול של לוחית השירות של המחסנית
    1. יום אחד לפני אחזור הדגימה, הוסף 200 מיקרוליטר של ddH2O לכל באר של לוחית השירות של המחסנית של מנתח התפקוד המטבולי.
    2. דגרו את לוחית השירות של המחסנית בחממה נטולת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. ביום אחזור הדגימה, הסר את ה-ddH2O על ידי שאיבה באמצעות פיפטת פסטר המחוברת למערכת ואקום, והוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט (pH = 7.4) לכל באר של לוחית השירות של המחסנית.
    4. דגרו את לוחית השירות של המחסנית בחממה נטולת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. ציפוי תאים והכנת אמצעי בדיקה ותרכובות לחץ למדידות תפקוד מטבולי
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של RPMI עם 10% FBS בכל באר של צלחת בדיקת תפקוד מטבולי של 96 בארות.
    2. הפרד מנה קטנה (למשל, 10 מיקרוליטר) של תרחיף התא (שהושג בשלב 1) בצינור אחר, וצבוע את התאים באמצעות צבע כדאיות הרחקה כחול טריפאן.
    3. בעזרת תא ספירה, קבע את ריכוז התאים החיים (טריפן כחול שלילי)41 בתרחיף המקורי.
    4. זרע את התאים בכל אחת מבארות המחקר של צלחת בדיקת התפקוד המטבולי, בצפיפות של 1.0 x 105 תאים חיים/באר. מספר תא זה נקבע לאחר מיטוב (ראה סעיף תוצאות מייצגות).
      הערה: אין לזרוע תאים באף אחת מארבע הפינות של לוחית בדיקת התפקוד המטבולי, מכיוון שאלה משמשים כחסר.
    5. תן לתאים להיצמד על ידי דגירה של צלחת בדיקת התפקוד המטבולי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך הלילה (~16 שעות).
    6. למחרת, ודא תחת המיקרוסקופ שהתאים נמצאים במפגש מינימלי של 70%-80% (חד-שכבת תא בריאה חשובה לקביעה אופטימלית של פרמטרים של תפקוד מטבולי).
    7. יש להפשיר אליקוט (40-50 מ"ל) של חומר בזאלי נטול פנול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות לפחות.
    8. הכן 35 מ"ל של אמצעי בדיקה על ידי הוספת 2 מ"מ גלוטמין (350 מיקרוליטר), 1 מ"מ פירובט (350 מיקרוליטר) ו-5.55 מ"מ גלוקוז (385 מיקרוליטר) ב-33.915 מ"ל של חומר בזאלי מופשר מראש.
    9. בעזרת פיפטה בודדת או רב-ערוצית, הסר בעדינות את מדיית ה-RPMI מכל באר מחקר של לוחית בדיקת התפקוד המטבולי. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה בסיסית כדי לשטוף את התאים.
    10. הסר את המדיה הבסיסית בעדינות והוסף 150 מיקרוליטר של אמצעי בדיקה לכל באר, כולל הבארות ללא תאים.
      הערה: השארת בארות ללא אמצעי בדיקה עלולה להשפיע על תנאי הלחות בסביבת הצלחת ולהוביל למדידות לא עקביות של תפקוד מטבולי (איור משלים 1).
    11. הנח את לוחית בדיקת התפקוד המטבולי בחממה נטולת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~ שעה (שלב התאקלמות). קח את לוחית השירות של המחסנית (שהודגרה בעבר בתמיסת קליברנט) בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית.
    12. במהלך ההתאקלמות, הכינו את ארבעת הפתרונות הבאים של תרכובות לחץ, באמצעי בדיקה: 7 מיקרומטר אוליגומיצין (7x, לריכוז סופי 1 מיקרומטר אוליגומיצין); 2.4 מיקרומטר קרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון (FCCP) (פי 8, לריכוז סופי 0.3 מיקרומטר FCCP); 450 מ"מ 2-דאוקסי-גלוקוז (2-DG) (9x, לריכוז סופי 50 מ"מ 2-DG); 10 מיקרומטר רוטנון ו -10 מיקרומטר אנטימיצין A (ריקבון + AA) (פי 10, לריכוז סופי 1 מיקרומטר רוט + 1 מיקרומטר AA).
      הערה: אוליגומיצין מעכב את הפעילות של ATP סינתאז ולכן קוטע את שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC). זה מוריד את ה-OCR ואת זרם הפרוטונים המונע על ידי ATP סינתאז למיטוכונדריה. כתוצאה מכך, גליקוליזה הופכת למקור העיקרי לייצור ATP42. FCCP היא תרופה ציאניד (מטען שלילי) הפועלת כמפריד של זרחון חמצוני, על ידי משיכת פרוטונים (מטען חיובי) והשראת זרם פרוטונים רציף למיטוכונדריה, המאפשר צריכת חמצן על ידי ה-ETC ללא תלות בפעילות ATP סינתאז43. 2-DG הוא אנלוגי מבני סינתטי של גלוקוז שבו קבוצת 2-הידרוקסיל מוחלפת במימן, ופועלת כמעכב תחרותי של גליקוליזה44. ריקבון ו- AA הן תרופות מעכבות של הקומפלקסים I ו- III של שרשרת הובלת האלקטרונים, בהתאמה45. ההשפעות של הזרקת כל תרופה בשלבים שונים של בדיקת התפקוד המטבולי מתוארות באיור משלים 2.
    13. טען 25 מיקרוליטר מכל תרופה ליציאה המתאימה על גבי כל באר של לוחית השירות של המחסנית, כולל הבארות ללא תאים. טען את התרופות לפי הרצף הבא: 7x אוליגומיצין (יציאה A), 8x FCCP (יציאה B), 9x 2-DG (יציאה C), 10x רוט + AA (יציאה D).
    14. דגרו את לוחית השירות של המחסנית בחממה נטולת CO2 עד שתידרש להגדיר את בדיקת התפקוד המטבולי.
  3. קביעת צריכת חמצן ושיעורים גליקוליטיים בתאי כליה שמקורם בביופסיה
    1. ודא שמנתח התפקוד המטבולי מופעל ומחובר לתוכנת הבקר במחשב אביזר.
    2. הפעל את התוכנה.
    3. לחץ על הכפתור תבנית > ריק.
    4. בכרטיסייה הראשונה, לחץ על הכפתור אסטרטגיית הזרקה. לחץ על כל כפתור עם האותיות A, B, C או D המתאימות לארבע יציאות ההזרקה. רשום את שם התרופה שתוזרק דרך כל יציאה: אוליגומיצין (יציאה A), FCCP (יציאה B), 2-DG (יציאה C), ריקבון + AA (יציאה D).
    5. בכרטיסייה השנייה, הגדירו את כל תנאי הניסוי. לחץ על הכפתור הוסף תנאי כדי להציג תנאי חדש. התוכנה תקצה צבע באופן אוטומטי לכל מצב. לחץ על הכפתור מפת לוחית והקצה את תנאי הניסוי המתאים לכל באר, אשר ייצבע בהתאם.
      הערה: ארבע הבארות הפינתיות צריכות להישאר מוקצות כריקות (צבע שחור), מכיוון שהן משמשות להפחתת אות הרקע.
    6. בכרטיסייה השלישית, לחץ על כפתור ההזרקה ארבע פעמים, כך שארבע ההזרקות (יציאות A, B, C ו-D) יתווספו לרצף. ניתן להפעיל את הבדיקה באמצעות רצף ההזרקה המוגדר כברירת מחדל (A, B, C, D), מספר המדידות (3 מדידות בסיסיות + 3 מדידות לאחר כל הזרקה) והזמן בין המדידות (3 דקות).
    7. בכרטיסייה הרביעית, מלא את התיבות במידע החיוני למחקר, ולחץ על הפעל. המגש ייפתח, והתוכנה תבקש מהמשתמש להרכיב את לוחית השירות של המחסנית. הקפד להסיר את המכסה הירוק לפני הנחת הצלחת על המגש.
    8. לאחר הכיול (~15 דקות), המגש ייפתח שוב, והתוכנה תבקש מהמשתמש להסיר את לוחית השירות של המחסנית ולהניח את לוחית בדיקת התפקוד המטבולי על המגש. שוב, הסר את מכסה הצלחת לפני הרכבת הצלחת על המגש. ניתן להשליך את לוחית השירות של המחסנית.
    9. הבדיקה תסתיים תוך כשעתיים. לאחר זמן זה, שמור את הקובץ '.asyr' המתאים. נתח את קבצי ה-.asyr באופן חישובי כדי לבחון את עקומות ה-ECAR וה-OCR. ייצא נתונים לתבנית המועדפת.
  4. מדידת תכולת DNA לנורמליזציה של נתוני תפקוד מטבולי
    1. קבע את כמות ה-DNA בתאים בכל באר לאחר בדיקת התפקוד המטבולי באמצעות ערכת בדיקת התפשטות התאים שצוינה (ראה טבלת חומרים).
    2. הכן את הנפח הנדרש של מאגר ליזה תאים 1x על ידי דילול מאגר ליזה תאים פי 20 במים נטולי יונים.
    3. להכנת עקומה סטנדרטית, הכינו דגימות של 100 מיקרוליטר של בקטריופאג' λ DNA סטנדרטי (כלול בערכת בדיקת התפשטות התאים) מדוללות באופן סדרתי במאגר ליזיס תאים לריכוזים בטווח של 0 ננוגרם/מ"ל, 12.5 ננוגרם/מ"ל, 25 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל, 100 ננוגרם/מ"ל, 200 ננוגרם/מ"ל, 400 ננוגרם/מ"ל, 800 ננוגרם/מ"ל. טען כל דילול לבאר אחרת של מיקרו-פלטה שחורה של 96 בארות.
    4. הכן תמיסת קשירת צבע 1x על ידי דילול מגיב צבע 400x במאגר ליזיס תאים 1x. עבור כל באר עקומה סטנדרטית ובדיקת תפקוד מטבולי היטב, יידרשו 100 מיקרוליטר.
    5. מחלקים 100μL של תמיסת צבע 1x לעמודה הראשונה, שכבר מכילה את התקנים. הערה: ניתן להתחיל את התהליך עד לנקודה זו 30 דקות לפני סיום ריצת בדיקת התפקוד המטבולי.
    6. הסר את אמצעי הבדיקה מלוחית בדיקת התפקוד המטבולי באמצעות פיפטה חד או רב-ערוצית.
    7. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קשירת צבע 1x לכל באר מחקר של לוחית בדיקת התפקוד המטבולי. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לליז את התאים, ולהעביר את התוכן לצלחת השחורה.
    8. הגן על המיקרופלייט מפני האור ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
    9. מדוד את עוצמת הקרינה של כל דגימה באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות עם עירור ב-480 ננומטר וזיהוי פליטה ב-520 ננומטר.

3. מדידת תכולת ATP בתאי כליה שמקורם בביופסיה

הערה: מדוד את כמות ה-ATP בתאי כליה שמקורם בביופסיה באמצעות ריאגנט זיהוי ATP ותקן ATP רקומביננטי (rATP) שצוין (ראה טבלת חומרים).

  1. אם קפוא, הפשירו את מגיב זיהוי ה-ATP ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. לאחר רכישת תרחיפי תאים שמקורם בביופסיה וספירת תאים, צלחת 1.0 x 104 תאים חיים/באר לכל באר של מיקרו-פלטה לבנה של 96 בארות המכילה 100 מיקרוליטר של מדיה RPMI 1640 עם 10% FBS. השאר את העמודה הראשונה של המיקרו-פלטה ריקה, מכיוון שהיא תשמש לטעינת עקומה סטנדרטית של rATP למחרת.
  3. דגרו את המיקרופלייט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 למשך הלילה.
  4. למחרת, יש לחמם מראש את מגיב זיהוי ה-ATP בטמפרטורת החדר.
  5. צור את העקומה הסטנדרטית של rATP. הכן דגימות של 100 מיקרוליטר של תקן rATP מדולל סדרתי ב-PBS לריכוזים הבאים: 0 ננומטר, 0.001 ננומטר, 0.01 ננומטר, 0.1 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר, 1000 ננומטר.
  6. טען 50 מיקרוליטר מכל דגימה סטנדרטית rATP לעמודה הראשונה של המיקרו-לוחית.
  7. הסר את מדיית RPMI 1640 המכילה 10% FBS מכל באר מחקר מיקרו-לוחית, באמצעות פיפטה יחידה או רב-ערוצית.
  8. שטפו היטב כל חדר עבודה עם 100 מיקרוליטר PBS (מחומם מראש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס).
  9. הסר את ה-PBS והוסף 50 מיקרוליטר של PBS חדש בכל באר מחקר.
  10. הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב גילוי ATP הן לבאר הסטנדרטית והן לבארות המחקר.
  11. מערבבים, מדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן ב-RT למשך 10 דקות.
  12. קרא ותעד זוהר בקורא מיקרו-פלטות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת העבודה נבדקה בתאי כליה שמקורם בביופסיה מחזירי יורקשייר זכרים בריאים בני 3 חודשים. הפרוטוקול לדיסוציאציה של רקמות וציפוי תאים בוצע כמתואר לעיל. לאחר שנתנו לתאים להיצמד במשך 16 שעות, OCR ו-ECAR נמדדו בזמן אמת בתאי הכליה החזיריים שמקורם בביופסיה באמצעות מנתח תפקוד מטבולי, כסמנים של נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה, בהתאמה.

הניסוי הראשון נועד לקבוע את צפיפות הזריעה האופטימלית למדידה בטוחה של ערכי OCR ו-ECAR ותגובה צפויה ללחץ מטבולי בתאי כליה שמקורם בביופסיה. נבדקו ארבע צפיפויות זריעה שונות: 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר שיטה ייחודית להערכת התפקוד המטבולי של תאי כליה המתקבלים מביופסיות. פרוטוקול להשגת תרחיפים של תא בודד מביופסיות כליה טריות ליבה צורף לניתוח של תפקוד מטבולי ורמות ATP תוך תאיות. גליקוליזה מוערכת על ידי מדידת ECAR, ונשימה מיטוכונדריאלית על ידי מדידת OCR. ביופסיות כליה של פורין שימשו כדי לייעל את המתודולוגיה.

כדי לחקור ביעילות את התפקוד הביו-אנרגטי בתאים המתקבלים באמצעות דיסוציאציה של ביופסיות כליה עם מנתח תפקוד מטבולי, חשוב תחילה לייעל את צפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים השותפים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים לחשוף.

תודות

AK נתמך על ידי קרן רשת הבריאות האוניברסיטאית (פרסים 579067450776, 579072310776 ו-579068260776). SC-F נתמך על ידי תוכנית החינוך וההכשרה הלאומית של מדען חקר הכליות (KRESCENT) (2019KPPDF637713 ו-24KNIA-1291062).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134מעכב תחרותי של גליקוליזה
5 מ"ל מבחנה פוליסטירן
תחתון עגול, עם מסננת תאים מכסה הצמד		פלקון352235צינורות דיסוציאציה
אנטימיצין A מ  Streptomyces  sp.SigmaA8674מעכב קומפלקס III של שרשרת הנשימה
AOF BP פרוטאזVitaCyte003-1000אנזים דיסוציאציה
קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)
פנילהידרזון (FCCP)		SigmaC2920מפרק זרחון חמצוני
CellTiter-Glo 2.0 מבחן, 100 מ"לPromegaG9242מדידת ATP
קולגנאז MAVitaCyte001-2030אנזים דיסוציאציה
CyQUANT Cell Proliferation Assay, לתאים בתרביתInvitrogenC7026מדידת DNA תוך-תאי
D-גלוקוז, נטול מים, בדרגת ריאגנטביושופGLU501סובסטרט מטבולי
DNase IStemcell07469אנזים
דיסוציאציהסרום בקר עוברי, פרימיום,
ממקור ארה"ב, מומת בחום, 500 מ"ל		Wisent080-450תוסף מדיה דיסוציאציה
L-גלוטמין-200 מ"מ (100x) נוזל (100 מ"ל)Gibco25030081מצע מטבולי
אוליגומיצין Aמעכב סיגמא75351של ATP סינתאז
PBS, -/-, 500 מ"לWisent311-010-CLשטיפת תאים
rATP,   10 מ"מ,  0?5 מ"לPromegaP1132מדידה של ATP תוך-תאי
רוטנוןסיגמאR8875מעכב קומפלקס I של שרשרת הנשימה
RPMI 1640Gibco11875119דיסוציאציה
מדיה תוכנת בקר גלי סוסון ים 2.6AgilentN/Aהגדרת מדידות תפקוד מטבולי
תוכנת שולחן עבודה של גל סוסון ים 2.6AgilentN/Aניתוח נתוני תפקוד מטבולי
מדיום בסיס סוסון ים XF,   ללא פנול אדום, 500 מ"לAgilent103335-100מדידת תפקוד מטבולי
סוסון ים XFe96 FluxPak  (20 לוחות, 18 מחסניות,
ו-500 מ"ל של תמיסת קליברנט)		Agilent102416-100מדידת תפקוד מטבולי
מנתח תפקוד מטבולי Seahorse XFe96Agilent101991-100מדידת תפקוד מטבולי
תמיסת נתרן פירובט 100 מ"מ (100X), נוזל 100 מ"לGibco11360070מצע מטבולי
תוך תאי

מקורות

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השתתלת כליותפגיעה מאיסכמיה וreperfusingתפקוד מושהה של הש transplantedפגיעה כלייתית חריפהנשימה מיטוכונדריאליתקצב צריכת חמצןהערכת גליקוליזהרמות ATP תוך-תאיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.