הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

4.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65459

⸱

19 בינואר 2024

 ,  ,  , 
1Rabies Laboratory, Wadsworth Center, New York State Department of Health

במאמר זה

סיכום

מטרת כתב היד היא לבחון את השימוש בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת לאיתור נוגדנים ספציפיים לכלבת מסוג IgG ו-IgM.

תקציר

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) פותחה כדי לאתר איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. בדיקה זו מספקת תוצאות מהירות וניתן להשתמש בה כדי לזהות נוגדנים לכלבת במספר תרחישים שונים. בדיקת IFA לכלבת שימושית במיוחד לגילוי מהיר ומוקדם של נוגדנים להערכת התגובה החיסונית בחולה שחלה בכלבת. למרות ששיטות אחרות לאבחון כלבת לפני המוות מקבלות עדיפות, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להדגים את החשיפה האחרונה לנגיף הכלבת באמצעות זיהוי נוגדנים. בדיקת IFA אינה מספקת נוגדנים מנטרלי וירוסים (VNA), אך ניתן להעריך את התגובה המונעת לפני חשיפה (PrEP) באמצעות נוכחות נוגדנים חיובית או שלילית. בדיקה זו יכולה לשמש במצבים שונים ויכולה לספק תוצאות למספר מטרות שונות. במחקר זה, השתמשנו במספר דגימות סרום מזווג מאנשים שקיבלו PrEP והדגמנו את נוכחות נוגדני הכלבת שלהם לאורך זמן באמצעות בדיקת IFA.

מבוא

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) משמשת לאיתור איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. זהו אחד מארסנל של בדיקות זמינות למעקב אחר חולה כלבת לפני המוות. זה שימושי במיוחד עבור גילוי מוקדם של נוגדנים כדי להעריך את התגובה החיסונית של המטופל לזיהום כלבת. כאשר נעשה בה שימוש בשילוב עם בדיקות אחרות, היסטוריית מקרים וסטטוס החיסון של המטופל, בדיקת IFA יכולה לסייע בקביעת חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון1. מכיוון שבדיקת IFA מודדת IgM ו/או IgG, ערכי הנוגדן הספציפי יכולים להצביע על מסגרת זמן משוערת מחשיפה לאנטיגן1. בדיקה זו עשויה להיות שימושית ביישומים המפורטים או ביישומים אחרים שעדיין לא נחקרו.

ישנן מספר בדיקות סרולוגיות לכלבת זמינות. בדיקת עיכוב מיקוד פלואורסצנטי מהיר (RFFIT), בדיקת נטרול נגיף נוגדנים פלואורסצנטי (FAVN), או שינויים של אלה הן השיטות העיקריות למדידת נוגדנים מנטרלי נגיף הכלבת (RVNAs)1. עם זאת, בדיקות אלה אינן מבדילות נוגדנים IgM ו- IgG. כאשר הבחנה בין איזוטיפ נוגדנים חשובה בניטור התגובה החיסונית של הכלבת, נעשה שימוש בבדיקות כלבת IFA ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כלבת (ELISA), אך הן אינן מודדות RVNAs. למרות בדיקות IFA ו- ELISA ניתן להשתמש כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים כלבת בדגימה, ישנם כמה הבדלים באופן שבו הם מבוצעים. בדיקת IFA משתמשת בנגיף חי בתרבית תאים כמצע האנטיגן שלו, בעוד שבדיקת ELISA טיפוסית לגילוי כלבת משתמשת באחד או יותר מהחלבונים הנגיפיים. בסביבת מעבדה שבה ניתן לגדל את נגיף הכלבת, ניתן לבצע את בדיקת IFA בקלות רבה יותר במקום לרכוש או לטפח חלבונים נגיפיים בודדים עבור ELISA. יש לקחת בחשבון את מטרת הבדיקה ואת המידע המתקבל מתוצאות כל בדיקה סרולוגית של כלבת בעת ההחלטה באיזו בחירה2.

IgM הוא הראשון להגיב, גדל עד החלפת בכיתה נצפתה בסביבות היום 28, אז IgG הופך נוגדןבמחזור 3 השולט. לפיכך, IgM צפוי רק לפרק זמן מוגבל לאחר חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון. בדיקת הסרום והנוזל השדרתי (CSF) יכולה להצביע אם החשיפה הייתה באמצעות חיסון, שבו נוגדנים ייראו רק בסרה, או מזיהום ויראלי, שעשוי להראות נוגדנים ב- CSF1.

הוכח כי נוגדנים לכלבת נמשכים מספר שנים לאחר טיפול מונע לפני חשיפה (PrEP)4. בדיקת IFA יכולה להיות כלי שימושי להדגים זאת בנקודות זמן שונות לאחר החיסון או החשיפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא אושר לשימוש אתי בדגימות אנושיות על ידי מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק מרכז וודסוורת' לפיתוח מבחנים, מספר אישור פרוטוקול #03-019.

1. בטיחות

  1. לבשו ציוד מגן אישי (PPE), לפחות מגן עיניים (משקפיים או מגן פנים), מסכה כירורגית וכפפות ללא לטקס.
  2. יש לוודא כי אנשי הצוות מחוסנים לכלבת וכי הודגם טיטר של ≥0.5 IU/mL במהלך 6 החודשים האחרונים.

2. הכנת שקופית אנטיגן

הערה: בצע את כל המניפולציות של וירוסים, CSF וסרום בארון בטיחות ביולוגית (BSC) תוך שימוש באמצעי זהירות אוניברסליים.

  1. הכינו 20 מ"ל של תאי נוירובלסטומה של עכבר או BHK-21 לריכוז של 3.0 x 105 תאים/מ"ל במדיה החיונית המינימלית של Eagle בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (EGM) ושמרו על קור עד לשימוש.
  2. הכינו את נגיף CVS-11 על ידי דילול ב-EGM לדילול עובד של 1.0 x 106.5 50% תרבית רקמה במינון זיהומי (TCID50) למיליליטר ושמרו על קור עד שהוא מוכן לשימוש.
    הערה: TCID50 נקבע על ידי שיטת ריד ומואנץ' שפורסמה בעבר5.
  3. נקו תא מגלשות לחות ומגלשות מיקרוסקופ מצופות היטב מפוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) עם 70% אתנול ואפשרו להן להתייבש באוויר ב-BSC.
  4. הוסף מים מזוקקים (dH2O) לרצועות נייר סופג בתא השקופיות כדי להבטיח שהלחות תישאר קבועה לאורך כל ההליך.
  5. באמצעות עיפרון, תייג כל שקופית לשימוש עם מספר הפריט, התאריך, סוג התא וכל מידע מזהה אחר הדרוש לאחסון, והנח בתא השקופיות.
    הערה: רוב הסמנים, העטים או התוויות לא יעמדו בשלב קיבוע האצטון העתידי (שלב 2.9).
  6. החל 50 μL של דילול וירוס על כל באר על שקופיות המיקרוסקופ עם פיפטה חוזרת. לאחר מכן, להחיל 50 μL של דילול תאים על כל באר, נזהר לא לזהם את קצה פיפטה עם הנגיף כבר על הבאר.
  7. סגור את תא מגלשת הלחות והנח אותו באינקובטור הלח ב 34-36 מעלות צלזיוס. להעריך את זיהום התא לאחר 24 שעות.
    הערה: בצע את שלבים 2.8-2.12 בשקופית אחת בלבד.
  8. הסירו את המגלשה מתא הלחות ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט. שטפו את המגלשה בצנצנת קופלין מלאה במי מלח חוצצים בפוספט (PBS) למשך 2 דקות, ולאחר מכן הניחו למגלשה להתייבש באוויר.
  9. מניחים את המגלשה בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשה באצטון קר למשך שעה לפחות במקפיא של -20°C המאושר לחומרים דליקים. יש לבצע את כל הליכי יציקת האצטון וייבוש האוויר במכסה אדים.
  10. הניחו לאצטון להבהב והחליקו לייבוש. יש למרוח נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) מצומד שהוכן על פי הוראות היצרן על בארות המגלשה ולדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 34-36 מעלות צלזיוס.
  11. שטפו את המגלשה בצנצנות קופלין של PBS פעמיים למשך 2 דקות כל אחת. יבשו את המגלשה באוויר.
  12. הרכיבו מכסה עם 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ו-20% גליצרול, וקראו את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 200x כדי להעריך את הזיהום. אם התאים אינם נגועים בכ-50%, חזרו על שלבים 2.7-2.12 למחרת עד להגעה להדבקה הרצויה.
    הערה: הדבקה בתאים משוערת בהתבסס על הערכה חזותית של היחס בין תאים שליליים לתאים חיוביים לכלבת בשקופית היטב. תאים שליליים מופיעים בצבע אדום, בעוד תאים חיוביים מראים צביעה פלואורסצנטית ירוקה.
  13. הסר את שאר המגלשות מהאינקובטור ומתא הלחות. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מכל באר, ואז הניחו את המגלשות בצנצנת קופלין עם PBS למשך 1-2 דקות. ייבשו את המגלשות באוויר למשך כ-30 דקות. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לשימוש.

3. הכנת מדגם

  1. הכינו דילול מדגם של סרום המטופל או CSF לבדיקה. הכינו את הצמידות הדרושה לריכוז עבודה תקין מדולל ב-PBS עם 0.05% כחול אוונס.
    הערה: שמור את המצומד בחושך כדי לשמור על שלמות הפלואורופור לפני היישום

4. נוהל IFA

  1. הסר את המספר הדרוש של שקופיות אנטיגן מוכנות הדרושות לכל בדיקה ואפשר לשקופיות להפשיר ולהתייבש לחלוטין.
  2. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשות באצטון קר למשך בין שעתיים ללילה במקפיא בטמפרטורה של -20°C המאושר לשימוש בחומרים דליקים. הסר את המגלשות מהאצטון ואפשר להן להתייבש באוויר.
  3. הניחו את המגלשות בקופסת לחות בתוך ה-BSC עם רצועות סופגות ספוגות dH2O לשמירה על לחות. יש למרוח 50 μL מכל דילול דגימה, דגימת בקרה או PBS על הבאר שנקבעה מראש.
    הערה: כל שקופית חייבת להכיל מספר מתאים של בארות דגימת מטופלים, בקרה חיובית, בקרה שלילית ובקרת תאי PBS היטב.
  4. מקם את תא מגלשת הלחות הסגור באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 . דגרו על המגלשות במשך 30 דקות, ואז הוציאו את תא מגלשות הלחות מהאינקובטור והכניסו אותו ל-BSC.
  5. השתמש בקצה שואף כדי לשאוף בזהירות את supernatant מכל באר, להבטיח לא להפריע monolayer התא. השתמש פיפטה טפטפת סטרילית כדי להחיל טיפה אחת של PBS על כל באר.
  6. חזרו על השאיפה הזהירה, ואז הניחו כל מגלשה בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS ושטפו פעמיים במשך 15 דקות בסך הכל.
  7. החזירו את המגלשות לקופסת תא הלחות ומרחו 50 מיקרוליטר של נוגדנים אנטי-אנושיים מתאימים מצומדים לכל באר. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6.
  8. אפשרו לשקופיות להתייבש באוויר, הרכיבו משטח כיסוי עם אמצעי הרכבה וקראו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. ניתוח שקופיות

  1. דגימות כיתה המבוססות על דפוס הצביעה ועוצמת הפלואורסצנטיות בהשוואה לדגימות ביקורת חיוביות עם נוגדנים נגד כלבת שאומתו כגבוהים.
  2. דרגו את הדגימות בסולם של שלילי, 1+, 2+, 3+ ו-4+, כאשר תוצאה שלילית אינה מראה צביעה פלואורסצנטית ו-4+ מייצגת פלואורסצנטיות בצבע ירוק בהיר עם דפוס צביעה דומה לדגימות ביקורת חיוביות1.
    הערה: צבע התפוח הירוק חל רק על נוגדנים המסומנים בתווית FITC; הצבע משתנה בהתאם לבחירת הפלואורופור.
  3. הקצה לדגימות ערך נקודת קצה המיוצג על-ידי גורם הדילול שבו הדגימה מציגה ציון 1-2+. בדוק את הדגימות בגורם דילול גבוה יותר אם לא הגיעו לנקודת הסיום בבדיקה הראשונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל דגימות הסרום נאספו מהמטופלים בערך באותן מסגרות זמן לאחר PrEP. הדגימות נבדקו מחמישה חולים שונים בנקודות הזמן הבאות: שבועיים לאחר החיסון הסופי נגד כלבת, 6 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת ו-18 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת. כל דגימת סרום דוללה בסדרות ודורגה הן עבור נוכחות IgM והן עבור נוכחות IgG, כמתואר בשלבי פרוטוקול 5.2 ו-5.3. ערך הנוגדנים שהוקצה מייצג את גורם הדילול שבו הדגימה הגיעה לציון נקודת קצה של 1-2+.

התוצאות מהבדיקה בכל נקודת זמן לאחר PrEP מדגימות את היכולת של הבדיקה לזהות רמות משתנות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת IFA מנצלת קומפלקס נוגדנים אנטיגן, המאפשר אתר תיוג כדי להמחיש נוגדנים ספציפיים לכלבת. תאי נוירובלסטומה או BHK נזרעים על שקופיות מיקרוסקופ מרובות בארות מצופות PTFE ומחוסנים בזן מעבדה של נגיף הכלבת CVS-11. ברגע שהחד-שכבה מתמזגת והתאים מגיעים להדבקה הרצויה של כ-50%, השקופיות מאוחסנות עד שהן מוכנות לשימוש6.

סרום המטופל או CSF מוחל על חד-שכבה של התא הנגוע ומודגר כדי לאפשר לכל נוגדנים ספציפיים לכלבת להיצמד לאנטיגןהנגיף 7. לאחר הליך שטיפה, מוחל נוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה למרכז וודסוורת' של מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק על תמיכתו בפרויקט זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כיסוי זכוכית 25x55 מ"מ מחליקכל
אצטוןכל
אנטי אנושי IgG מתויג מצומדSigma-AldrichF9512
אנטי אנושי IgM מתויג מצומדSeraCare5230-0286
קצה פיפטה שואבכל
BHK-21 תאיםATCCCCL-10
BION IFA מדללMBL BIONDIL-9993
תרבית תאים מיםסיגמא-אולדריץ'W3500EGM
צנצנות קופליןכל
סרום בקר עוברי Sigma-AldrichF2442EGM
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITCכל
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G7893
Mountant Gullsorb IgM מגיב אינאקטיבציהפישר סיינטיפיק23-043-158IgG מגיב אינאקטיבציה
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G-7513EGM
מינימום עיט מדיה חיוני – עם ארל מלחים, L-גלוטמין וחומצות אמינו לא חיוניות, ללא נתרן ביקרבונטSigma-AldrichM0643EGM
תאי נוירובלסטומה של עכברATCCCCL-131
מגלשות זכוכית ציפוי PTFE מרובות בארותכל
PBSכלpH 7.6 
פניציליןSigmaP-3032EGM
כלבת ישיר נוגדן פלואורסצנטי מצומדMillipore Sigma5100, 5500, 6500, RU5100 או RU5500
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichS-5761EGM
נתרן כלוריד גבישיםSigma-AldrichS5886סטרילית הרכסה
כל
מלח סטרפטומיצין סולפטסיגמאS9137EGM
Trizma גבישים מוגדרים מראש pH 9.0סיגמא-אולדריץ'S9693
מרק פוספט טריפטוזBD260300EGM
תערובת ויטמיניםסיגמא-אולדריץ'M6895EGM
טפטפת רנטנט

מקורות

  1. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
  2. Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
  3. Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
  4. Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
  5. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  6. Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
  7. Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
  8. Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
  9. Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
  10. Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
  11. Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בדיקת IFA לכלבתזיהוי נוגדנים לכלבתנוגדני IgGטיפול מניעתי לפני חשיפהדגימות סרוםמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתאיזוטיפים של נוגדניםבדיקת נוגדנים מנטרלים
איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.