שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.

Abstract

לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.

בשל רוחב הווריאציות בתוך הז'אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.

במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.

Introduction

הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית¹. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 2020².

הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)³. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם "חיידקים טובים" בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות צריכת זנים שונים 4,5,6,7. הקלות שבה הם יכולים לנווט במערכת העיכול⁸ וקבלתם הציבורית משתלבים יחד כדי למצב את זני Lactobacillaceae כמועמדים חזקים כמו אורגניזמים שלדה ליישומים רפואיים, טיפוליים או אבחוניים הניתנים לבליעה.

המגוון הרחב של המאפיינים הקיימים במשפחת Lactobacillaceae הוביל למצב שבו אין זן מודל אורגניזם דה פקטו; קבוצות מחקר נטו לבחור מינים בעלי התכונות הרלוונטיות ביותר למטרותיהם הספציפיות. (לדוגמה, מעבדות תסיסה של מוצרי חלב יכולות לבחור ב-L. lactis; מחקרים על תסיסה צמחית עשויים לבחור ב-L. plantarum; מחקר על פרוביוטיקה עשוי להתמקד ב-L. acidophilus; וכן הלאה.)

אותו מגוון רחב של מאפיינים בין מינים שונים הוביל להצטברות של פרוטוקולים ופרוצדורות שעשויים לעבוד היטב עבור תת-קבוצה אחת של משפחת Lactobacillaceae , אך דורשים אופטימיזציה כדי לעבוד ביעילות (או אולי לתפקד בכלל) באחרים⁹. הצורך הזה באופטימיזציה בין בני משפחה ואפילו בתוך בני אותו מין יכול לסכל את מאמציהם של חוקרים לא מוכרים. פרוטוקולים המתפרסמים במדורי השיטות של מאמרים יכולים לכלול גם שינויים משלהם¹⁰, מה שמוביל לאוספי פרוטוקולים מקוטעים ומבוזרים.

L. reuteri נחשב לקומנסל נפוץ של בעלי חוליות, ונמצא באופן עקבי ביונקים, עופות¹¹ ודגים¹² במערכת העיכול (GI). תת-זנים של L. reuteri מתמחים לעתים קרובות גנטית, באמצעות הסתגלות חלבון הידבקות ריר, כדי ליישב באופן קבוע יותר פונדקאים מקומיים ספציפיים 8,11,13. מיני Limosilactobacillus במערכת העיכול יכולים להיות מבודדים בפונדקאים מחוץ לפונדקאי המקומי שלהם, אך נוטים יותר לטבע חולף⁸.

בשל התמחות האדם-מארח, L. reuteri DSM20016 ממצב את עצמו היטב כמארז ליישומים אבחוניים או טיפוליים בכל נקודה במערכת העיכול האנושית, והמאמץ DSM20016 יכול לספק חלון השפעה ארוך טווח יותר להתערבויות בהשוואה לזנים חולפים יותר.

במאמר זה, אנו מתארים סדרה של פרוטוקולים עם יעילות מוכחת ב- Limosilactobacillus reuteri (ייעוד זן: F275; מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם מידע מרוכז על הזן ממקורות אחרים כדי לסייע ביישומים ביולוגיים מולקולריים ומערכתיים. הנהלים המפורטים כאן צריכים לאפשר לחוקר ללא ניסיון קודם לתרבית L. reuteri, ליצור מלאי אלקטרוכשיר, לבחור מושבות מותמרות, לאשר טרנספורמציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR), ולמדוד תגובת מערכת מתוכננת באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטי.

נציין כי פרוטוקולים קשורים כיסו רקומבינציה מחדש של גנום SSDNA בסיוע CRISPR-Cas9 ב- L. reuteri (זן: ATCC-PTA-6475)14, ועריכת גנום בסיוע CRSIPR-Cas9 nickase במספר רב שאינו L. ראוטרי, Lactobacillaceae משפחה כתמים^15,16; עם זאת, אלה אינם מתייחסים לזן L. reuteri DSM20016 שבו אנו מתמקדים כאן.

Protocol

1. הכנת L. reuteri DSM20016 תאים אלקטרוכשירים

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול של Berthier et ^al.17, עם מהירויות צנטריפוגה שהודיעו על ידי Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, יש לחסן את L. reuteri ממלאי גליצרול ל-6 מ"ל של מרק deMan Rogosa Sharpe (MRS). יש לדגור באופן אירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
2. למחרת בבוקר, לחסן 4 מ"ל של תרבית לילה לתוך 200 מ"ל של מרק MRS (דילול 1:50).
3. אפשר לגדול באופן אירובי באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס עד שערך הצפיפות האופטית של 600 ננומטר (OD600) יגיע ל 0.5-0.85; זה אמור לקחת בערך 2-3 שעות.
4. ברגע שמגיעים לערך OD600 הולם, מרוקנים את המדיה לצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל ומניחים על קרח תוך איזון הצינורות.
5. צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות 5,000 x גרם בצנטריפוגה מצוננת מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש כל גלולה ב-50 מ"ל של ddH₂O מקורר מראש (0°C עד 4°C), וצנטריפוגה שוב עם אותן הגדרות כמו השלב הקודם. שמור את התאים על קרח ככל האפשר.
7. חזור על שלב 1.6.
8. להשהות כל גלולה ב 25 מ"ל של ddH₂O: 0.5 M סוכרוז, 10% גליצרול. צנטריפוגה ב-5,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והחזירו את התאים לקרח.
9. להשעות מחדש את כל הכדורים באותו 2 מ"ל של ddH₂O: 0.5 M סוכרוז, 10% גליצרול.
10. Aliquot לתוך 50 μL עד 100 μL מנות בצינורות microcentrifuge מצוננים מראש; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

2. אלקטרופורציה של L. reuteri

הערה: הימנע ככל האפשר pipetting בשלבים הבאים. מומלץ לכלול אלקטרופורציה מבוקרת, ללא תוספת פלסמיד, כדי להבטיח שבחירת האנטיביוטיקה מספקת.

1. קח אלקטרוכשיר שלם L. reuteri aliquot והפשיר אותו על קרח.
2. מערבבים בעדינות 5 μL עד 10 μL של פלסמיד (ריכוז פלסמיד סופי >6 ננומטר) לתוך aliquot מופשר, הימנעות pipetting ככל האפשר.
3. מעבירים לקובט אלקטרופורציה מקורר קרח ברווח של 1 מ"מ.
4. אלקטרופורטאט ב-1.25 kV, 400 Ω ו-25 μF.
5. מוסיפים 1 מ"ל של מרק MRS בטמפרטורת החדר (RT) ומערבבים על ידי היפוך הקובט פעם או פעמיים.
6. הכניסו את הקוביות לאינקובטור סטטי בטמפרטורה של 37°C למשך 2.5-3 שעות כדי לאפשר התאוששות.
7. לוחים את כל הכמות על מספר צלחות אגר MRS עם בחירה מתאימה.
8. הניחו את הצלחות בתוך מיכל אטום לחלוטין עם נר דולק קטן ("אור תה") ושקית אנאירובית היוצרת אווירה.
9. גדל ב 37 ° C במשך 2-3 ימים או עד מושבות גלויות נוכחים.

3. מדידת חלבון הכתב הפלואורסצנטי העמיד לחומצה, mCherry2

1. בחר את כל המושבות הדרושות למדידה וחסן לתוך microplate אחסון 96 בארות עם 1.5 מ"ל של מסנן מעוקר (לא autoclaved) מרק MRS לכל באר ואנטיביוטיקה בחירה מתאימה.
2. יש לדגור באופן אירובי במשך 24 שעות לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.
   הערה: יש לשמור מיקרו-צלחת אחסון זו לשימוש בסעיף 4 (מושבה PCR).
3. L. reuteri יזרז החוצה מהתקשורת כאשר בשלב נייח; להשעות מחדש את תרבות הלילה באמצעות פיפטינג.
4. העבירו 200 μL לצלחת שטוחה, בעלת תחתית שקופה, בעלת 96 בארות, העבירו את הצלחת לקורא לוחות, ומדדו את ה-OD והפלואורסצנטיות של mCherry2 (עירור [לדוגמה]: 589 ננומטר; פליטה [Em]: 610 ננומטר) או כתבים רלוונטיים אחרים.

4. אישור ספיגת פלסמיד באמצעות PCR מושבה

1. מתוך microplate אחסון 96 באר מקטע 3, להעביר 5 μL לצינור PCR.
   הערה: אם חלפו >5 דקות, ייתכן שיהיה צורך להשעות מחדש את L. reuteri פעם נוספת.
2. במיקרו-צנטריפוגה ניידת, סובבו כלפי מטה עד שניתן לראות את הגלולה (בערך 2 דקות ב-2,000 x גרם), השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר של 20 מילימטר NaOH.
3. מרתיחים בחום של 95°C למשך 5 דקות, מערבולת, וחוזרים על הרתיחה פעם נוספת.
4. מיד לצנן את הדגימות; נסו לשמור את הדגימות על קרח ככל האפשר בשלבים הבאים כדי להפחית את הסבירות לפירוק תבנית ועיכוב PCR.
5. יש לסובב מטה במיקרו-צנטריפוגה ניידת במהירות של 2,000 x גרם למשך 2 דקות עד שפסולת התא נפלטת, ואז לקחת 1 μL של הסופרנאטנט ולמהול ל-99 μL של ddH₂O נטול DNase ו-RNase קר כקרח (דילול של 100x).
6. השתמש בדילול 100x כתבנית DNA בתגובת PCR סטנדרטית באמצעות פריימרים ספציפיים לפלסמיד. כלול בקרה חיובית עם פלסמיד נגזר E. coli מיני הכנה.
7. מחזירים את הדגימות על קרח ומוסיפים צבע העמסה מתאים בריכוז 1x.
8. יש להפעיל בג'ל אגרוז 1% במאגר TAE (חומצה טריס-אצטט-אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA]) במתח של 110 וולט למשך 30 דקות. תמונה במידת הצורך.

5. פרוטוקול מיני הכנה עבור L. reuteri , ואחריו PCR כדי לאשר נוכחות פלסמיד

הערה: פרוטוקול המיועד לשימוש עם ערכת ההכנה הקטנה המפורטת בטבלת החומרים.

1. יש לחסן את L. reuteri ב-10 מ"ל של מרק MRS המכיל אנטיביוטיקה מתאימה ולדגור במשך הלילה באופן אירובי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור סטטי.
2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוננת מראש של 4°C.
3. יש לשטוף את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ P1 סטנדרטי (המצורף לערכה) על מנת לשלול חומציות שעלולה להפריע לשלבים מאוחרים יותר, צנטריפוגה עם אותה הגדרה שתוארה קודם לכן, ולהשליך את הסופרנטנט.
4. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-250 μL של חיץ P1 שונה המכיל 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים ו-100 U/mL מוטנוליזין על מנת ליזה תאי חיידקים. לדגור במשך 1-2 שעות ב 37 ° C.
5. הוסיפו 250 μL של חיץ P2, ערבבו על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים, ודגרו ב-RT לא יותר מ-5 דקות.
6. הוסף 350 μL של חיץ N3 (כלול בערכה) ומיד להפוך ארבע עד שש פעמים בעדינות כדי לערבב.
7. צנטריפוגה ברזולוציה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות.
8. מעבירים כמה שיותר סופרנאטנט לעמוד ספין וצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה.
9. שטפו את עמוד הסחיטה עם 500 מיקרוליטר של PB חיץ (כלול בערכה) וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה.
10. שטפו את עמוד הסחיטה עם 750 מיקרוליטר של PE חיץ (כלול בערכה), וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה והצנטריפוגה למשך 60 שניות כדי להסיר כל חיץ שיורי.
11. מקם את עמוד הסחרור בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. יש למרוח 20-30 μL של ddH 2 O נטול DNAse ו-RNAse על המסנן של עמוד הספין ולהשאיר למשך_1-2דקות, לפני צנטריפוגה של 10,000 x גרם למשך 60 שניות.
12. בצע תגובת PCR סטנדרטית באמצעות פריימרים ספציפיים לפלסמיד (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGACA), כאשר אלואט מספק את ה- DNA של התבנית. כלול בקרה חיובית עם פלסמיד נגזר E. coli מיני הכנה.
    הערה: הגדרות ה-PCR המשמשות במחקר זה הן: 98°C למשך 5 דקות, (98°C למשך 30 שניות, 55°C למשך 30 שניות, 72°C למשך 45 שניות) 30 מחזורים, 72°C למשך 2 דקות, החזקה של 4°C. הפרמטרים תלויים מאוד בפולימראז בו נעשה שימוש, באורך המקטע ובפריימרים המדויקים המשמשים כל אדם המשתמש בפרוטוקול זה.

Results

יעילות טרנספורמציה
L. reuteri אינו דורש פלסמיד dcm^-/dam^- ללא מתילציה, כפי שנצפה עבור לקטובצילאים^{אחרים 19,20} (ראה איור 1). אלקטרופורציה של L. reuteri DSM20016 עם 10 μL של pTRKH3_mCherry2 פלסמיד 8.5 kb (pAMβ1 theta origin of replication) אמורה לתת יעילות טרנספורמציה של בערך 80 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/μg (חמש עד שמונה מושבות לכל 200 μL מצופה), ללא קשר למצב מתילציה פל...

Discussion

השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני השלבים הקריטיים האלה, יעילות הטרנספורמציה עדיין מהווה מגבלה על ניסויים, מאחר שמספר המושבות הצפויות יכול להגיע ל-1 או 2 לכל צלחת במהלך טרנספורמציות (ראו איור 1).

מיכ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb פלוס סולם DNA	NEB	N3200L
1mL ספקטרופוטומטר קובטות	תומאס סיינטיפיק	1145J12
אגרוז	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (צנטריפוגה מקוררת)	בקמן אלגרה	N/A	כבר לא בייצור
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 מערכת אלקטרופורציה	VWR	58017-984
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)	FroggaBio	TB50-500
DNA ג'ל x6 טוען צבע	NEB	B7024S
קובטת אלקטרופורציה	Fisherbrand	FB101
אריתרומיצין	Millipore Sigma	E5389-5G
ג'ל אלקטרופורציה אמבטיה/תחנת עגינה	VWR	76314-748
גליצרול	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ		ייעוד זן DSM20016 F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.7 מ"ל)	FroggaBio	LMCT1.7B
ערכת מיני-פרפ (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP הוחלף במכונן, ממוטב קודון, מדווח mCherry2 חלבון
מרק MRS (מיובש)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 פיפטה	Eppendorf	3123000047
P1000 פיפטה	Eppendorf	3123000063
P2.5 פיפטה	Eppendorf	3123000012
P20 פיפטה	Eppendorf	3123000039
P200 פיפטה	Eppendorf	3123000055
צינורות PCR	FroggaBio	STF-A120S
מיקרוצנטריפוגה שולחנית אישית	Genlantis	E200100
צלחות פטרי	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	כבר לא בייצור
pTRKH3_slpGFP (שונה)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 ספקטרופוטומטר	תרמו Scientific	840-281700
אחסון מיקרופלייט	פישר סיינטיפיק	14-222-225
סוכרוז	ביושופ	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
מערבולת	VWR	58816-121	כבר לא בייצור
חממת VWR 1500E	VWR	N/A	כבר לא בייצור