פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
שברי גדיל כפול (DSB) הם אחד הנגעים החמורים ביותר שיכולים להתרחש בגרעין התא, ואם לא יתוקנו, הם יכולים להוביל לתוצאות חמורות, כולל סרטן. התא, אם כן, מסופק עם מנגנונים מורכבים לתיקון DSBs, ומסלולים אלה כוללים היסטון H2AX בצורתו הזרחנית ב- Ser-139 (כלומר γH2AX) וחלבון קושר p53 1 (53BP1). מכיוון ששני החלבונים יכולים ליצור מוקדים באתרי DSBs, זיהוי סמנים אלה נחשב לשיטה מתאימה לחקור הן את DSB והן את קינטיקה התיקון שלהם. על פי התהליכים המולקולריים המובילים להיווצרות מוקדי γH2AX ו-53BP1, זה יכול להיות שימושי יותר לחקור את הלוקליזציה המשותפת שלהם ליד ה-DSB על מנת להקים גישה חלופית המאפשרת לכמת DSB על ידי זיהוי סימולטני של שני סמני נזק לדנ"א. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הנזק הגנומי הנגרם בלימפוציטים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין באמצעות נוכחות של מוקדי γH2AX ו- 53BP1 באימונופלואורסנציה כפולה. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו גם את השונות במספר מוקדי γH2AX ו-53BP1 לאורך זמן, כניסיון ראשוני לחקור את קינטיקה התיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין.
מבוא
נזק לדנ"א נגרם באופן מתמשך על ידי חומרים שיכולים להיות אנדוגניים, כגון ROS שנוצר על ידי מטבוליזם חמצוני תאי, או אקסוגני, הן כימיקלים והן פיזיים1. בין הנגעים המזיקים ביותר, שברים דו-גדיליים (DSB) ממלאים תפקיד בסיסי בתרומה לאי יציבות גנומית, שכן הם גורמים לסטיות כרומוזומים שבתורן יכולות להתחיל את תהליך הקרצינוגנזה. לפיכך, תאים מסופקים עם מנגנונים מורכבים ויעילים של DSB תיקון2.
כאשר DSB מתרחש, התא מפעיל את תגובת הנזק לדנ"א (DDR) שבה, יחד עם קומפלקס MRE11/RAD50/NBS1, קינאזות ATM או ATR מגויסות כדי להפעיל חלבונים אחרים שמאטים או עוצרים את מחזור התא3. מטרה חיונית של קינאזות א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר אושר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פיזה, והתקבלה הסכמה מדעת וחתומה מכל תורם.
1. היווצרות מוקדי γH2AX ו- 53BP1
- הכנת דגימות וטיפול מוטגני
- איסוף דגימות דם שלמות על ידי ניקור מאנשים בוגרים בריאים בצינורות איסוף דם (למשל, Vacutainer) המכילים ליתיום הפרין כנוגד קרישה.
- על מנת להבטיח שימור דגימת דם תקין, יש להתחיל את ההליך תוך 24 שעות מרגע הדגימה.
- הוסף 300 μL של הדגימה לצינור המכיל 4.7 מ"ל של מדיום מלא (0.5% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.75% phytohemagglutinin, 10% FBS מושבת בעבר, 88.75% RPMI 1640).
- לאחר מכן הוסיפו בלומיצין סולפט לריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל.
זהירות: בל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נתונים המתקבלים על ידי ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לימפוציטים היקפיים מאפשרים לנו להעריך שלושה היבטים עיקריים: היעילות של טיפול בלומיצין בהגדלת מספר מוקדי γH2AX ו- 53BP1 (ולכן של DSBs) בשל השפעתו המוטגנית, באיזו מידה שני מוקדים לוקליזציה משותפת באתר של DSBs, ואת מהלך הזמן של γH2AX ו 53BP1 מוקדים כדי לשרטט את קינטיקה תיקון של DSB המושרה בלומיצין. כצפוי, נצפתה תדירות גבוהה מאוד של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בין תאים לא מטופלים לתאים מטופלים, מה שמאשר כי בלומיצין גורם להיווצרות DSB בלימפוציטים היקפיים (איור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתוח אימונופלואורסנציה של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא שיטה מתאימה להערכת נזק גנומי בגרעינים בין-פאזיים של מערכת תאים. הליך זה יש כמה נקודות קריטיות שיכולות להשפיע על התוצאה של הניסויים, בעיקר, הסוכנים המשמשים קיבוע וחדירה, סוג הנוגדנים וגורמי דילול שלהם, ואת ריכוז של mutagen.
שמירה על שלמות החלבון היא בסיסית שכן שיטת immunofluorescence מצפה לזהות אנטיגנים כי הם בעיקר חלבונים. בפרוטוקול זה, מתנול משמש לתיקון לימפוציטים. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאלכוהול פועל על ידי החלפת מים וגרימת משקעים של חלבו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו אסירי תודה לכל תורמי הדם ולכל אנשי הצוות הרפואי שלקחו את דגימות הדם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 568 עז נגד עכבר IgG (&גמא; 1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 נוגדן משני |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100X | Euroclone | ECB3001D | אנטיביוטיקה לתרבית מדיום |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered |
| FBS | Euroclone | EC20180L | סרום בקר עוברי לאימונופלואורסצנציה |
| עיזים אנטי ארנב IgG (H + L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | # 35552 | γ נוגדן משני H2AX |
| עכבר אנטי-53BP1 נוגדן חד שבטי | Merck | MAB 3802 | 53BP1 נוגדן ראשוני |
| Labophot 2 | מיקרוסקופ פלואורסצנטי | של ניקון | |
| P-histone H2AX (Ser139) נוגדן ארנב | איתות תאים | #2577 | γ נוגדן ראשוני H2AX |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 רכיב של מדיום תרבית | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI לצביעה נגדית |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | תרבית מדיום |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | חומר ניקוי לא יוני עבור חדירות |
מקורות
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
