מאמר שיטה

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

DOI:

10.3791/65472

⸱

14 ביולי 2023

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שברי גדיל כפול (DSB) הם אחד הנגעים החמורים ביותר שיכולים להתרחש בגרעין התא, ואם לא יתוקנו, הם יכולים להוביל לתוצאות חמורות, כולל סרטן. התא, אם כן, מסופק עם מנגנונים מורכבים לתיקון DSBs, ומסלולים אלה כוללים היסטון H2AX בצורתו הזרחנית ב- Ser-139 (כלומר γH2AX) וחלבון קושר p53 1 (53BP1). מכיוון ששני החלבונים יכולים ליצור מוקדים באתרי DSBs, זיהוי סמנים אלה נחשב לשיטה מתאימה לחקור הן את DSB והן את קינטיקה התיקון שלהם. על פי התהליכים המולקולריים המובילים להיווצרות מוקדי γH2AX ו-53BP1, זה יכול להיות שימושי יותר לחקור את הלוקליזציה המשותפת שלהם ליד ה-DSB על מנת להקים גישה חלופית המאפשרת לכמת DSB על ידי זיהוי סימולטני של שני סמני נזק לדנ"א. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הנזק הגנומי הנגרם בלימפוציטים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין באמצעות נוכחות של מוקדי γH2AX ו- 53BP1 באימונופלואורסנציה כפולה. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו גם את השונות במספר מוקדי γH2AX ו-53BP1 לאורך זמן, כניסיון ראשוני לחקור את קינטיקה התיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נזק לדנ"א נגרם באופן מתמשך על ידי חומרים שיכולים להיות אנדוגניים, כגון ROS שנוצר על ידי מטבוליזם חמצוני תאי, או אקסוגני, הן כימיקלים והן פיזיים1. בין הנגעים המזיקים ביותר, שברים דו-גדיליים (DSB) ממלאים תפקיד בסיסי בתרומה לאי יציבות גנומית, שכן הם גורמים לסטיות כרומוזומים שבתורן יכולות להתחיל את תהליך הקרצינוגנזה. לפיכך, תאים מסופקים עם מנגנונים מורכבים ויעילים של DSB תיקון2.

כאשר DSB מתרחש, התא מפעיל את תגובת הנזק לדנ"א (DDR) שבה, יחד עם קומפלקס MRE11/RAD50/NBS1, קינאזות ATM או ATR מגויסות כדי להפעיל חלבונים אחרים שמאטים או עוצרים את מחזור התא3. מטרה חיונית של קינאזות אלה היא היסטון H2AX, אשר פוספורילציה על Ser-139 בתוך כמה מגה-בסיסים מן DSB (כלומר γH2AX), ובכך מאפשר גיוס של מספר גורמי תיקון כגון, בין היתר, BRCA1 ו p53 קושר חלבון 1 (53BP1)3. מאוחר יותר, מסלול אחד בין רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), או חישול חד-גדילי (SSA) מופעל כדי לתקן את DSBs 4,5. לכן, 53BP1 מעורב בהכתבת הבחירה בין HR או NHEJ, בעיקר קידום ההפעלה של NHEJ ולא HR6. יתר על כן, הן הצורה הזרחנית של היסטון H2AX והן 53BP1 יכולות ליצור מוקדים באתרי DSB. מכיוון שמוקדים אלה נמשכים עד לשחזור שלמות הגדיל הכפול, הערכת המראה / היעלמות של מוקדי γH2AX או 53BP1 במרווח זמן נחשבת לשיטה שימושית להערכת המופע והתיקון של DSB במערכת התא 6,7. עם זאת, על פי התהליכים המולקולריים שתוארו לעיל, מכיוון שמוקדי γH2AX ו- 53BP1 צפויים להתמקם יחד ליד ה- DSB במהלך DDR8,9, זה יכול להיות שימושי לזהות בו זמנית את נוכחותם של סמנים אלה באימונופלואורסנציה כפולה.

לפיכך, מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמתם של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בו זמנית כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין. באמצעות אותה מתודולוגיה, ניסינו גם להגדיר קינטיקה של תיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין על פי הליך ניסיוני10 שהוקם בעבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פיזה, והתקבלה הסכמה מדעת וחתומה מכל תורם.

1. היווצרות מוקדי γH2AX ו- 53BP1

  1. הכנת דגימות וטיפול מוטגני
    1. איסוף דגימות דם שלמות על ידי ניקור מאנשים בוגרים בריאים בצינורות איסוף דם (למשל, Vacutainer) המכילים ליתיום הפרין כנוגד קרישה.
    2. על מנת להבטיח שימור דגימת דם תקין, יש להתחיל את ההליך תוך 24 שעות מרגע הדגימה.
    3. הוסף 300 μL של הדגימה לצינור המכיל 4.7 מ"ל של מדיום מלא (0.5% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.75% phytohemagglutinin, 10% FBS מושבת בעבר, 88.75% RPMI 1640).
    4. לאחר מכן הוסיפו בלומיצין סולפט לריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל.
      זהירות: בלומיצין סולפט הוא מוטגן. יש להימנע ממגע עם העור ומשאיפה. הכינו את הפתרון והוסיפו את הדגימה מתחת למכסה המנוע.
    5. עבור כל דגימה, הגדר בקרה שלילית (היעדר mutagen).
    6. הניחו את הצינור בתרמוסטט בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
  2. קיבוע
    1. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה עם מערבולת.
    3. הוסף 5 מ"ל של תמיסה היפוטונית (2.87 גרם של KCl מומס ב 500 מ"ל של מים deionized) ו 400 μL של תמיסה מראש קיבוע (5: 3 חומצה אצטית: מתנול) כדי לגרום המוליזה של כדוריות דם אדומות.
    4. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל מתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי לתקן את התאים.
    6. לחלופין, אחסנו את התאים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  3. הכנת שקופיות
    1. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מתנול 3:1: תמיסת חומצה אצטית. חזור על שלבים אלה פעם נוספת.
    3. בסוף, צנטריפוגה את התמיסה שוב ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. שאפו שוב את הסופרנאטנט והשאירו מספיק תמיסה (0.5 מ"ל) כדי להשעות מחדש את הכדורית, פיפטה במרץ, להפיל את גלולת התא המרחפת על המגלשות ולייבש באוויר. אחסן את השקופיות ב- 4 ° C.
  4. אימונופלואורסנציה
    הערה: אימונופלואורסנציה היא שיטה אימונולוגית לזיהוי מטרות תאים ספציפיות באמצעות נוגדן ראשוני הקושר את המטרה עצמה ונוגדן משני פלואורסצנטי הקושר את הראשוני המאפשר למקם את המטרה11. במקרה זה, עכבר חד שבטי anti-53BP1 (1:50) ו ארנב רב שבטי anti-γH2AX (1:50) משמשים נוגדנים ראשוניים, בעוד AlexaFluor568 נגד עכבר (1:400) ו DyLight488 נגד ארנב (1:200) משמשים נוגדנים משניים, בהתאמה.
    1. שטפו את המגלשות פעמיים ב-50 מ"ל של 1x PBS במשך 5 דקות בצנצנת קופלין (16 שקופיות גב אל גב).
    2. לאחר מכן שמור אותם למשך 30 דקות בתמיסת חסימה (10 מ"ל של FBS, 10 מ"ל של 10x PBS, 80 מ"ל של מים נטולי יונים, 300 מיקרוליטר של Triton-X).
    3. הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    4. לאחר הדגירה, יש לבצע שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.
    5. הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
    6. בצעו שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.
    7. הוסף 2.5 μL של תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI על הכיסויים לפני ההרכבה כדי להכתים את הגרעינים.
      הערה: על מנת להעריך קינטיקה מוקדית, ההליך זהה למתואר מ 1.1 ל 1.4, וציין כי קצירת תאים ואת immunofluorescence כפול מבוצעים ב 0 שעות, לאחר 2 שעות לאחר טיפול bleomycin ולאחר מכן, לאחר הסרת mutagen, ב 4 שעות, 6 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול.

2. ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: "מיקרוסקופ פלואורסצנטי" מתייחס לכל מיקרוסקופ המשתמש בפלואורסצנטיות כדי ליצור תמונה. הדגימה מוארת באור מסוים (או אורכי גל) הנבלע על ידי הפלואורופורים, מה שגורם להם לפלוט אור באורכי גל ארוכים יותר12. AlexaFluor568 ו-DyLight 488 בולעים אור של כ-568 ו-488 ננומטר ופולטים אור של 603 ו-520 ננומטר, בהתאמה. לכן, הם נראים כמו פלואורסצנטיות אדומה או ירוקה באמצעות מסנן TRITC או FITC, בהתאמה.

  1. דרג את נוכחות המוקדים בכל שקופית תחת יעד טבילה של 100x (איור 1).
  2. הניחו 200 גרעינים בכל שקופית וספרו את מספר מוקדי γH2AX/53BP1 בכל גרעין.
  3. תוצאות אקספרס במונחים של מספר המוקדים הממוצע לכל סך הגרעינים שדורגו. אלה כוללים גרעיני γH2AX/53BP1 חיוביים (מראים לפחות אות פלואורסצנטי אחד) ושליליים (לא מראים אות פלואורסצנטי אחד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתונים המתקבלים על ידי ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לימפוציטים היקפיים מאפשרים לנו להעריך שלושה היבטים עיקריים: היעילות של טיפול בלומיצין בהגדלת מספר מוקדי γH2AX ו- 53BP1 (ולכן של DSBs) בשל השפעתו המוטגנית, באיזו מידה שני מוקדים לוקליזציה משותפת באתר של DSBs, ואת מהלך הזמן של γH2AX ו 53BP1 מוקדים כדי לשרטט את קינטיקה תיקון של DSB המושרה בלומיצין. כצפוי, נצפתה תדירות גבוהה מאוד של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בין תאים לא מטופלים לתאים מטופלים, מה שמאשר כי בלומיצין גורם להיווצרות DSB בלימפוציטים היקפיים (איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח אימונופלואורסנציה של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא שיטה מתאימה להערכת נזק גנומי בגרעינים בין-פאזיים של מערכת תאים. הליך זה יש כמה נקודות קריטיות שיכולות להשפיע על התוצאה של הניסויים, בעיקר, הסוכנים המשמשים קיבוע וחדירה, סוג הנוגדנים וגורמי דילול שלהם, ואת ריכוז של mutagen.

שמירה על שלמות החלבון היא בסיסית שכן שיטת immunofluorescence מצפה לזהות אנטיגנים כי הם בעיקר חלבונים. בפרוטוקול זה, מתנול משמש לתיקון לימפוציטים. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאלכוהול פועל על ידי החלפת מים וגרימת משקעים של חלבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לכל תורמי הדם ולכל אנשי הצוות הרפואי שלקחו את דגימות הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AlexaFluor 568 עז נגד עכבר IgG (&גמא; 1)InvitrogenA2112453BP1 נוגדן משני
BleoprimSanofibleomycin sulfate (mutagen)
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100XEurocloneECB3001Dאנטיביוטיקה לתרבית מדיום
PBS 10XTermofisher14200075Phosphate-buffered
FBSEurocloneEC20180Lסרום בקר עוברי לאימונופלואורסצנציה
עיזים אנטי ארנב IgG (H + L) DyLight 488 ConiugatedTermofisher# 35552γ נוגדן משני H2AX
עכבר אנטי-53BP1 נוגדן חד שבטיMerckMAB 380253BP1 נוגדן ראשוני
Labophot 2מיקרוסקופ פלואורסצנטישל ניקון
P-histone H2AX (Ser139) נוגדן ארנבאיתות תאים#2577γ נוגדן ראשוני H2AX
PhytohemoagglutininTermofisherR30852801 רכיב של מדיום תרבית
Prolong gold antifade reagent with DAPICell Signaling#8961תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI לצביעה נגדית
RPMI 1640EurocloneECB9006Lתרבית מדיום
Triton-X100SigmaT9284חומר ניקוי לא יוני עבור חדירות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853(2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

gamma H2AX53BP1DNA

מאמרים קשורים