מאמר שיטה

סינון אנלוגי פנטניל באמצעות LC-TIMS-TOF MS/MS

DOI:

10.3791/65562

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה לסינון אנלוגים של פנטניל המבוססת על זמן השמירה שלהם, ניידות ותבנית פיצול ספקטרומטריית מסות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בפנטניל והופעתם של אנלוגים פנטניל בעשורים האחרונים הפכו לדאגה גוברת לקהילה בכללותה. פנטניל והאנלוגים שלו הם התורמים העיקריים למנת יתר קטלנית ולא קטלנית בארצות הברית. רוב המקרים האחרונים של מנת יתר הקשורה לפנטניל קשורים לפנטניל המיוצר באופן לא חוקי ולעוצמה הקיצונית הנלווית אליו. בעבודה הנוכחית, אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בעל תפוקה גבוהה להקרנה של אנלוגים פנטניל. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות טנדם מאפשרים הפרדה והקצאה של מאות אנלוגים של פנטניל מדגימה אחת בסריקה אחת. הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחות האחרונה של רכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף באמצעות דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. אנלוגים פנטניל מוקצים בביטחון מבוסס על זמן השמירה שלהם, ניידות, דפוס פיצול MS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פנטניל והאנלוגים שלו הם התורמים העיקריים למנת יתר קטלנית ולא קטלנית בארצות הברית 1,2. המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) דיווח כי מספר מקרי המוות ממנת יתר סינתטיים הקשורים לאופיואידים בין השנים 2013 ל-2021 היה מעל 258,000. בשנת 2021 לבדה, ניתן לייחס מעל 68,000 מקרי מוות ממנת יתר לאופיואידים סינתטיים, בסך הכל 82% מכלל מקרי המוות הקשורים למנת יתר במדינה3. מאז 2013 זוהו מאות אנלוגים של פנטניל, בעוצמות משתנות4. עם הופעתם של אנלוגים פנטניל המיוצרים באופן לא חוקי, אופיואיד סינתטי לוח II עצמו נשאר אופיואיד סינתטי הפופולרי ביותר זמין בארצות הברית3. על פי המרכז למחקר וחינוך למדע פורנזי (CFSRE), אנלוג הפנטניל המדווח ביותר בשנת 2022 היה פלואורופנטניל, כאשר אופיואידים סינתטיים נוספים שאינם קשורים לפנטניל מוכנסים כעת לשוק התרופות הנדיפות בקצב מהיר5.

בשל הנפח העצום של אנלוגים הקשורים לפנטניל ופנטניל המסתובבים בשוק התרופות, ה-DEA יישמה תוכנית פרופיל חתימה של פנטניל בשם Operation Death Dragon, על מנת לעקוב אחר המתודולוגיה המשמשת לסנתוז תרכובות אלה בתקווה לקשר בין התקפים של סמים בחזרה למקורם6. בשנת 2018, 94% מהתפיסות של התרופה זוהו כמסונתזות בשיטת יאנסן, ואילו 6% הנותרים סונתזו בשיטת זיגפריד6. ההבדל העיקרי בין שתי השיטות הוא נוכחותו של אנלוגי פנטניל, בנזיל פנטניל, שזוהה כטומאה בשיטת יאנסן, ואילו נוכחותו של פנטניל דפרופיוניל (4-ANPP), מטבוליט/קודמן של פנטניל, היא טומאה שזוהתה בעת סינתזה עם שיטת זיגפריד7.

השימוש בכרומטוגרפיה של גז ונוזל בד בבד עם ספקטרומטריית מסות (GC-MS ו- LC-MS, בהתאמה) לסינון ממוקד וכימות של אופיואידים סינתטיים מיושם באופן קבוע במעבדות טוקסיקולוגיה. GC-MS נחשב לתקן הזהב לאיתור סמים של שימוש לרעה בדגימות ביולוגיות. גישה לספריות ספקטרליות המוניות זמינות לציבור8 ומכשור המשווק כמערכות plug and play9 הן חלק מהסיבות לכך ש- GC-MS נשאר חלק בלתי נפרד במעבדות הן לסינון מקיף והן לכימות ממוקד 9,10. עם זאת, שיטות הכימות הנוכחיות של GC-MS בספרות נוטות להיות בעלות היקף מוגבל של אנליטות11 והופכות במהירות למיושנות ואינן ישימות למקרים הנוכחיים. חשוב מכך, גבולות הזיהוי והכימות אינם ברי השוואה לשיטות LC-MS (< 1 ng/mL)12, ולכן מגדילים את הפוטנציאל לתוצאות שליליות שגויות. השוואה אחת כזו בין GC-MS ו- LC-MS שבחנה דגימות לאחר המוות, ציינה כי מתוך 134 מקרים שזוהו באופן חיובי של קרפנטניל, אחד האופיואידים הסינתטיים החזקים ביותר עד כה, 104 מהמקרים הללו נבדקו שליליים לקרפנטניל באמצעות GC-MS13. במעבדות ניתוח תרופות, GC-MS משמש לעתים קרובות יותר וניתן לתיקון עבור אופיואידים סינתטיים בשל הריכוז הגבוה של הדגימות שנותחו. עם זאת, GC-MS עדיין משמש בשילוב עם טכניקות נוספות כגון ספקטרוסקופיית טרנספורמציה אינפרא אדום פורייה (FT-IR) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) לאישור תרכובות אלה14. היישום של GC-MS לניתוח דגימות ביולוגיות בטוקסיקולוגיה משפטית דורש שיטות הכנת דגימות הכוללות מיצוי של תרכובות אלה באמצעות מיצוי נוזלי-נוזלי (LLE) או מיצוי בשלב מוצק (SPE)15. LLE יכול להתבצע עם מגוון רחב של ממסים, אולם במעבדה לייצור גבוה, LLE לא יכול להיות חסכוני או בזמן. LLE צורכת כמויות גדולות של ממסים כמו גם נפח דגימה, בעוד שהחלופה, SPE, יכולה להיות אוטומטית ודורשת נפח דגימה מינימלי16. מחקר GC-MS שנערך לאחרונה דיווח על הפרדה של 20 אנלוגים פנטניל איזומריים שונים באמצעות שלוש תוכניות תרמיות GC נפרדות17. בעוד ההפרדה הבסיסית בין איזומרים הייתה מוצלחת, הישימות של שיטה זו למקרים פורנזיים רלוונטיים ולזרימות עבודה מוגבלת.

LC-MS צברה פופולריות בבדיקות פורנזיות, במיוחד בשל המגבלות של GC-MS כשמדובר בתרכובות לא נדיפות ורגישות לחום18,19. בדיקות סקר LC-MS באמצעות קוואדרופולים משולשים (QQQ) ומכשור מלכודת יונים הצליחו באיתור אופיואידים סינתטיים בריכוזים נמוכים (<1 ננוגרם/מ"ל)12,20,21,22,23,24. בדרך כלל, שיטות LC-MS אלה משמשות כשיטות אישור משניות כדי להשלים תוצאות immunoassay ו / או GC-MS. בשנת 2017, Shoff et al. במעבדת הטוקסיקולוגיה של מחלקת הבוחנים הרפואיים של מחוז מיאמי-דייד (MDME) פיתחו שיטת סינון מקיפה עבור 44 תרכובות הקשורות לאופיואידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד (UHPLC)-מלכודת יונים MSn 13. בדומה לשיטות MRM ממוקדות, שיטת מלכודת יונים זו השתמשה ברשימת סימנים מקדימים מתוזמנת (SPL) המכילה זמני שמירה, יוני מטרה מקדימים, כמו גם יוני בת ראשוניים עבור פיצול ספקטרלי של MS3 במידת האפשר. מה שמבדיל בין שיטת סינון זו לבין שיטות שפותחו על מרובעים משולשים ומלכודות יונים מרובעות ליניאריות הוא הפירוט הנוסף המסופק בנתונים הספקטרליים. מה ששיטת סינון זו אינה יכולה לספק הוא ניתוח כמותי, אשר מפותח לעתים רחוקות על מכשור מלכודת יונים, כמו גם זיהוי של נעלמים13. שיטות LC-QQQ עבור אופיואידים סינתטיים יכולות בו זמנית לסנן ולכמת רשימת מטרות מוגדרת מראש. השימוש במעברי ניטור תגובה מרובים (MRM) לזיהוי וכימות של תרכובות הוא טכניקת רכישת נתונים מהימנה והיא הטכניקה הנפוצה ביותר המשמשת בספרות לזיהוי אופיואידים סינתטיים12,20. טווחים ליניאריים מדווחים לכימות מערך של אופיואידים סינתטיים נעים בין 0.01-100 ננוגרם/מ"ל, כאשר אופיואידים סינתטיים חזקים יותר, כגון קרפנטניל, זוהו בטווח תת-נ"ג/מ"ל1 1,24,25,26,27.

ההפרדה של אופיואידים סינתטיים איזומריים טופלה בשיטות LC-MS. שיטה אחת כזו הפרידה 174 אנלוגים איזומריים פנטניל בתוך זמן ריצה של 16 דקות באמצעות עמוד ביפניל28. בנוסף, תנודות בפרמטרים תלויי LC כגון יעילות עמודות, pH פאזה ניידת ושינויי לחץ יוצרים שינויי זמן שימור שיש לקחת בחשבון בבדיקות ממוקדות עם ניטור עקבי וחלונות איסוף גדולים יותר (>0.4 דקות), מה שעלול לגרום לחפיפה פוטנציאלית של איזומרים אלה לאחר שנפתרו. טכניקות כרומטוגרפיות נוספות להפרדת איזומרים נחקרו, כולל שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית (2D-LC)29; ובעוד שלטכניקה זו יש את היכולת לספק הפרדה אורתוגונלית של תרכובות, החסרונות עולים על היתרונות כולל זמני ריצה מוגזמים, עלות, קושי בפיתוח השיטה ושימושיות בהשוואה להפרדות חלופיות30.

ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS) הופכת אמינה יותר ויותר לזיהוי אופיואידים סינתטיים. מספר חברות מכשור שיווקו שיטות ממוקדות שפותחו לצורך זיהוי מגוון רחב של אופיואידים סינתטיים במטריצות ביולוגיות מורכבות 19,28,31. שיטות אלה, בניגוד לשיטות שנדונו בעבר, יכולות לאחסן נתונים אנליטיים לצורך ניתוח רטרואקטיבי. לפיכך, דגימות שנותחו בעבר עם תוצאות לא ברורות ניתן לבקר מחדש מאוחר יותר לגילוי של תרכובות שזוהו לאחרונה. מה שמפריד בין HRMS ל-QQQ הוא זיהוי המוני מדויק. בעוד ששתי הטכניקות של טרשת נפוצה יכולות לכמת במדויק בריכוזים נמוכים, HRMS הוכח כיעיל יותר לסינון ראשוני וגילוי של תרכובות לא ידועות 32,33,34. HRMS, במיוחד עם מנתחי זמן טיסה (TOF), נמצא בחזית גילוי NPS, ומאפשר למעבדות בדיקה משפטית לספק נתונים רגישים בזמן על תרכובות חדשות הן לאכיפת החוק והן לקהילה המדעית כדי להרחיב את ההתפשטות של חלק מתרכובות אלה תוך הגברת המודעות והחינוך33. השימוש ב- TOF לאיתור סמים של התעללות הפך מקיף ביותר, עם שיטות המכילות למעלה מ -600 תרכובות המופרדות בתוך תוכנית כרומטוגרפית של 10 דקות. מחקרים קודמים דווחו על היתרונות של ספקטרוסקופיית ניידות יונים לכודים (TIMS) בשילוב TOF לאיתור והפרדה של אופיואידים איזומריים35.

תוך ניצול האורתוגונליות בין כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות, השיטה המוצגת מספקת אפיון רחב של אנלוגים פנטניל המבוססים על זמן שמירה, תבנית איזוטופית, ניידות ותבנית פיצול.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדגם

  1. אחסן את ערכת ההקרנה האנלוגית פנטניל ב -20 ° C לאחר קבלתם. יש להשהות מחדש כל דגימה לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם/מ"ל על ידי תוספת של 500 מיקרוליטר מתנול טהור בדרגת LC/MS.
  2. מערבבים באמצעות מערבל צלחות או מערבולת במהירות 400 סל"ד למשך שעה או מערבולת במהירות בינונית למשך 15 דקות. לאחר ההשעיה לאחסן את הבקבוקונים ב -20 ° C.
  3. יש לדלל כל תקן לריכוז סופי של 1 ננוגרם/מ"ל באמצעות מתנול טהור בדרגת LC/MS.
  4. קבץ את התקנים לקבוצות, כך שכל קבוצה אינה מכילה תקנים איזומריים. ראה טבלה משלימה 1 לפילוח 14 קבוצות תקני פנטניל.

2. הכנת שלבים ניידים של HPLC

  1. הכן שלב A נייד (MPA) באמצעות פורמט אמוניום 5 mM/L (NH4HCO2) ב- H2O עם 0.05% חומצה פורמית (85%).
    1. שוקלים 0.078 גרם של NH4HCO2, יוצקים לתוך בקבוק נפח 250 מ"ל וממלאים במים עד כ 2/3rd. מערבלים כדי לערבב היטב.
    2. לאחר המסה מלאה, להוסיף 0.125 מ"ל של חומצה פורמית (85%). ממלאים במים עד לקו המילוי (250 מ"ל) ומערבבים.
  2. הכינו שלב B נייד (MPB) תוך שימוש ב-0.05% חומצה פורמית בתערובת מתנול אצטוניטריל ביחס 1:1.
    1. יוצקים 125 מ"ל של אצטוניטריל לתוך בקבוק נפח ומוסיפים מתנול עד שהוא מגיע לקו המילוי.
    2. מערבלים כדי לערבב היטב. מוסיפים 0.125 מ"ל של 0.05% חומצה פורמית לבקבוק ומערבבים להומוגניז.

3. פיתוח שיטת HPLC

  1. פתח את תוכנת LC למסך הבית. בטבלה לדוגמה, הממוקמת במרכז החלון, צור פרוטוקול חדש.
    1. הוסף ביאורים לעמודת הבקבוקון עם מיקום הדגימה. הוסף ביאורים לעמודת המזהה לדוגמה באמצעות תבנית YYYYMMDD_NAME (מתאר מייצג). הוסף הערות לעמודת הנפח עם נפח ההזרקה הרצוי (15 μL).
  2. הוסף ביאורים לעמודת נתיב הנתונים עם המיקום שבו הנתונים יישמרו.
  3. קלט שיטת HPLC
    1. בחר חדש בסרגל בטבלה לדוגמה הממוקמת במרכז המסך. תחת שיטת ההפרדה, בחרו בחץ הנפתח ולחצו על 'שיטה חדשה ' בחלון הקופץ.
    2. חלון חדש יופיע בתווית שיטת ההפרדה, כאן לערוך את זמן הרכישה או את שיטת מערכת מסגרת בקרת המכשירים (ICF).
    3. לחץ פעמיים על הלחצן Edit Method עבור מערכת ICF כדי לפתוח את החלון המוקפץ לעריכת השיפוע הבינארי, כפי שניתן לראות באיור 1.
    4. תחת כרטיסיית מעבר הצבע הבינארי, ייצוג חזותי של מעבר הצבע נמצא משמאל והתפלגות השיפוע נמצאת מימין, הגדר את חותמות הזמן, את קצב הזרימה ואת ריכוזי MPA ו- MPB.
    5. ודא שזמן העצירה מוגדר ל- 18 דקות, קצב הזרימה ל- 0.400 מ"ל/דקה, ומגבלת הלחץ מינימלית ומקסימלית ב- 0 psi ו- 6000 psi.
    6. הגדר את ריכוזי חותמת הזמן באופן הבא:
      בשעה 0.00 דקות, הגדר ריכוז B ל- 20.0.
      ב 1.50 דקות, להגדיר ריכוז B על 25.0.
      ב-3.00 דקות, כוונו את ריכוז B ל-27.0.
      ב-6:00 דקות, הגדירו את ריכוז B ל-27.0.
      ב-6.50 דקות, הגדירו את ריכוז B ל-30.0.
      בשעה 7:00 דקות, הגדר ריכוז B ל- 95.0.
      בשעה 16:00 דקות, הגדר ריכוז B ל- 95.0.
      בשעה 16.50 דקות, הגדר ריכוז B ל 20.0.

4. אתחול HPLC

  1. במקטע עמודת HPLC, הכנס את עמודת LC (עמודת C18 HPLC מונוליטית 100 מ"מ x 4.6 מ"מ) ואת מגיני העמודות (עמודת שמירה 5 מ"מ x 4.6 מ"מ). שימו לב ללחץ העמודות המינימלי והמקסימלי.
  2. הפעל דוגמה ריקה (אותו פתרון מאגר) כדי לבדוק אם יש דליפות וליצור תוכנית בסיסית. חפשו דליפות. ניתן היה להבחין בדליפות על ידי תנודות לחץ עמודה. אם יש דליפות, לקבוע מאיפה הן עשויות להגיע ולהדק את החיבורים.
  3. הפעל ריק לדוגמה (אותו פתרון חיץ) באמצעות תוכנית LC הרצויה כדי לבצע חימום מוקדם של העמודה.

5. פיתוח שיטת TIMSTOF MS/MS

  1. פתח את היישום timsControl. בצד שמאל של החלון נמצאות הגדרות MS ו- TIMS.
    1. תחת הגדרות MS, הגדר את תחילת הסריקה ואת סיומה ל- 50 m/z ו- 1800 m/z, בהתאמה. בחר מצב חיובי עבור קוטביות היונים ובחר פיצול מצטבר-טורי מקבילי עבור מצב הסריקה.
    2. תחת הגדרות TIMS הגדר את המצב למותאם אישית, 1/K0 מתחיל ל- 0.40 Vs/cm2, 1/K0 מסתיים ל- 1.85 Vs/cm2, זמן הרמפה מוגדר ל- 150.0 ms וממוצע MS מוגדר ל- 1.
  2. בבחירה התחתונה של כרטיסיות תחת מקור, בצע את השינויים הבאים בשתי תיבות ההגדרה.
    1. במקור, הגדר את קיזוז לוח הקצה ל- 500 V, נימי ל- 4500 V, נבולייזר ל- 3.0 בר, גז יבש ל- 10.0 L / min, וטמפרטורה יבשה ל- 200 ° C.
    2. בהגדרות משאבת המזרק, ודא שהמזרק הוא המילטון 1 מ"ל, פעיל מופעל וקצב הזרימה מוגדר ל 80.0 מיקרוליטר / שעה.
  3. בכרטיסיה כוונון, בצע את השינויים הבאים בכרטיסיות ההגדרות עבור כללי, עיבוד ו- TIMS.
    1. תחת הכרטיסיה הגדרות כלליות, הגדר את המקטעים הבאים: העברה, תא התנגשות, קוואדרופול, מיקוד טרום TOF וזיהוי.
      1. תחת הגדרות ההעברה, הגדר את הסטייה 1 דלתא ל- 70.0 V, משפך 1 RF ל- 341.0 Vpp, אנרגיית CID ל- 0.0 eV, משפך 2 RF ל- 300.0 Vpp, RF רב-קוטבי ל- 300.0 Vpp.
      2. תחת הגדרות תא ההתנגשות, ודא שאנרגיית ההתנגשות מוגדרת ל- 6.0 eV ו- RF ההתנגשות ל- 1200.0 Vpp.
      3. תחת ההגדרות המרובעות, ודא שאנרגיית היונים מוגדרת ל- 6.0 eV ומסה נמוכה ל- 250.00 m/z.
      4. תחת הגדרות המיקוד לפני TOP, הגדר את זמן ההעברה ל- 75.0 μs ואת האחסון לפני הפולס ל- 5.0 μs.
    2. תחת הכרטיסיה הגדרות עיבוד, הגדר את המקטעים הבאים: זיהוי שיא ספקטרום מסה וזיהוי שיא ניידות.
      1. בהגדרות שיא ספקטרום המסות, בטל את בחירת סכום העוצמות (שטח) והגדר את הסף המוחלט ל- 667.
    3. תחת הכרטיסייה TIMS, הגדר את המקטעים הבאים: היסטים, בקרת שינוי יונים ופרמטרים מתקדמים.
      1. תחת הגדרת ההיסט הגדר את Δt1 עד -20.0 V, Δt2 עד -100.0 V, Δt3 עד 40.0 V, Δt4 עד 80.0 V, Δt5 עד 0.0 V, Δt6 עד 120.0 ותא התנגשות ב- 250.0 V.
      2. תחת הגדרות בקרת טעינת היונים, לחץ על התיבה כדי להפעיל ולהגדיר את עוצמת היעד ל- 5.00 M.
      3. תחת הפרמטרים המתקדמים, לאפשר את צבירת המנעול לטווח ניידות.
  4. בכרטיסיה MS/MS הגדר את מצב סריקה לפיצול מצטבר-טורי מקבילי והגדר את המקטעים הבאים: יונים מקדימים, תזמון, אי-הכללה פעילה, הגדרות אנרגיית התנגשות, הגדרות רוחב בידוד ודריכת TIMS.
    1. תחת יונים מקדימים, הגדר את מספר רמפות הפיצול הטורי המקבילות לצבירה ל- 8, טען מינימום ל- 1 וטען מקסימום ל- 5.
    2. תחת הגדרות תזמון, הפוך את החזרות המקדימות לזמינות. תחת אי הכללה פעילה, סמן את התיבה כדי להפוך את השחרור לזמין והגדר אותו ל- 0.40 דקות לאחר מכן.
    3. אל תתאים את הגדרות אנרגיית ההתנגשות ואת הגדרות רוחב הבידוד. לחץ על תיבת הצעד של TIMS כדי להפעיל.

6. ניידות וכיול מסה

  1. בצע כיול הן עבור m/z והן עבור תחום הניידות. תחת הגדרות כיול m/z, בחר אחד מפרופילי מיקס הכוונון הטעונים מראש בתיבת רשימת ההפניות המופיעים בתפריט הנפתח.
  2. כדי לכייל, טען את המזרק עבור TOF עם פתרון ערבוב כוונון. בצד ימין של החלון, השתמש בהגדרות שכותרתן מצב כיול כדי להגדיר את סוגי הכיול השונים כדי להשיג את הניקוד הגבוה ביותר.
  3. ודא שהציון קרוב ככל האפשר ל-100%. עבור בין ריבוע ליניארי, מרובע וריבועי משופר כדי להשיג את התוצאה הטובה ביותר.
  4. כיול לניידות לפי שלבים 6.1-6.3 המשמשים לכיול m/z.
  5. לאחר כיול, שמור את שיטת MS על ידי בחירה בכרטיסייה שיטה בסרגל העליון. בתפריט הנפתח, בחר שמירה בשם כדי ליצור קובץ שיטה חדש של MS.

7. יצירת שיטת הצטברות מקבילית-פיצול סדרתי (dia) של צבירה עצמאית (dia)

  1. לאחר איסוף מערך נתונים בפיצול מקבילי של הצטברות הדדית (dda), הפעל את הניסויים ב-dia. פתח את יישום התוכנה לניידות יונים וטען את שיטת dda שנשמרה בשלב 6.5.
  2. השאר את כל ההגדרות זהות עבור הגדרת MS, שנה זאת מפיצול מצטבר-טורי מקבילי לפיצול דיא- צבירה מקבילית-טורית.
  3. בתחתית החלונית, בחר בכרטיסייה MSMS ולאחר מכן לחץ על Window Editor כדי לפתוח את חלון ה-dia המוקפץ המוצג באיור 2.
  4. טען את ערכת נתוני dda שנשמרה בעבר (קובץ .m) באמצעות לחצן הניתוח הפתוח הממוקם בחלק העליון של החלון הקופץ.
  5. בפינה השמאלית התחתונה מופיעה מפת חום המציגה חלונות עם מצולע של חלונות העוברים באלכסון לרוחב התרשים. לחץ וגרור כדי לשנות את גודל המצולע כך שיתאים לנתונים במפת החום (פינות ניתנות לבחירה על ידי לחיצה כפולה על הקווים הרוחביים תופיע נקודה שניתן לגרור ולשנות את גודלה).
  6. מימין לחלונות נמצאות הגדרות החלון. הגדר את רוחב המסה (50 הוא ללכת אל) והגדר את החפיפה האופקית, שניהם ב- Da.
  7. הגדר את מספר חלונות הניידות לפי רוחב מסה ואת החפיפה האנכית.
  8. לחץ על חשב חלונות בפינה השמאלית התחתונה של החלון המוקפץ כדי לראות את החלונות המוצגים עם ההגדרות החדשות. לאחר המתאים, לחץ על החל חלונות dia-PASEF לשיטה. פעולה זו תסגור את החלון המוקפץ ותחזיר אותו למסך הבית.

8. עיבוד נתוני HPLC ion mobility TOF

  1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים. בפינה השמאלית העליונה, לחץ על קובץ הכרטיסייה ובחר פתח מהתפריט הנפתח. בחלון הקבצים החדשים בחר את הקבצים שבחרת ולחץ על פתח.
  2. בדוק את הכיול. לחץ לחיצה ימנית על שם הקובץ תחת תיבת הניתוח ובחר מאפיינים. יופיע חלון עם תווית קובץ name_analysis מאפיינים. בחר מצב כיול.
  3. בתיבה הנפתחת, בחר כיול מכשירים עבור ספקטרומטר המסות. ודא שהשגיאה אינה גדולה מ- 1 מיקרוגרם/מ"ל. בחר כיול ניידות ראשוני ואשר שהשגיאה אינה גדולה מ- 1 מיקרוגרם/מ"ל.
  4. הכן כרומטוגרמה בתוכנת ניתוח הנתונים כמתואר להלן.
    1. לחץ לחיצה ימנית על כרומטוגרמה תחת שם הקובץ, בחר ערוך כרומטוגרמה. בסוג, לחץ על התיבה הנפתחת ובחר כרומטוגרמה של יונים מחולצים.
    2. תחת סינון, בחר כל MS ובמצב סריקה בחר הכל. זאת כדי לראות את הפסגות של המולקולה המעניינת ולא רק את השברים שלה.
    3. מתחת לזה, חפש את שתי אפשרויות הסינון לבחירת מולקולות: מסות או נוסחה מסומנות בכחול.
    4. אם משתמשים במסות כדי לחלץ יון, מכניסים את m/z התיאורטי של המולקולה המעניינת. במקרה זה בחר (מסה לתוצאה מייצגת) m/z.
    5. אם אתה משתמש בנוסחה כדי לחלץ יון, הכנס את הנוסחה עבור המולקולה, כמו גם את צורות היונים המעניינות את הכרומטוגרמה. במקרה זה, בחר את היון הפרוטוני, [M+H]+ .
    6. הגדר את הקוטביות למצב חיובי.
  5. ספקטרום מסות
    1. לחץ לחיצה ימנית בקו הבסיס של פסגת המתחם וגרור לקצה השני של הפסגה. זה ייצור ספקטרום מסה של מקטעים בתוך זמן השמירה הזה.
  6. דור של מובילוגרמה
    1. לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה השמאלית שכותרתה mobilogram ובחר ערוך mobilogram. יופיע חלון שכותרתו עריכת עקבות ניידות. בצע את השלבים 8.4.2-8.4.7 לעריכת הכרומטוגרמה.
    2. בקלט זמן השמירה, הוסף את טווח זמן השמירה של שיא הריבית.
    3. לאחר בחירת הפרמטרים , לחץ הוסף ואחריו אישור בפינה השמאלית העליונה של חלון מעקב ניידות העריכה.
    4. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות הרצויות ותפיק כרומטוגרמה. חזור על שלבים 8.6.1-8.6.3 עבור כל היונים בתערובת.
    5. יצירת הספקטרום המורכב
      1. בחלק התחתון של חלון תצוגת הספקטרום, בחר פרופיל MS וקטע MS. זה יאפשר לכלול יונים מסריקה מלאה ו- PASEF.
      2. בתצוגת ספקטרום, לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק ספקטרום מורכב. בעזרת נתוני הספקטרום המופיעים מימין, מצא מידע נוסף על התרכובת, כגון רזולוציה של פתרון הספק, עוצמה ויחס אות לרעש (S/N).
    6. עיבוד נתונים
      1. כדי לעבד את הנתונים, שלב באופן ידני את שיאי הכרומטוגרמה והניידות כדי להפיק מידע חשוב על המולקולה המעניינת.
      2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חפש ובחר שלב רק כרומטוגרמה או מובילוגרמה. לחץ לחיצה שמאלית וגרור כדי להדגיש את הפסגה הרצויה. יוצג המידע הכולל זמן שמירה, אזור, S/N וניידות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערכת הסינון האנלוגית פנטניל של 250 תקני אנלוגים חולקה ל -14 קבוצות: 12 קבוצות של 17 אנלוגים ו -2 קבוצות של 16 אנלוגים, כדי למנוע הפרעות m/z. כל אנלוגי מאופיין גם על ידי m/z, זמן שמירה (RT), ניידות (K) ותבנית פיצול MS/MS.

דוגמאות להפרדות איזומריות מוצגות באיור 3 ובאיור 4 עבור הנוסחה הכימית C22H28N2O2 ו-C21H28N2OS בהתאמה.

ערכת הסינון האנלוגית של פנטניל מכילה ארבעה איזומרים עם הנוסחה הכימית C22H28N2O2 (ראו איור 3). בדיקה של איור 4 מראה את כרומטוגרמת היונים שחולצו [M+H]+ , מובילוגרמות, תבנית איזוטופית ותבנית פיצול MS/MS. המתוקסיאצטיל פנטניל והפנטניל קרבמט נפרדים היטב בתחומי LC וניידות מהפארא-מתוקסי אצטיל פנטניל ו-B-הידרוקסיל פנטניל. עם זאת, הפרדה ברורה בין para-methoxy acetyl fentanyl ו- B-hydroxyl fentanyl מושגת על ידי דפוסי הפיצול שלהם.

ערכת הסינון האנלוגית פנטניל מכילה שלושה איזומרים עם הנוסחה הכימית C21H28N2OS. בדיקה של איור 4 מראה את כרומטוגרמת היונים שחולצו [M+H]+ , מובילוגרמות, תבנית איזוטופית ותבנית פיצול MS/MS. a-methyl thiofentanyl ו- (±)-trans-3-methyl thiofentanyl נפרדים בתחום LC אך לא בתחום הניידות. יתר על כן, (±)-trans-3-methyl thiofentanyl ו- (±)-cis-3-methyl thiofentanyl נפרדים בתחום הניידות ולא בתחום LC. זה מראה את המשלימות של LC והפרדת ניידות שיפור זיהוי של המינים האיזומריים באמצעות אורתוגונליות של תחומים. איור 4D מסכם את התוצאה הזו שמספקת LC וניידות.

figure-results-1
איור 1: כבש שיפוע בתוכנה. שיטת ICF שיטת ICF היא מעברי צבע של נקודות זמן המופעלות במהלך הפרדה בהתאם לאחוז ריכוז B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הגדרות חלון dia-PASEF. בשיטות dia-PASEF MS, הגדרות MS/MS הן ייחודיות. הגרף משמאל מציג את מצולעי החלון שהותאמו מהנתונים שנרשמו בשיטת dda-PASEF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: כרומטוגרמה טיפוסית של יונים שחולצו, מובילוגרמה שחולצה והיטל מוגבר של טרשת נפוצה עבור אופיואידים איזומריים. (A) מבנים של פנטניל מתוקסיאצטיל, פרצטיל פנטניל פארא-מתוקסי, פנטניל β-הידרוקסי, פנטניל קרבמט וזמן השימור האופייני (B) בהתאמה, (C) ניידות אופיינית, (D) אות איזומרי, (E) מקטעים עיקריים ו-(F) ייצוג של הפיצול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: כרומטוגרמות יונים טיפוסיות שחולצו וניידות שחולצו עבור אופיואידים איזומריים. (A) מבנים של α-מתיל תיופנטניל, (±)-טרנס-3-מתיל תיופנטניל, ו-(±)-cis-3-methyl thiofentanyl. עבור האיזומרים המתאימים (B) זמן שמירה אופייני, (C) ניידות טיפוסית, (D) אורתוגונליות בין זמן השמירה לניידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: קבוצות תערובת. טבלה זו מתארת אילו אופיואידים נמצאים בכל אחת מ-14 התערובות שנוצרו עבור הליך זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההפרדה האנליטית של דגימות ביולוגיות המכילות תוכן איזומרי גבוה יכולה להיות מאתגרת מבחינה אנליטית. במאמר זה, השיטה המתוארת שואפת לאפיין 29 קבוצות איזומרים, ובסך הכל 185 אנלוגים מתוך ערכה סטנדרטית של 250 אופיואידים. במהלך הכנת קבוצת הבדיקה, חשוב לוודא שאין שני אנלוגים עם m/z שלא ניתן להבחין ביניהם באופן ניסיוני. הנתונים המתוארים כאן משתמשים בתקנים שאינם ממטריצה מבוססת אדם, אם רוצים להשתמש בשיטה זו בניסוי שדה; ניסויים נוספים באמצעות מטריצת העניין נחוצים כדי להבטיח את תחולת השיטה. המטריצה עשויה לגרום לאנליטים להתיינן באופן שונה מאשר בניסוי ללא מטריצה, ולכן הכרחי לקבוע אילו צורות יונים נפוצות ייצפו. בניתוח, הזיהוי מבוסס על הדפוסים האיזוטופיים של הצורות הנפוצות ביותר (למשל, [M+H]+1 ו-[M+Na]+1).

הבחירה בתוכנית LC היא קריטית במקרים בהם האיזומרים אינם מופרדים בתחום הניידות. הקטנת שיפוע השיפוע יכולה להגדיל את הספציפיות של השיטה על ידי הגדלת ההבדל בין הפסגות הכרומטוגרפיות.

במהלך ניתוח נתונים חשוב להתעלם מאותות לא רלוונטיים בעת קביעת זמן השמירה והניידות. היתרונות של HRMS מאפשרים חלונות m/z צרים (רזולוציית מסה טיפוסית של ~50,000) עם סינון ניידות נוסף, ובכך מפחיתים את הרעש הכימי.

השיטה המתוארת כאן מספקת ספריית התייחסות לסינון אנלוגים פנטניל ממדגם לא ידוע. דפוס הפיצול RT, K, איזוטופי וטרשת נפוצה המדווחים משמשים כמזהים במהלך עיבוד הנתונים והקצאה לא ידועה. בהשוואה לניתוח MRM LC-QQQ מסורתי, בעוד LOD דומה ניתן להשגה 13,19,27, היתרון הייחודי הוא לסנן אופיואידים חלופיים שאינם כלולים במסד הנתונים שנוצר באמצעות ערכת FID. כל אופיואיד חדש ידרוש את הניתוח באמצעות תקן סינתטי לצורך האימות הסופי שלו.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתיו ווילטס ומלווין א. פארק הם עובדים של Bruker Daltonics Inc, יצרנית המכשיר המסחרי timsTOF Pro2. כל שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מבקש להודות על התמיכה הראשונית של ד"ר סזאר רמירז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורמט אמוניום עבור HPLCFluka17843-50G
Eppendorf  צינורות נעילה בטוחה מיקרוצנטריפוגה Snap-Capפישר05-402-25
ESI-L תערובת כוונון בריכוז נמוךAgilentG1969-85000
ערכת הקרנה אנלוגית פנטניל (FAS) Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380, ערכה 9003381של 250 אופיואידים סנתטיים, 210 אנלוגים של פנטניל, מחולקים לערכה אחת וגרסאות פאנל מתעוררות 1-4
חומצה פורמית Optima LC/MSFisherA117-50
עמוד שמירה אוניקס (5 x 4.6 מ"מ) עמוד שמירה פנומנקסCHO-7649לעמודי C18
אוניקס מונוליטי C18 עמוד HPLC (100 x 4.6 מ"מ)פנומנקסCHO-7643שלב הפוך C18 עמוד LC
אצטוניטריל בדרגת אופטימה פישרA996-4
אופטימה כיתה מתנולפישרA454-4
אופטימה כיתה מיםפישרW7-4
פיפטהפישר05-719-510ערכה של 1-10 ומיקרו; L, 10-100 ומיקרו; L, ו-100-1000 ומיקרו; קצות פיפטה L
10µ Lפישר94060100
טיפים לפיפטה 1000& Lפישר94056710
טיפים לפיפטה 200µ Lפישר94060310
מיקסר צלחותIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE כרומטוגרף נוזלי מהיר במיוחדShimadzu, יפןמצויד ב-DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF מכשיר עם PASEF 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gladden, R. M., Martinez, P., Seth, P. Fentanyl Law Enforcement Submissions and Increases in Synthetic Opioid-Involved Overdose Deaths - 27 States, 2013-2014. Morbidity and Mortality Weekly Report. 65 (33), 837-843 (2016).
  2. Rudd, R. A., Seth, P., David, F., Scholl, L. Increases in Drug and Opioid-Involved Overdose Deaths - United States, 2010-2015. Morbidity and Mortality Weekly Report. 65, 1445-1452 (2016).
  3. Department of Justice Drug Enforcement Administration. Drugs of Abuse: A DEA Resource Guide. Department of Justice Drug Enforcement Administration. , (2022).
  4. Vardanyan, R. S., Hruby, V. J. Fentanyl-related compounds and derivatives: current status and future prospects for pharmaceutical applications. Future medicinal chemistry. 6 (4), 385-412 (2014).
  5. Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE). Q4 2022 NPS Opioids Trend Report. Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE). , (2022).
  6. Drug Enforcement Administration. Fentanyl SIgnature Profiling Program Report. Drug Enforcement Administration. , (2019).
  7. Drug Enforcement Administration. Control of a Chemical Precursor Used in the Illicit Manufacture of Fentanyl as a List I Chemical. Drug Enforcement Administration. , (2007).
  8. Valdez, C. A. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Synthetic Opioids Belonging to the Fentanyl Class: A Review. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 52 (8), 1938-1968 (2022).
  9. Churley, M., Cuadra-Rodriguez, L. Application Note: Screen More Drugs with the Agilent GC/MS Toxicology Analyzer with a High Efficiency Source. Agilent Technologies Incorporation. , (2017).
  10. Gerace, E., Salomone, A., Vincenti, M. Analytical Approaches in Fatal Intoxication Cases Involving New Synthetic Opioids. Curr Pharm Biotechnol. 19 (2), 113-123 (2018).
  11. McIntyre, I. M., Trochta, A., Gary, R. D., Malamatos, M., Lucas, J. R. An Acute Acetyl Fentanyl Fatality: A Case Report With Postmortem Concentrations. Journal of Analytical Toxicology. 39 (6), 490-494 (2015).
  12. Marchei, E., et al. New synthetic opioids in biological and non-biological matrices: A review of current analytical methods. Trends in Analytical Chemistry. 102, 1-15 (2018).
  13. Shoff, E. N., Zaney, M. E., Kahl, J. H., Hime, G. W., Boland, D. M. Qualitative Identification of Fentanyl Analogs and Other Opioids in Postmortem Cases by UHPLC-Ion Trap-MSn. Journal of Analytical Toxicology. 41 (6), 484-492 (2017).
  14. Drug Enforcement Administration. Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs (SWGDRUG) Recommendations. Drug Enforcement Administration. , (2022).
  15. Peters, F. T., et al. A systematic comparison of four different workup procedures for systematic toxicological analysis of urine samples using gas chromatography-mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (2), 735-745 (2009).
  16. Remane, D., Meyer, M. R., Peters, F. T., Wissenbach, D. K., Maurer, H. H. Fast and simple procedure for liquid-liquid extraction of 136 analytes from different drug classes for development of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric quantification method in human blood plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (6), 2303-2314 (2010).
  17. Cayman Chemical. Supplemental Material: Differentiation of Isobaric and Isomeric Fentanyl Analogs by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). Cayman Chemical. , (2018).
  18. Armenian, P., Vo, K. T., Barr-Walker, J., Lynch, K. L. Fentanyl, fentanyl analogs and novel synthetic opioids: A comprehensive review. Neuropharmacology. 134, 121-132 (2018).
  19. Zhang, Y., et al. Development and application of a High-Resolution mass spectrometry method for the detection of fentanyl analogs in urine and serum. Journal of Mass Spectrometry and Advances in the Clinical Lab. 26, 1-6 (2022).
  20. Concheiro, M., Chesser, R., Pardi, J., Cooper, G. Postmortem Toxicology of New Synthetic Opioids. Frontiers in Pharmacology. 9, 1210(2018).
  21. Mohr, A. L., et al. Analysis of Novel Synthetic Opioids U-47700, U-50488 and Furanyl Fentanyl by LC-MS/MS in Postmortem Casework. Journal of Analytical Toxicology. 40 (9), 709-717 (2016).
  22. Moody, M. T., Diaz, S., Shah, P., Papsun, D., Logan, B. K. Analysis of fentanyl analogs and novel synthetic opioids in blood, serum/plasma, and urine in forensic casework. Drug Testing and Analysis. 10 (9), 1358-1367 (2018).
  23. Seither, J., Reidy, L. Confirmation of Carfentanil, U-47700 and Other Synthetic Opioids in a Human Performance Case by LC-MS-MS. Journal of Analytical Toxicology. 41 (6), 493-497 (2017).
  24. Strayer, K. E., Antonides, H. M., Juhascik, M. P., Daniulaityte, R., Sizemore, I. E. LC-MS/MS-Based Method for the Multiplex Detection of 24 Fentanyl Analogues and Metabolites in Whole Blood at Sub ng mL(-1) Concentrations. ACS Omega. 3 (-1), 514-523 (2018).
  25. Kahl, J. H., Gonyea, J., Humphrey, S. M., Hime, G. W., Boland, D. M. Quantitative Analysis of Fentanyl and Six Fentanyl Analogs in Postmortem Specimens by UHPLC-MS-MS. Journal of Analytical Toxicology. 42 (8), 570-580 (2018).
  26. Fogarty, M. F., Papsun, D. M., Logan, B. K. Analysis of Fentanyl and 18 Novel Fentanyl Analogs and Metabolites by LC-MS-MS, and report of Fatalities Associated with Methoxyacetylfentanyl and Cyclopropylfentanyl. Journal of Analytical Toxicology. 42 (9), 592-604 (2018).
  27. Lurie, I. S., Berrier, A. L., Casale, J. F., Iio, R., Bozenko, J. S. Profiling of illicit fentanyl using UHPLC-MS/MS. Forensic Science International. 220 (1-3), 191-196 (2012).
  28. Krajewski, L. C., et al. Application of the fentanyl analog screening kit toward the identification of emerging synthetic opioids in human plasma and urine by LC-QTOF. Toxicology Letters. 320, 87-94 (2020).
  29. Pirok, B. W. J., Stoll, D. R., Schoenmakers, P. J. Recent Developments in Two-Dimensional Liquid Chromatography: Fundamental Improvements for Practical Applications. Analytical Chemistry. 91 (1), 240-263 (2018).
  30. Keller, T., Keller, A., Tutsch-Bauer, E., Monticelli, F. Application of ion mobility spectrometry in cases of forensic interest. Forensic Science International. 161 (2-3), 130-140 (2006).
  31. Klingberg, J., Keen, B., Cawley, A., Pasin, D., Fu, S. Developments in high-resolution mass spectrometric analyses of new psychoactive substances. Archives of Toxicology. 96 (4), 949-967 (2022).
  32. Fleming, S. W., et al. Analysis of U-47700, a Novel Synthetic Opioid, in Human Urine by LC-MS-MS and LC-QToF. Journal of Analytical Toxicology. 41 (3), 173-180 (2017).
  33. Guale, F., et al. Validation of LC-TOF-MS screening for drugs, metabolites, and collateral compounds in forensic toxicology specimens. Journal of Analytical Toxicology. 37 (1), 17-24 (2013).
  34. Palmquist, K. B., Swortwood, M. J. Data-independent screening method for 14 fentanyl analogs in whole blood and oral fluid using LC-QTOF-MS. Forensic Science International. 297, 189-197 (2019).
  35. Adams, K. J., et al. Analysis of isomeric opioids in urine using LC-TIMS-TOF MS. Talanta. 183, 177-183 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tandem Mass SpectrometryLiquid ChromatographyIon Mobility SpectrometryData Dependent AcquisitionData Independent AcquisitionCollision Induced DissociationIsomer DifferentiationHigh Throughput Screening

מאמרים קשורים