הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65565

⸱

11 באוגוסט 2023

 ,  ,  , 
1Prion Research Center, Colorado State University, 2Department of Microbiology, Immunology and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

במאמר זה

סיכום

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

תקציר

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם רגולטורים רבי עוצמה של דלקת באמצעות ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים, כימוקינים וגורמי גדילה. תאים אלה מראים יכולת לווסת דלקת עצבית בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פריון והפרעות אחרות בקיפול שגוי של חלבונים. מחלות פריון יכולות להיות ספורדיות, נרכשות או גנטיות; הם יכולים לנבוע מקיפול שגוי וצבירה של חלבון פריון במוח. מחלות אלה הן תמיד קטלניות, ללא טיפולים זמינים.

אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלה הוא הפעלת אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ודלקת קשורה, המתרחשת לפני צבירת פריונים הניתנים לגילוי ואובדן עצבי; לכן, תכונות אנטי דלקתיות רגולטוריות של MSCs ניתן לקצור לטיפול astrogliosis במחלת פריון. לאחרונה הראינו כי MSCs שמקורם בשומן (AdMSCs) בתרבית משותפת עם תאי BV2 או גליה מעורבת ראשונית מפחיתים דלקת הנגרמת על ידי פריונים באמצעות איתות פרקריני. מאמר זה מתאר טיפול אמין באמצעות AdMSCs מגורה כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים.

אוכלוסייה הטרוזיגוטית של AdMSCs יכולה בקלות להיות מבודדת מרקמת שומן מורין ולהרחיב בתרבית. גירוי תאים אלה עם ציטוקינים דלקתיים משפר את יכולתם גם לנדוד לכיוון הומוגנט מוחי נגוע פריונים וגם לייצר מודולטורים אנטי דלקתיים בתגובה. יחד, טכניקות אלה יכולות לשמש לחקר הפוטנציאל הטיפולי של MSCs על זיהום פריונים וניתן להתאים אותן לקיפול שגוי של חלבונים אחרים ולמחלות נוירו-דלקתיות.

מבוא

דלקת גליה ממלאת תפקיד מפתח במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, כולל פרקינסון, אלצהיימר ומחלות פריונים. למרות שצבירה חריגה של חלבונים מיוחסת לחלק גדול מפתוגנזה של מחלות וניוון עצבי, תאי גליה גם ממלאים תפקיד בהחמרת 1,2,3 זה. לכן, התמקדות בדלקת הנגרמת על ידי גליה היא גישה טיפולית מבטיחה. במחלת פריונים, חלבון הפריון התאי (PrPC) מתקפל בטעות לחלבון פריון הקשור למחלה (PrPSc), היוצר אוליגומרים וצברים ומשבש את ההומאוסטזיס במוח 4,5,6.

אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלת פריונים הוא תגובה דלקתית של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה. מחקרים המדכאים תגובה זו, בין אם על ידי הסרת מיקרוגליה או שינוי של אסטרוציטים, בדרך כלל לא הראו שיפור או החמרה בפתוגנזה של מחלות במודלים של בעלי חיים 7,8,9. ויסות דלקת גליה מבלי לחסל אותה היא חלופה מסקרנת כטיפול.

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) עלו על הבמה כטיפול במגוון מחלות דלקתיות, בשל יכולתם לווסת דלקת באופן פרקריני 10,11. הם הראו יכולת לנדוד לאתרי דלקת ולהגיב למולקולות איתות בסביבות אלה על ידי הפרשת מולקולות אנטי דלקתיות, גורמי גדילה, מיקרו-רנ"א ועוד 10,12,13. הראינו בעבר כי MSCs שמקורם ברקמת השומן (מסומנים ב-AdMSCs) מסוגלים לנדוד לעבר הומוגנט מוחי נגוע בפריונים ולהגיב להומוגנט במוח זה על-ידי ויסות ביטוי גנים עבור ציטוקינים אנטי-דלקתיים וגורמי גדילה.

יתר על כן, AdMSCs יכולים להפחית את הביטוי של גנים הקשורים לגורם גרעיני-קאפה B (NF-κB), תחום הקולטן דמוי הנוד פירין המכיל 3 (NLRP3) איתות דלקתי, והפעלת גלייה, הן במיקרוגליה BV2 והן בגליה מעורבת ראשונית 14. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כיצד לבודד הן AdMSCs והן גליה מעורבת ראשונית מעכברים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים מודולטוריים, להעריך נדידת AdMSC, ותרבית משותפת AdMSCs עם גליה נגועה פריונים. אנו מקווים כי נהלים אלה יכולים לספק בסיס לחקירה נוספת של התפקיד של MSCs בוויסות דלקת הנגרמת על ידי גליה במחלות נוירודגנרטיביות ואחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים גודלו והוחזקו ב- Lab Animal Resources של מדינת קולורדו, שהוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של Lab Animal Care International, בהתאם לפרוטוקול #1138, שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו.

1. בידוד והדבקת גליה מעורבת קליפת המוח הראשונית עם פריונים

  1. כדי לבודד תאי גליה מעורבים ראשוניים המכילים אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה, יש להשיג גורי עכברים C57Bl/6 בני אפס עד יומיים.
    הערה: פרוטוקול זה מותאם לפרוטוקולים קודמים 15,16.
  2. הרדימו גורים בזה אחר זה על ידי עריפת ראשים וחלצו את מוחם, תוך הפרדה והשלכת המוח הקטן וגזע המוח.
    1. הניחו את המוח בצלחת פטרי בקוטר 3 ס"מ המכילה MEM/EBSS קר עם 2x פניצילין/סטרפטומיצין/נאומיצין (PSN). תחת טווח ניתוח, להפריד את ההמיספרות במוח ולהסיר ולהשליך את המוח האמצעי. הסר והשלך את ההיפוקמפוס ואת קרומי המוח מקליפת המוח.
    2. מניחים את שתי ההמיספרות בקליפת המוח בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל MEM/EBSS + 2x PSN ומניחים על קרח.
  3. במכסה מנוע של תרבית רקמה, הסר את המדיה מהצינור החרוטי של 50 מ"ל על ידי שאיפה עדינה עם פיפט, והשאיר את חתיכות רקמת קליפת המוח בתחתית הצינור. עם פיפט זכוכית מצופה, להוסיף 10 מ"ל של מדיה דיסוציאציה שחוממה מראש ו triturate את הרקמה עם צינור זכוכית 10-20x.
  4. מעבירים את המתלים לכוס בנפח 50 מ"ל המכילה מוט ערבוב קטן ומניחים על צלחת ערבוב במצב הנמוך ביותר, כ-30 סל"ד, למשך 10 דקות. מוציאים את הכד מצלחת הערבוב ומניחים אותו בזווית של 30 מעלות למשך 3 דקות כדי לאפשר לרקמה לשקוע בתחתית. הסר את מתלה התא (supernatant) ולהעביר צינור חרוטי חדש 50 מ"ל על קרח.
  5. הוסף DNase-I (4,000 U/mL) ל- 10 מ"ל של מדיית דיסוציאציה והשהה מחדש את הרקמה וערבב במשך 10 דקות נוספות. חזור על הפעולה על ידי הוספת מדיית דיסוציאציה טרייה (ללא DNase-I) 2-4 פעמים נוספות (פעם אחת עבור כל שני גורי עכברים בשימוש), והעברת תרחיף התא לצינור החרוטי 50 מ"ל על קרח, עד שנשארת רק רקמה סיבית בתחתית הכד.
  6. צנטריפוגה את תרחיף התא בצינור החרוטי למשך 10 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והחליפו במדיום גדילת גלייה. לספור את התאים עם hemocytometer צלחת את התאים בצפיפות של 106 ב 10 ס"מ תאים תרבית צלחת מטופלת. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO2.
  7. לאחר 24 שעות, הסר את המדיה והחלף אותה במדיית גליה טרייה. תן לתאים להגיע 100% מפגש בתוך 2 שבועות; לאחר מכן, לפצל וצלחת אותם לניסויים.
  8. עבור זיהום פריון במבחנה , גליית צלחת ב 100,000 תאים לכל באר ב 6 צלחות באר ולאפשר להגיע 80%-100% מפגש. חשוף הומוגנאטים במוח, הן פריונים והן נורמליים, מדוללים עד 20% ב- PBS לאור UV במשך 30 דקות לפני הוספה לתרבית תאים. יש לשאוף שמדיה מחוץ לגליה להיות נגועה, ולכל באר, להוסיף 1.5-2 מ"ל של חומר גדילה גליה המכיל נפח סופי של 0.1% נורמלי או הומוגנט מוח פריון.
  9. לאחר 72 שעות, שאפו מהמדיה ושטפו את התאים עם PBS כדי להסיר כל שאריות הומוגניות במוח. יש להחליף במצע גדילת גליה טרי (שאינו מכיל הומוגנאטים במוח).
  10. כדי לבודד תאי AdMSCs, השתמש בפיפטה סרולוגית ושאפו בעדינות את רקמת השומן יחד עם ~1 מ"ל של תמיסת HBSS/טריפסין. מעבירים לצלחת פטרי בקוטר 4 ס"מ המכילה 2 מ"ל חומרי DMEM/F12 עם תערובת 200 U/mL DNase-I ו-400 U/mL collagenase/Dispase. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את גושי רקמת השומן לחתיכות קטנות (פחות מ -5 מ"מ גודל) ודגרים ב 37 ° C במשך 1.5 שעות.
  11. מעבירים את תכולת צלחת הפטרי לצינור חרוטי של 50 מ"ל עם צינור סרולוגי ומטריטורטים את התערובת ~ 10x עם הפיפט. יש לוודא שהרקמה מתפרקת בקלות ויוצרת תערובת הומוגנית יחסית. צנטריפוגה את התערובת ב 4 ° C במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם כדי pellet את החלק כלי הדם סטרומה, אשר ייראה אדום.
  12. יש לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות ולשטוף את הגלולה עם 5 מ"ל PBS סטרילי שחומם מראש וצנטריפוגה ב 4 ° C ב 1,000 × גרם במשך 3 דקות. יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה AdMSC (DMEM דל גלוקוז המכיל L-גלוטמין ובתוספת 15% סרום בקר עוברי מומת חום (hiFBS), 1% חומצות אמינו, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% PSN).
  13. הניחו מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי סטרילי טרי בנפח 50 מ"ל והעבירו את תרחיף התא דרך המסננת כדי להסיר כל רקמה שאינה מנותקת. הוסיפו 9 מ"ל של חומרי אחסון AdMSC לצלחת שטופלה בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ והכניסו את תרחיף התאים המתוח לצלחת. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO2.
  14. הסר והחלף במדיה חדשה של AdMSC למחרת. המתן עד שהתאים יהפכו ל-80-90% נפגשים כאשר הם יהיו מוכנים למעבר בין 72 שעות ל-96 שעות.
  15. בודד AdMSCs כמתואר לעיל ועבר פעמיים כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית עקבית 14. יש לשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי ופיפטה 2 מ"ל של טריפסין שחומם מראש (0.25%) על כל צלחת. יש לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות או עד שהם נעקרים לחלוטין מהצלחת. הוסף 8 מ"ל של מדיה AdMSC שחוממה מראש לכל צלחת, צינור כדי לערבב את מתלה התא, להעביר לצינור החרוטי, וצנטריפוגה ב 1,000 × גרם ב 4 ° C לכדור.
  16. Resuspend AdMSCs ב 3-10 מ"ל של מדיה (בהתאם למספר לוחות בשימוש) ולספור תאים באמצעות hemocytometer. צלחת 100,000 תאים/באר בצלחות 6 בארות המכילות מדיה AdMSC. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO2 למשך הלילה.
  17. למחרת, לעורר תאים עם ציטוקינים או הומוגנט המוח.
    1. עבור תאים מעוררי ציטוקינים, יש ליצור מדיית AdMSC המכילה TNFα של 10 ננוגרם/מ"ל או 200 ננוגרם/מ"ל IFNγ. השתמש במדיה טרייה עבור בארות בקרה.
    2. עבור טיפולים הומוגניים במוח נגועים בפריונים, להשיג 20% הומוגנט במוח (ב- PBS) מעכברי פריון נגועים סופניים (זני 22L או RML). הפוך את AdMSC למדיהעם ריכוז סופי של 0.1% נגוע פריון או מוח נורמלי הומוגנט עבור קבוצת ביקורת.
    3. שאפו מדיה מהבארות וצינור 1.5 מ"ל של מדיה המכילה ציטוקינים או מוח הומוגניים לבארות המתאימות. בצע בשלשה. החזרת צלחות לאינקובטור.
  18. הסר את המדיה, שטוף תאים 2x עם PBS שחומם מראש, לבודד RNA על ידי הוספת 350 מ"ל של חיץ ליזה המכיל 1% βME לכל באר, ולהשתמש מרים תאים כדי להסיר lysates התא. בצע בידוד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן ערכת ה- mini, כולל שלב עיכול DNase. עבור RT-qPCR, תעתיק לאחור 25 ng של RNA לכל דגימה והגבר cDNA עם SYBR Green ופריימרים עבור כל גן ב 10 mM. לנתח ביטוי mRNA בשיטת 2-ΔΔCT ולנרמל לביטוי של גן הייחוס β-actin 17.
    הערה: כל RT-PCR נעשה בהתאם להנחיות MIQE.
  19. מיקרוגליה צלחת BV2 ב 50,000 תאים לבאר, או גליה מעורבת ראשונית ב 100,000 תאים לבאר בצלחת 6 בארות. טפל בתאי BV2 למחרת עם מדיה המכילה 0.1% הומוגנט מוחי נגוע בפריונים או נורמלי. עבור גליה מעורבת, יש להמתין עד שהתאים יהיו 80-90% נפגשים כדי להדביק הומוגנט במוח.
  20. לדגור על תאים במדיה המכילה הומוגנט במוח במשך 72 שעות. יש לשטוף תאים 2x עם PBS כדי להסיר את שאריות ההומוגניות במוח ולהוסיף מדיה טרייה ולחזור לאינקובטור.
  21. השתמש AdMSCs במעבר 3 עבור תרבות משותפת. במקרה של גירוי AdMSCs, יש להשתמש במדיה המכילה 10 ננוגרם/מ"ל TNFα ולטפל במשך 24 שעות לפני תרבית משותפת עם BV2 או גליה מעורבת. Wash עורר AdMSCs 3x עם PBS כדי להסיר את כל TNFα שנותרו.
  22. טריפסיניזציה של AdMSCs כמתואר בשלב 1.15 והשעיה מחדש במדיית AdMSC.
  23. סחרור AdMSC מתלה ב-1,000 × גרם ב-4°C למשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, החלף מדיה על תאי BV2 או גליה מעורבת עם 2 מ"ל לכל באר של מדיה AdMSC ומקם תוספות עבור לוחות 6 בארות עם גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר לתוך מחצית הבארות. הוסף 2 מ"ל של מדיה AdMSC לכל תוספת ועוד 2 מ"ל של מדיה לבארות שאינן מקבלות תוספות.
  24. בסיום השימוש בגלולות AdMSC, השהה מחדש את הגלולה במדיה של AdMSC. ספרו AdMSCs עם המוציטומטר והוסיפו 50,000-100,000 תאים לכל תוספת.
  25. עבור תאי BV2, לדגור על תרביות משותפות במשך 24 שעות. עבור גליה מעורבת, לדגור רק 24 שעות ועד 7 ימים.
  26. לאחר הדגירה עם AdMSCs למשך הזמן הרצוי, יש להסיר את התוספות ולהשליך, או להניח אותן בצלחת חדשה בעלת 6 בארות, לשטוף את התוספות 2x עם PBS, להוסיף חיץ המסופק על ידי ערכת בידוד RNA לתאי גליה מעורבים או BV2, ולגרד תוספות לניתוח RNA AdMSC.
  27. יש לטפל ב-AdMSCs במעבר 2 עם מדיה המכילה 10 ננוגרם/מ"ל TNFα. למחרת, שטפו תאים עם PBS סטרילי שחומם מראש 3x ודגרו במדיה AdMSC נטולת סרום למשך 4 שעות.
  28. כדי לבצע בדיקת תאים נודדים, הוסף 25,000 AdMSCs לכל הוספה ודגור על תאים במשך 24 שעות ב- 37 ° C. במהלך תקופה זו, תאים נודדים ינועו מהתא העליון של העלון וידבקו לחלק התחתון של העלון. שאפו בזהירות את תכולת הבאר והתוספות ושטפו 2x עם PBS, תוך השארת 1 מ"ל PBS בכל באר כדי להבטיח שהתוספות יישארו לחות מכל צד.
  29. אחד בכל פעם, באמצעות מלקחיים, להסיר את תוספות בעדינות אבל ביסודיות לנגב את החדר העליון עם צמר גפן כדי להסיר את כל התאים שלא נדדו. שאפו את ה-PBS הנותרים ואת הצינור 500 μL של תמיסה סגולה גבישית הן לבאר והן לחדר העליון של העלון, וודאו שקרום ההחדרה שקוע במלואו.
  30. תוספות הדגירה במשך שעה בתמיסה סגולה קריסטלית בטמפרטורת החדר. כדי לשמור על הצבע בצורה הטובה ביותר, בצע את השלבים הבאים במהירות, עם הוספה אחת בלבד בכל פעם.
    1. שאפו תמיסת קריסטל סגולה מהבאר ומהחדר העליון של האינסרט ושטפו 3x עם PBS. נגבו שוב את החדר העליון עם צמר גפן.
    2. מניחים את האינסרט בבאר בצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה 1 מ"ל PBS. הניחו את הצלחת מעל מיקרוסקופ הפוך עם מצלמה מחוברת. בעזרת המטרה 10x, צלמו תמונות של ארבעה אזורים אקראיים לכיוון מרכז העלון, תוך התמקדות רק בצד התחתון של העלון.
  31. לאחר ביצוע פעולה זו עם כל באר, העלה תמונות לתוכנת עיבוד התמונה הנבחרת, והתאם את הרקע כדי לשפר את הניגודיות עם התאים המוכתמים בסגול. ספור את התאים באופן ידני באמצעות מונה תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גירוי AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) במשך 24 שעות גורם לשינויים בביטוי של מולקולות אנטי דלקתיות וגורמי גדילה. טיפול ב- AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) מגביר את הגן המגורה TNF 6 (TSG-6) mRNA, ואילו TNFα, אך לא IFNγ, גורם לעלייה בשינוי גורם גדילה בטא-1 (TGFβ-1) mRNA. גירוי עם TNFα או IFNγ גורם לעלייה בגורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF)mRNA, אך אין שינוי בביטוי של mRNA גורם גדילה פיברובלסט (FGF) (איור 1A). נתונים אלה מצביעים על כך ש-AdMSCs מגיבים גם לגורמים בהומוגנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מדגימים פרוטוקול אמין וזול יחסית להערכת ההשפעות של תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSC) בהפחתת דלקת הנגרמת על ידי פריונים במודל תאי גלייה. ניתן בקלות לבודד ולהרחיב את AdMSCs בתרבית לשימוש תוך שבוע אחד בלבד. פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי אוכלוסייה הטרולוגית של תאים המבטאים סמנים התואמים את אלה של תאי סטרומה מזנכימליים על ידי ציטומטריית אימונופלואורסנציה וזרימה, ושומרים על תפקוד חיסוני כאשר הם מוצגים לציטוקינים או הומוגנט במוח נגוע פריון 14. הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך ש- AdMSCs מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים ל-Lab Animal Resources על גידול בעלי החיים. מקורות המימון שלנו לכתב יד זה כוללים את קרן בוטצ'ר, קרן מרפי טרנר, מכללת CSU לרפואה וטרינרית ומועצת המחקר של המכללה למדעים ביו-רפואיים. איור 2A, איור 2C ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסיןציטיבהSH30042.01
5 מ"ל צלחות סרולוגיותCelltreat229005B
צלחות תרבית רקמות 6 בארותCelltreat229106
10 ס"מ צלחות תרבית תאיםPeak SerumPS-4002
10 מ"ל צנרת סרולוגיתCelltreat229210
צינורות חרוטיים15 מ"לCelltreat667015B
50 מ"ל צינורות חרוטייםCelltreat667050B
BV2 קו תאי מיקרוגליהAcceGen BiotechABC-TC212S
מרים תאיםBiologix Research Company70-2180
סגול קריסטלמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית  12785
DispaseThermo Scientific17105041
DMEM/F12Caisson LabsDFL14-500ML
DNase-ISigma Aldrich11284932001
חומצות אמינו חיוניותThermo Scientific11130051
אתנול (100%)EMD MilliporeEX0276-1
סרום בקר עוברי (חום מושבת)Peak SerumPS-FB4ניתן לרכוש כמושבת בחום או מושבת במעבדה
פורמלדהידEMD Millipore1.04003.1000
זכוכית 10 מ"ל פיפט סרולוגיCorning  7077-10N
האנק' s Balances תמיסת מלחSigma AldrichH8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer ChamberDaiggerHU-3100
גלוקוז גבוה DMEMCytivaSH30022.01
גלוקוז נמוך DMEM המכיל L-גלוטמיןCytivaSH30021.01
MEM/EBSSCytivaSH30024. חומצות אמינו לא חיוניות FS
Sigma-AldrichM7145-100M
Paraformaldehyde (16%)MP Biomedicals219998320
פניצילין/סטרפטומיצין/ניאומיציןSigma-AldrichP4083-100ML
פוספט חוצץמלח Cytiva  SH30256.01
עכבר רקומביננטי IFN-גמא חלבוןR& D Systems485-MI
עכבר רקומביננטי TNF-alpha (aa 80-235) חלבון, CFR& D Systems410-MT
RNeasy מיני קיטQiagen74104
SigmacoteSigma AldrichSL2-100MLמעיל בתוך צנרת זכוכית על ידי שאיבה למעלה ולמטה פעמיים ב-Sigmacote ומאפשר להתייבש היטב. עוטפים בנייר אלומיניום וצנרת חיטוי 24 שעות לאחר מכן.
StemxymeWorthington Biochemical CorporationLS004106תערובת קולגנאז/דיספאז
צמר גפן סטרילי, עטוף בנפרדPuritan Medical  25-8061WC
מוסיף תרבית רקמות דקיקה, 24 באר, גודל נקבוביות = 8 ומיקרו; mGreiner Bio-One662638
מוסיף תרבית רקמה דקה, 6 בארות, גודל נקבוביות = 0.4 ומיקרו; מגריינר ביו-וואן657641

מקורות

  1. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  2. Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
  3. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  4. Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
  5. Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
  6. Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
  7. Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83(2019).
  8. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549(2018).
  9. Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
  10. Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114(2022).
  11. Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219(2022).
  12. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784(2019).
  13. Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
  14. Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567(2022).
  15. Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99(2017).
  16. Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324(2018).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26(2012).
  19. Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551(2016).
  20. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559(2018).
  21. Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309(2017).
  22. Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408(2023).
  23. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
  24. Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
  25. Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
  26. Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
  27. Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728(2021).
  28. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).
  29. Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
  30. Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).
  31. Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MSCs ממקור רקמת שומןמחלת פריוןדלקת גליאליתתרבית משותפת של גליאה מעורבתנוירו-דלקתאקטיבציה של אסטרוציטיםאקטיבציה של מיקרוגליהאיתות פראקריניקיפול שגוי של חלבונים
תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.