מאמר שיטה

פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

DOI:

10.3791/65570

⸱

7 ביולי 2023

 ,  , 
1Ksilink

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון (PD) קשורה למגוון תהליכים ביולוגיים של התא הגורמים לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (MDA). מודלים תאיים רבים של PD במבחנה חסרים מורכבות ואינם לוקחים בחשבון פנוטיפים מרובים. פרופיל פנוטיפי בתאי עצב mDA שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) יכול לטפל בחסרונות אלה על ידי מדידה בו זמנית של מגוון פנוטיפים עצביים בסוג תא רלוונטי למחלת פרקינסון במקביל. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשגה וניתוח של פרופילים פנוטיפיים מנוירוני mDA אנושיים הזמינים באופן מסחרי. פאנל צביעה פלואורסצנטי ספציפי לנוירון משמש להמחשת הפנוטיפים הקשורים לגרעין, α-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז (TH) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2). פרוטוקול הפרופיל הפנוטיפי המתואר ניתן להרחבה מכיוון שהוא משתמש בלוחות 384 בארות, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. התועלת של הפרוטוקול מודגמת באמצעות נוירונים mDA מתורם בריא ונוירוני mDA הנושאים את מוטציית G2019S המקושרת ל- PD בגן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2). שני קווי התאים טופלו במעכב קינאז LRRK2 PFE-360 ונמדדו שינויים פנוטיפיים. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן לנתח פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים באמצעות אשכולות או שיטות סיווג מונחות למידת מכונה. הפרוטוקול המתואר יעניין במיוחד חוקרים העובדים על מודלים של מחלות עצביות או חוקרים השפעות כימיות של תרכובות בתאי עצב אנושיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון תהליכים ביולוגיים של התא מופרעים במחלת פרקינסון (PD). לדוגמה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עקה חמצונית, פגמים בפירוק חלבונים, הפרעה בסחר שלפוחית השתן ותפקוד אנדוליזוזומלי נקשרו לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA), נצפו בדרך כלל במחלת פרקינסון1. לכן, נראה כי פרקינסון מערבת מנגנוני מחלה מרובים שיכולים לתקשר זה עם זה ולהחמיר זה את זה. דרך שימושית אחת לחקור את יחסי הגומלין המכניסטיים האלה היא יצירת טביעת אצבע פנוטיפית מקיפה או פרופיל של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA).

פרופיל פנוטיפי הוא גישה הכוללת יצירת פרופיל של מדגם המבוסס על אוסף של מאפיינים מדידים, ושנית, היא כוללת ביצוע תחזיות לגבי מדגם המבוס....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיום וצלחות לזריעת נוירונים (יום 1)

  1. כדי להכין את הצלחות לזריעת תאי עצב ביום הראשון, חממו את הלמינין לטמפרטורת החדר (RT) ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת הלמינין על ידי דילול תמיסת ציר למינין (0.1 מ"ג/מ"ל) 1/10 ב-PBS + / + קר (עם Ca 2+ ו-Mg2+).
    הערה: כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים. הרכבי התמיסות והמאגרים מתוארים בטבלאות 1-4.
  2. לאחר מכן, הוסף 25 μL של תמיסת Laminin לכל באר של צלחת Poly-D-Lysine (PDL) מצופה מראש 384-well, ולדגור לילה ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הצלחות המצופות ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אטמו את הצלח....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA הוא דרך יעילה לכמת היבטים רבים של ביולוגיה תאית ואת השינויים שלהם במהלך אפנון הניסוי. כדי להדגים מתודולוגיה זו, מחקר זה עשה שימוש ב- LRRK2 G2019S שמור בהקפאה ובנוירונים mDA בריאים מתורם. נוירונים אלה נבדלו במשך כ-37 ימים, הם סמנים עצביים פוסט-מיטוטיים ומבטאים (TUBB3 ו-MAP2) וסמנים של נוירונים דופמינרגיים, כולל טירוזין הידרוקסילאז (TH) בשילוב עם FOXA2, בעוד שסמן גליה Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) נעדר14. בעקבות הפרוטוקול המתואר, שני קווי התאים גודלו בתרבית במשך.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פנוטיפי הוא טכניקה למדידת מספר רב של פנוטיפים בתאים על ידי החלת כתמים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה וניתוח תמונה3. ניתן לקבל פרופילים פנוטיפיים ולהשוות אותם בין קווי תאים או תנאי ניסוי אחרים כדי להבין שינויים מורכבים בביולוגיה התאית שעשויים להיעלם מעיניהם בעת שימוש בקריאה יחידה. כאן אנו מתארים את היישום של פרופיל פנוטיפי על נוירוני mDA אנושיים שמקורם ב- iPSC, סוג תא המשמש לעתים קרובות למדל ביולוגיה תאית של PD17,18,19

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מועסקים על ידי Ksilink.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לכל העמיתים ב-Ksilink על עזרתם רבת הערך והדיונים שהובילו לעיצוב הפרוטוקול המוצג.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי עוף – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155Immunofluorescence
Anacondahttps://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488Thermo FisherA11001Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555Thermo FisherA21429אימונופלואורסצנציה
אנטי-טירוזין הידרוקסילאזMerckT2928אימונופלואורסצנציה
אנטי-&אלפא;-סינוקלאיןAbcam138501Immunofluorescence
Bravo פלטפורמת טיפול בנוזלים אוטומטית עם ראש 384STAgilentאם אין מטפל בנוזלים זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה אלקטרונית רב-ערוצית.
מיקרוסקופ קונפוקלי YokogawaCV7000מומלץ להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי כדי להבטיח עקביות באיכות התמונה.
מונה תאים אוטומטירוזנת ספירת תאים Invitrogenלפני הזריעה. ניתן לעשות זאת גם באמצעות תא ספירה ידני.
DPBS +/+Gibco14040-133מאגר לשטיפת
EL406 מתקן כביסה BioTek (אג'ילנט) אם אין מטפל בנוזלים זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה רב-ערוצית אלקטרונית.
תמיסת פורמלדהיד (PFA 16%)EuromedexEM-15710-Sקיבוע לפני צביעה
Hoechst 33342InvitrogenH3570צביעה גרעינית
iCell Base Medium 1FujifilmM1010מדיום בסיס לנוירונים
iCell DPN, תורם#01279, פנוטיפ AHN, lot#106339, 1MFujifilmC1087תורם בריא לכאורה
iCell DPN, תורם #11299, פנוטיפ LRRK2 G2019S, פנוטיפ PD lot#106139FujifilmC1149תורם הנושא מוטציה LRRK2 G2019S 
תוסף מערכת העצבים iCellFujifilmM1031תוסף למדיום
בסיס תוסף עצבי iCell BFujifilmM1029תוסף למדיום
בסיס Jupyter PythonNotebook פיתוח פנימיhttps://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfilingמחברת לביצוע הדמיה וסיווג פרופיל פנוטיפי מנתונים גולמיים.
למיניןביולמינהLN521ציפוי צלחת
PFE-360MedChemExpressHY-120085מעכב קינאז LRRK2
PhenoLinkhttps://github.com/Ksilink/PhenoLink פיתוח פנימיתוכנה לניתוח תמונה
PhenoPlate 384w, מצופה PDLפרקין אלמר6057500צלחת מצופה מראש לתרבית תאים והדמיה. צלחת זו מאפשרת הדמיה של כל הבארות באמצעות כל המטרות של מיקרוסקופ Yokogawa CV7000.
לוחות אחסון Abgene 120 ומיקרו; LThermo ScientificAB-0781הכרחי לחלוקת תרכובות באמצעות מערכת הפיפטינג Vprep. אם אינו זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה אלקטרונית רב ערוצית.
TritonSigmaT9284פרמביליזציה לפני ליזה
Trypan BlueSigmaT8154-20MLקביעת תאים חיים
מערכת צנרת Vprep שינוי בינוני זריזוחלוקת תרכובות. לחלופין, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית אלקטרונית.
של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Phenotypic ProfilingDopaminergic NeuronsHuman Stem CellsParkinson s DiseaseMidbrain NeuronsHigh Throughput MicroscopyFluorescent StainingLRRK2 MutationImage SegmentationMachine Learning Classification

מאמרים קשורים