מאמר שיטה

פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

DOI:

10.3791/65570

⸱

7 ביולי 2023

 ,  , 
1Ksilink

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון (PD) קשורה למגוון תהליכים ביולוגיים של התא הגורמים לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (MDA). מודלים תאיים רבים של PD במבחנה חסרים מורכבות ואינם לוקחים בחשבון פנוטיפים מרובים. פרופיל פנוטיפי בתאי עצב mDA שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) יכול לטפל בחסרונות אלה על ידי מדידה בו זמנית של מגוון פנוטיפים עצביים בסוג תא רלוונטי למחלת פרקינסון במקביל. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשגה וניתוח של פרופילים פנוטיפיים מנוירוני mDA אנושיים הזמינים באופן מסחרי. פאנל צביעה פלואורסצנטי ספציפי לנוירון משמש להמחשת הפנוטיפים הקשורים לגרעין, α-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז (TH) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2). פרוטוקול הפרופיל הפנוטיפי המתואר ניתן להרחבה מכיוון שהוא משתמש בלוחות 384 בארות, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. התועלת של הפרוטוקול מודגמת באמצעות נוירונים mDA מתורם בריא ונוירוני mDA הנושאים את מוטציית G2019S המקושרת ל- PD בגן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2). שני קווי התאים טופלו במעכב קינאז LRRK2 PFE-360 ונמדדו שינויים פנוטיפיים. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן לנתח פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים באמצעות אשכולות או שיטות סיווג מונחות למידת מכונה. הפרוטוקול המתואר יעניין במיוחד חוקרים העובדים על מודלים של מחלות עצביות או חוקרים השפעות כימיות של תרכובות בתאי עצב אנושיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון תהליכים ביולוגיים של התא מופרעים במחלת פרקינסון (PD). לדוגמה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עקה חמצונית, פגמים בפירוק חלבונים, הפרעה בסחר שלפוחית השתן ותפקוד אנדוליזוזומלי נקשרו לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA), נצפו בדרך כלל במחלת פרקינסון1. לכן, נראה כי פרקינסון מערבת מנגנוני מחלה מרובים שיכולים לתקשר זה עם זה ולהחמיר זה את זה. דרך שימושית אחת לחקור את יחסי הגומלין המכניסטיים האלה היא יצירת טביעת אצבע פנוטיפית מקיפה או פרופיל של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA).

פרופיל פנוטיפי הוא גישה הכוללת יצירת פרופיל של מדגם המבוסס על אוסף של מאפיינים מדידים, ושנית, היא כוללת ביצוע תחזיות לגבי מדגם המבוסס על פרופיל זה 2,3. מטרת יצירת הפרופילים היא ללכוד מגוון רחב של תכונות, שחלקן אולי לא היו קשורות בעבר למחלה או לטיפול3. כתוצאה מכך, פרופיל יכול לחשוף תהליכים ביולוגיים בלתי צפויים. פרופיל פנוטיפי מסתמך בדרך כלל על תאים מוכתמים פלואורסצנטית, ובדיקות סטנדרטיות, כגון צביעת תאים, פותחו ליצירת פרופילים פנוטיפיים4. לאחרונה, פרופיל פנוטיפי יושם, למשל, עבור אפיון של מולקולות קטנות או חיזוי מדויק של תת-סוגים של PD אך ורק על סמך פיברובלסטיםשמקורם במטופל 5,6. למרות התקדמות זו, פרופיל פנוטיפי כמעט ולא יושם על תאים ממוינים פוסט-מיטוטיים, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי עצב mDA המבטאים מוטציות הקשורות לפרקינסון כגון LRRK2 G2019S. אתגרים משמעותיים של מודלים שמקורם ב-iPSC כוללים את נוכחותם של מאפיינים פתולוגיים עדינים או משתנים על פני קבוצות התמיינות או גנוטיפים, והעובדה שפנוטיפים מבודדים של פרקינסון אינם לוכדים את מלוא המורכבות של המחלה. יתר על כן, בעוד מודלים עצביים iPSC רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם משמשים לעתים רחוקות בתהליכי גילוי תרופות PD בשל חששות לגבי מורכבות טכנית 7,8.

בעבר פיתחנו מתודולוגיה חזקה למדידת פנוטיפים פתופיזיולוגיים מרובים הקשורים לפרקינסון בנוירוני mDA אנושיים הרגישים הן לשינויים פנוטיפיים גנטיים והן כימיים הנגרמים על ידי תרכובת9. מאמר זה מתאר בפירוט גרסה ממוטבת נוספת של המתודולוגיה הזו ליצירת פרופילים פנוטיפיים מתאי עצב mDA (איור 1). לפרוטוקול זה יש מספר יתרונות על פני גישות הפרופיל הפנוטיפיות שתוארו קודם לכן, כגון שימוש בנוירוני mDA באיכות גבוהה ויכולת שחזור טכנית. לראשונה, פרוטוקול זה מאפשר יצירת פרופיל פנוטיפי בנוירוני mDA פוסט-מיטוטיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לאחר הפרעות כימיות באופן מדרגי ביותר. נוירוני mDA ממוינים לחלוטין ושמורים בהקפאה זמינים מסחרית, ומפחיתים באופן משמעותי את שונות ההתמיינות בין אצווה לאצווה. שנית, ניתן לצמצם עוד יותר את השונות הטכנית על ידי שימוש בתכנון ניסויי מוגדר היטב (כלומר, משך תרבית או הימנעות מבארות קצה), טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ אוטומטי. בנוסף, השלבים הראשונים של ניתוח פרופיל פנוטיפי באמצעות אשכולות לא מפוקחים או גישות סיווג מפוקחות מתוארים כאן, המציינים כיצד ניתן לנתח נתוני פרופיל פנוטיפי. פרוטוקול זה ישמש חוקרים המעוניינים בשינויים פנוטיפיים של נוירוני mDA הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או כימיות, במיוחד כאשר נדרש מערך מחקר מדרגי מאוד, למשל, במהלך מסעות סינון או כאשר יש לחקור את ההשפעות של מספר קטן יותר של תרכובות, למשל, כדי לקבוע השפעות רעילות. לסיכום, צפוי כי היישום של פרופיל פנוטיפי של נוירונים אנושיים הוא טכניקה רבת ערך לחקר פנוטיפים מורכבים הקשורים למחלות ולאפיין את ההשפעות התאיות של מועמדים לתרופות.

figure-introduction-1
איור 1: תיאור סכמטי של פרוטוקול הניסוי ליצירת פרופילים פנוטיפיים מבוססי תמונה מתאי עצב mDA אנושיים שמקורם בתאי עצב שמקורם בתאי עצב iPSC. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיום וצלחות לזריעת נוירונים (יום 1)

  1. כדי להכין את הצלחות לזריעת תאי עצב ביום הראשון, חממו את הלמינין לטמפרטורת החדר (RT) ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת הלמינין על ידי דילול תמיסת ציר למינין (0.1 מ"ג/מ"ל) 1/10 ב-PBS + / + קר (עם Ca 2+ ו-Mg2+).
    הערה: כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים. הרכבי התמיסות והמאגרים מתוארים בטבלאות 1-4.
  2. לאחר מכן, הוסף 25 μL של תמיסת Laminin לכל באר של צלחת Poly-D-Lysine (PDL) מצופה מראש 384-well, ולדגור לילה ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הצלחות המצופות ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אטמו את הצלחות באמצעות סרט פלסטיק.
  3. הכינו מדיית תחזוקה מלאה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש (טבלה 1).

2. הפשרת נוירונים (יום 0)

  1. כדי להפשיר את תאי העצב ביום 0, חממו מראש אמבט מים ל -37 מעלות צלזיוס, ואזנו את מדיית התחזוקה המלאה ל- RT, המוגנת מפני אור.
  2. הוציאו את הבקבוקון המכיל את תאי העצב הקפואים שהושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ממיכל החנקן הנוזלי והניחו אותו על קרח יבש. לאחר מכן מניחים את הבקבוקון באמבט המים למשך 2 דקות. לאחר הפשרת הנוזל לחלוטין, יש לחטא את הבקבוקון באתנול 70%.
  3. שאפו את תאי העצב המופשרים עם פיפטה P1000 (בסביבות 370 מיקרוליטר) והעבירו אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ללא פיפטינג מעלה ומטה. לאחר מכן, שטפו את הבקבוקון עם 630 μL של אמצעי תחזוקה מלאה, ושחררו טיפה אחר טיפה (זווית של 45°) בצינור 50 מ"ל. יש להרגיז לאט תוך כדי ניפוק.
    הערה: קריטי לפזר את המדיום לאט, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע קרע אוסמוטי של התאים. זווית של 45° ותסיסת אור ממזערות לחץ אוסמוטי מקומי גבוה במהלך פיפטינג.
  4. באופן דומה, הוסף 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל עם פיפטה P1000. לאחר מכן, להוסיף לאט 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. יש להרגיז בזהירות בזמן הניפוק.
  5. ספור את התאים. הכינו מיקרו-צינור עם 10 μL Trypan Blue ותרחיף תאים 10 μL והוסיפו לשקופית תא ספירה (10 μL). בצע ספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים) או באופן ידני.
  6. לאחר הספירה, צנטריפוגו את צינור 50 מ"ל המכיל את הנוירונים ב 400 x g במשך 5 דקות ב RT, ולהסיר את supernatant. בזהירות resuspend את הגלולה באמצעות פיפטה P1000 ו 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. לאחר מכן הוסף את הנפח הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי (300,000 תאים / מ"ל, ראה גם השלב הבא).

3. זריעת נוירונים על צלחות מוכנות (יום 0)

  1. כדי לזרוע תאי עצב על הצלחות המוכנות ביום 0, הוציאו את הצלחות המצופות מהמקרר, הניחו אותן מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים ותנו להן להתאזן ל-RT למשך כ-30 דקות.
  2. רגע לפני הזריעה, שאפו לתמיסת ציפוי 15 μL עם מטפל נוזלים אוטומטי או פיפטה 16 ערוצים. השאירו כ-10 מיקרוליטר לבאר כדי למנוע נזק לציפוי.
  3. לאחר מכן, שחררו 50 מיקרוליטר של תמיסת התא המכילה 300,000 תאים/מ"ל (שהוכנו בשלב 2.6) לכל באר עם פיפטה בת 16 ערוצים, והתוצאה היא 15,000 נוירונים שנזרעו לכל באר ונפח סופי לכל באר של 60 מיקרוליטר.
  4. בלוח של 384 בארות, הימנע משימוש בעמודות 1, 2, 23, 24 ובשורות A, B, O ו- P כדי למזער אפקטי קצה אפשריים שעלולים להשפיע על הפרופילים הפנוטיפיים. מלא את הבארות הריקות שאינן בשימוש עם 80 μL של PBS. לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2.

4. שינוי בינוני או טיפול מורכב (יום 3)

  1. בהתאם למספר הבארות, יש לחמם מראש נפח מתאים של אמצעי תחזוקה מלא ב-RT. יש להגן מפני אור.
  2. אם נדרש שינוי בינוני, המשך לשלב 4.4. אם רוצים טיפול בתרכובת, יש לוודא את ריכוז מלאי התרכובת ואת הממס המשומש (מים, DMSO, מתנול וכו').
  3. הכינו תמיסת תרכובת מרוכזת פי 1.5 לכל הריכוזים הרצויים לבדיקה. הכינו את הדילולים המורכבים באמצעות Complete Maintenance Medium.
    הערה: כבקרה ניטרלית, השתמש בממס המתאים באותו ריכוז כמו התרכובת הנבדקת. אם משתמשים בתרכובות מרובות או לא ידועות בריכוזים שונים, מומלץ לבצע ניסוי מנה-תגובה נפרד כדי למדוד את השפעות הממס על הפרופיל הפנוטיפי.
  4. אם נעשה שימוש במערכת צנרת אוטומטית, הוסף 60 μL של תמיסת התרכובת 1.5x לצלחת אחסון של 384 בארות. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים. אם נדרש שינוי בינוני, הוסף 60 μL של אמצעי תחזוקה מלאה במקום.
  5. באמצעות מערכת הצנרת האוטומטית, שאפו והשליכו 40 מיקרוליטר של מדיום לכל באר מהצלחת המכילה נוירונים כדי לשמור על 20 μL/באר. לאחר מכן הוסף 40 μL / באר של תמיסת תרכובת 1.5x מלוח האחסון של 384 בארות לכל באר כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי.
    הערה: חשוב לא לבצע שינויי מדיום מלאים אלא להשאיר תמיד שאריות תווך בבאר כדי למנוע נזק לשטיח העצבי או לציפוי.
  6. במקרה התרבות העצבית מבוצעת במשך יותר מ 6 ימים המתוארים בפרוטוקול זה, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.

5. קיבוע נוירונים והכתמה (ימים 6 עד 7)

  1. כדי לתקן ולהכתים את תאי העצב בימים 6 ו-7, השתמשו במטפל אוטומטי בנוזלים לכל שלבי הניפוק והכביסה. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים.
  2. הכינו פתרון 10% Triton X-100 על ידי דילול Triton X-100 ב-1x PBS. מערבולת עד שהפתרון הומוגני. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  3. כדי לתקן את הנוירונים, יש לפזר 20 μL/well של 16% PFA והתוצאה היא ריכוז סופי של 4%. דגרו על הצלחת במשך 30 דקות ב-RT, ושטפו אותה שלוש פעמים עם 1x PBS. השאירו 20 מיקרוליטר/באר של PBS לאחר השטיפה האחרונה.
    אזהרה: PFA מוכר כחומר מסוכן הידוע כגורם לרעילות דרך הפה, העור והנשימה. הוא גם מהווה איום על העיניים ועלול להוביל למוטציות גנטיות ולסרטן. טיפול נכון ב-PFA מחייב שימוש בציוד מגן אישי מתאים, כגון הגנה על העיניים והפנים, בנוסף להבטחת אוורור נאות. חשוב למנוע שחרור של PFA לסביבה.
  4. לחדירה וחסימה, הכינו פתרון חסימה פי 2 (טבלה 2).
  5. הוסף 20 μL / באר של 2x פתרון חסימה (ריכוז סופי 1x), לדגור במשך 1 שעה ב RT, ולשטוף פעם אחת עם PBS. יש לשמור 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
  6. לצביעת נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה ראשוני פי 2 (טבלה 3).
  7. הוסף 20 μL / באר של 2x חיץ צביעה ראשוני (1x ריכוז סופי) ודגר לילה ב 4 ° C. למחרת בבוקר ביום 7, שטפו שלוש פעמים עם PBS. יש להשאיר 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
  8. לצביעת נוגדנים שניונית (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה משני פי 2 (טבלה 4).
  9. יש להוסיף 20 μL/well של חיץ צביעה משני פי 2 (ריכוז סופי של 1x), לדגור במשך שעתיים ב-RT הרחק מאור, ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. השאירו 100 μL PBS / היטב לאחר הכביסה האחרונה.
    1. הוסיפו איטום אלומיניום על הצלחת כדי למזער אידוי. לחלופין, מכסים את הצלחת בסרט פלסטיק ובנייר אלומיניום. המשך לרכישת תמונה, או אחסן את הצלחת ב- 4 ° C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אם נצפתה פלואורסצנטיות רקע, שקול להגדיל את זמן החסימה. אם הכתמים אינם מספיקים, נסה להגדיל את ריכוז הנוגדנים הראשוני או את זמן הדגירה.

6. הדמיה של נוירונים מוכתמים פלואורסצנטית (יום 7)

  1. רכשו תמונות של תאי העצב המצופים, המתורבתים והמוכתמים ביום השביעי. באופן אידיאלי, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, רכשו תמונות באופן ידני.
  2. רכשו את ערוצי Hoechst, TH, α-synuclein ו-MAP2 באמצעות לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-647 ננומטר, בהתאמה (איור 2).
    הערה: כדי להפיק כמות מספקת של נתונים מפורטים עבור פרופיל פנוטיפי, השתמש במטרה של 40x ורכוש 16 שדות/באר באמצעות ערימות Z המורכבות מ-3 פרוסות Z המופרדות ב-2 מיקרומטר. במקרה שיש נזקים הקשורים לצנרת בשטיח העצבי, נסו להימנע מהדמיה של אזורים אלה.
  3. בהתאם למיקרוסקופ ולמצלמה, התאימו את זמני החשיפה ועוצמות העירור עבור כל אחד מארבעת ערוצי הפלואורסצנט בנפרד כדי לקבל טווח דינמי אופטימלי של עוצמות הפלואורסצנט.
    הערה: תוכנת הדמיה מספקת לעתים קרובות היסטוגרמה כדי לקבוע את זמן החשיפה האידיאלי. אם ההיסטוגרמה מוסטת יותר מדי שמאלה בטווח האות הנמוך, זמן החשיפה קצר מדי או שעוצמת העירור נמוכה מדי. אם יש צוק חד ברמת האות המקסימלית מימין, ערך האות רווי. במקרה זה, להפחית את עוצמת העירור או לקצר את זמן החשיפה.
  4. אחסן תמונות בפורמט פתוח וללא אובדן נתונים, כגון .tif.

7. עיבוד תמונה (יום 8)

  1. פילוח תמונות וחילוץ תכונות פנוטיפיות נדרשים ליצירת פרופילים פנוטיפיים כמותיים. השתמש בתוכנת PhenoLink לפילוח תמונות וחילוץ תכונות (רשימת חומרים). הוראות להתקנת PhenoLink ניתן למצוא במאגר GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    הערה: פילוח תמונה משמש לזיהוי ולהפרדה של אובייקטים או אזורים שונים בתמונה, בעוד חילוץ תכונות פנוטיפי משמש לניתוח ולחילוץ מידע רלוונטי מאזורים אלה. מספר פתרונות תוכנה חלופיים, כגון CellProfiler 10, ImageJ/FIJI11, Napari 12 או Knime Analytics Platform13 זמינים לחילוץ מידע כמותי מתמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות.
  2. בצעו פילוח תמונה בתמונות גולמיות מתוקנות תאורה. קבעו אמפירית את ספי עוצמת הערוץ הפלואורסצנטי המתאימים לכל לוחית, כך שאות הרקע יהיה מינימלי, והאות המקוטע הרצוי יתאים לאות בתמונה הגולמית. לוחות שעובדו ונצבעו באותו יום דורשים בדרך כלל ספי עוצמת ערוץ דומים לצורך סגמנטציה.
  3. הגדר את גודל הגרעין ועוצמתו כדי להפריד בין תאים חיים לתאים מתים. בעת שימוש בתמונות 40x, שמור על כל פרמטרי ברירת המחדל האחרים והפעל את התוכנה. מאה עשרים ושש תכונות תמונה כמותיות יחושבו לכל באר (טבלה משלימה 1).
  4. השתמש בנתונים הכמותיים הטבלאיים המתקבלים כדי לבנות פרופילים פנוטיפיים ולהשוות פרופילים פנוטיפיים מקווי תאים שונים או מתנאי טיפול שונים. כל שורה מתאימה למצב ביולוגי (טוב) וכל עמודה מתאימה לתכונה פנוטיפית קבועה.
    הערה: אנו מספקים קובץ פלט לדוגמה יחד עם צינור ניתוח הנתונים כדי להמחיש את השימוש בו (ראה טבלת חומרים). נוסף על כך, איור 3 מראה את ההרכב של פרופיל פנוטיפי.

8. יצירת פרופיל פנוטיפי והדמיה (יום 8)

  1. אם Python ו-Jupyter אינם מותקנים במחשב שלך, התקן את Anaconda Distribution ופתח את תוכנת Jupyter. הורד את מחברת Jupyter שסופקה ואת כל הקבצים האחרים שסופקו ושמור אותם באותה ספרייה (ראה טבלת חומרים). פתח את קובץ המחברת Jupyter באמצעות תוכנת Jupyter.
    הערה: אנקונדה היא פלטפורמת קוד פתוח חופשית לשפות תכנות כגון Python. פלטפורמה זו מגיעה עם מתורגמן Python Jupyter אשר יכול לבצע את מחברת Jupyter שסופקה כדי ליצור ולנתח פרופילים פנוטיפיים (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. הפעל את מחברת Jupyter תא אחר תא באמצעות תוכנת Jupyter. הנתונים לדוגמה שסופקו .fth ודרישות .txt קבצים צריכים להיות ממוקמים באותה ספריה כמו מחברת Jupyter. כל תא מחברת Jupyter מבואר כדי להסביר את הפונקציונליות שלו.
    הערה: חיוני להשתמש במחברת Jupyter בסדר הנכון החל מטעינת נתונים ושינוי קנה מידה ולהמשיך תא אחר תא עד הסוף. כל הנתונים ופלט הגרפיקה יאוחסנו בתיקייה חדשה שנוצרה בספריית המקור של מחברת Jupyter. איור 4 מתאר את זרימת העבודה ואת פלט זרימת העבודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA הוא דרך יעילה לכמת היבטים רבים של ביולוגיה תאית ואת השינויים שלהם במהלך אפנון הניסוי. כדי להדגים מתודולוגיה זו, מחקר זה עשה שימוש ב- LRRK2 G2019S שמור בהקפאה ובנוירונים mDA בריאים מתורם. נוירונים אלה נבדלו במשך כ-37 ימים, הם סמנים עצביים פוסט-מיטוטיים ומבטאים (TUBB3 ו-MAP2) וסמנים של נוירונים דופמינרגיים, כולל טירוזין הידרוקסילאז (TH) בשילוב עם FOXA2, בעוד שסמן גליה Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) נעדר14. בעקבות הפרוטוקול המתואר, שני קווי התאים גודלו בתרבית במשך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פנוטיפי הוא טכניקה למדידת מספר רב של פנוטיפים בתאים על ידי החלת כתמים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה וניתוח תמונה3. ניתן לקבל פרופילים פנוטיפיים ולהשוות אותם בין קווי תאים או תנאי ניסוי אחרים כדי להבין שינויים מורכבים בביולוגיה התאית שעשויים להיעלם מעיניהם בעת שימוש בקריאה יחידה. כאן אנו מתארים את היישום של פרופיל פנוטיפי על נוירוני mDA אנושיים שמקורם ב- iPSC, סוג תא המשמש לעתים קרובות למדל ביולוגיה תאית של PD17,18,19

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מועסקים על ידי Ksilink.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לכל העמיתים ב-Ksilink על עזרתם רבת הערך והדיונים שהובילו לעיצוב הפרוטוקול המוצג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי עוף – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155Immunofluorescence
Anacondahttps://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488Thermo FisherA11001Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555Thermo FisherA21429אימונופלואורסצנציה
אנטי-טירוזין הידרוקסילאזMerckT2928אימונופלואורסצנציה
אנטי-&אלפא;-סינוקלאיןAbcam138501Immunofluorescence
Bravo פלטפורמת טיפול בנוזלים אוטומטית עם ראש 384STAgilentאם אין מטפל בנוזלים זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה אלקטרונית רב-ערוצית.
מיקרוסקופ קונפוקלי YokogawaCV7000מומלץ להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי כדי להבטיח עקביות באיכות התמונה.
מונה תאים אוטומטירוזנת ספירת תאים Invitrogenלפני הזריעה. ניתן לעשות זאת גם באמצעות תא ספירה ידני.
DPBS +/+Gibco14040-133מאגר לשטיפת
EL406 מתקן כביסה BioTek (אג'ילנט) אם אין מטפל בנוזלים זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה רב-ערוצית אלקטרונית.
תמיסת פורמלדהיד (PFA 16%)EuromedexEM-15710-Sקיבוע לפני צביעה
Hoechst 33342InvitrogenH3570צביעה גרעינית
iCell Base Medium 1FujifilmM1010מדיום בסיס לנוירונים
iCell DPN, תורם#01279, פנוטיפ AHN, lot#106339, 1MFujifilmC1087תורם בריא לכאורה
iCell DPN, תורם #11299, פנוטיפ LRRK2 G2019S, פנוטיפ PD lot#106139FujifilmC1149תורם הנושא מוטציה LRRK2 G2019S 
תוסף מערכת העצבים iCellFujifilmM1031תוסף למדיום
בסיס תוסף עצבי iCell BFujifilmM1029תוסף למדיום
בסיס Jupyter PythonNotebook פיתוח פנימיhttps://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfilingמחברת לביצוע הדמיה וסיווג פרופיל פנוטיפי מנתונים גולמיים.
למיניןביולמינהLN521ציפוי צלחת
PFE-360MedChemExpressHY-120085מעכב קינאז LRRK2
PhenoLinkhttps://github.com/Ksilink/PhenoLink פיתוח פנימיתוכנה לניתוח תמונה
PhenoPlate 384w, מצופה PDLפרקין אלמר6057500צלחת מצופה מראש לתרבית תאים והדמיה. צלחת זו מאפשרת הדמיה של כל הבארות באמצעות כל המטרות של מיקרוסקופ Yokogawa CV7000.
לוחות אחסון Abgene 120 ומיקרו; LThermo ScientificAB-0781הכרחי לחלוקת תרכובות באמצעות מערכת הפיפטינג Vprep. אם אינו זמין, מומלץ להשתמש בפיפטה אלקטרונית רב ערוצית.
TritonSigmaT9284פרמביליזציה לפני ליזה
Trypan BlueSigmaT8154-20MLקביעת תאים חיים
מערכת צנרת Vprep שינוי בינוני זריזוחלוקת תרכובות. לחלופין, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית אלקטרונית.
של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
  3. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  4. Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  5. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).
  6. Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
  7. Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
  8. Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
  9. Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
  10. Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
  13. Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
  14. Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
  15. Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
  16. Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
  17. Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373(2021).
  18. Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
  19. Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
  20. Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
  21. Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
  22. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).
  23. Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
  24. Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
  25. Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381(2021).
  26. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  27. Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
  28. Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
  29. Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542(2020).
  30. Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Phenotypic ProfilingDopaminergic NeuronsHuman Stem CellsParkinson s DiseaseMidbrain NeuronsHigh Throughput MicroscopyFluorescent StainingLRRK2 MutationImage SegmentationMachine Learning Classification

מאמרים קשורים