הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מודל עכברי פיסטולה אורונזלית

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65578

⸱

8 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Head and Neck Oncology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 3State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Eastern Clinic, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 4State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב להקמת מודל עכברים עם פיסטולה אורונזאלית. הפיסטולה האורונזאלית נוצרה על ידי שימוש בצריבה אופתלמולוגית מחוממת כדי לפגוע בחלק קו האמצע של החיך הקשה, וכתוצאה מכך נוצר פתח בין חלל הפה והאף.

תקציר

מחקר זה מציג שיטה המשתמשת בצריבה אופתלמולוגית מחוממת לפיתוח מודל בר קיימא לחקר פיסטולות אורונזאליות. עכברי C57BL/6 שימשו לביסוס מודל הפיסטולה האורונזאלית (ONF). כדי ליצור את ONF, העכברים הורדמו, שותקו, והחיך הקשה שלהם נחשף. במהלך ההליך הכירורגי נגרמה פגיעה ברירית בעובי מלא של 2.0 x 1.5 מ"מ בקו האמצע של החיך הקשה באמצעות צריבה אופתלמולוגית. היה חיוני לשלוט בגודל ה-ONF ולמזער דימום כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. אימות יעילות מודל ONF נערך ביום השביעי שלאחר הניתוח, וכלל הערכות אנטומיות ותפקודיות כאחד. נוכחותה של מחיצת האף בתוך חלל הפה ויציאת המים הסטריליים מהנחיריים עם הזרקתם לחלל הפה אישרו את הקמתו המוצלחת של מודל ONF. המודל הדגים פיסטולה אורונזאלית מעשית ומוצלחת, המאופיינת בשיעור תמותה נמוך, שינויים משמעותיים במשקל ושונות מינימלית בגודל ONF. מחקרים עתידיים עשויים לשקול לאמץ מתודולוגיה זו כדי להבהיר את מנגנוני ריפוי פצעי החיך ולחקור טיפולים חדשניים לפיסטולות אורונזאליות.

מבוא

פיסטולה אורונזאלית (ONF), פתח לא תקין בין חלל הפה והאף, מתבטאת קלינית בפגם באזור מבני מתהליך הנאדיות ועד האובולה, המתרחש בדרך כלל כסיבוך לאחר תיקון חיך שסוע1. חולים עם ONF חווים ריפלוקס מזון, הפרעות ביטוי ותפקוד וולופרינגיאלי לקוי, המשפיעים באופן משמעותי על איכות חייהם 2,3,4. שיעור ONF לאחר הניתוח נע בין 2.4% ל -55% בשל גורמים כגון רוחב שסוע, סוג Veau ושיטה כירורגית 5,6,7,8. בנוסף, שיעור ההישנות לאחר תיקון ONF גבוה, ונע בין 0% ל-43%9.

מספר טיפולים חדשניים הראו לאחרונה הבטחה בתחום ONF, כולל חומרים שונים, תרופות וטכניקות חדשניות 10,11,12,13,14,15,16,17. הערכה מדויקת של השפעות טיפוליות היא חיונית מכיוון שהיא מספקת את הבסיס לבחירה ופיתוח נוסף של טיפולי ONF. עם זאת, קבלת הערכה תקפה בטווח הקצר עבור השפעות טיפוליות שאינן ניתוח היא מאתגרת, שכן המאפיינים של ONFs משתנים בין חולים שונים. לכן, הקמת מודל מחלת ONF נחוצה כדי לוודא את היעילות של שיטות טיפול אלה.

במשך כמה עשורים, חוקרים יצרו את מודל הפיסטולה האורונזאלית (ONF) במינים שונים של בעלי חיים, כולל חולדות18,19, חזירונים 20,21, מיני-חזירים 22 וכלבים 23, שכן למינים אלה יש חיך קשה משמעותי המתאים למניפולציה כירורגית. עם זאת, לעכברים יש רצף גנטי וגנום שלם הדומה לזה של בני אדם, מה שהופך אותם למודל חשוב למחקר ופיתוח תרופות חדשות24,25,26. יתר על כן, עכברים מציעים שונות קטנה מאצווה לאצווה, מה שהופך אותם לבחירה חיובית להקמת מודל ONF12,13,27.

עם זאת, השלבים המפורטים ליצירת ONF לא תוארו, והיציבות של גודל ONF לא נלקחה בחשבון. בנוסף, אימות היווצרות ONF הסתמך אך ורק על תצפית28, מבלי להבטיח תקשורת ישירה בין חלל הפה והאף. זה לא הודגם באמצעים אחרים, כגון אובדן משקל הגוף של העכבר עקב קשיי אכילה שנגרמו על ידי ONF. יתר על כן, שונות נורמלית בגודל הפצע לא נלקחה בחשבון, וזה חיוני למחקרים על תרופות או חומרים המקדמים או מעכבים ריפוי פצעים. לכן, יש צורך חזק להקים מודל ONF יציב ומאומת.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח מודל ONF מעשי המתייחס לסוגיות הנ"ל, בתקווה שפרוטוקול זה ישמש בסיס למחקר עתידי על מנגנוני ריפוי פצעי החיך וטיפולים חדשניים ל- ONF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. עכברי C57BL/6 בוגרים (נקבה) שימשו במחקר הנוכחי.

1. הכנה כירורגית

  1. אספו את כלי הניתוח הדרושים להליך: נביטה, צריבה אופתלמולוגית, מספריים מיקרו-כירורגיים, פינצטה מיקרו-כירורגית, מזרקים ומחטים (26 גרם x 0.63 אינץ') (איור 1A,B) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: לפני ההליך הכירורגי, autoclave את כלי הניתוח, כולל צריבה אופתלמולוגית, פינצטה microsurgical ומספריים microsurgical , ב 102.9 kPa (1.05 ק"ג / ס"מ2) ו 121 ° C במשך 20 דקות.
  2. אספו את הציוד הכירורגי הדרוש: וילונות כירורגיים, כפפות לטקס, כותנה סטרילית, יריעות סטריליות, רדיד מתכת סטרילי, לוח קצף כפלטפורמה כירורגית, גומיות (שניתן להשיג על ידי קריעת כפפת לטקס רפואית) וסרט (איור 1C) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: השתמש בערכת חומרים מתכלים נפרדת עבור כל עכבר, כולל מזרקים ויריעות סטריליות עבור שדה הניתוח.
  3. נקו את אזור הניתוח ואת מכשיר הניתוח (מקור אור, לוח קצף ומכשיר לתחזוקת טמפרטורה, ראו טבלת חומרים) באמצעות מגבוני אלכוהול. כסו את הידיות והידיות של מכשירים שעשויים להידרש במהלך ההליך ברדיד מתכת סטרילי.
  4. פתח את המכשירים הבודדים ומקם אותם בזהירות באזור הניתוח. הפעל את המביט (ראה טבלת חומרים) ואת האורות לשימוש במהלך ההליך. מניחים את הצריבה האופטלמולוגית לתוך הנבט ומחממים אותו ל 250 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

2. הליך כירורגי

  1. בצע קיבוע של העכבר ופתח את חלל הפה לפי השלבים הבאים.
    1. בחר עכבר נקבה C57BL/6J במשקל 20-25 גרם ובגילאי 8-12 שבועות. בית העכבר במשך 7 ימים לפני ביצוע הליכים כלשהם.
    2. הרדימו את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של Zoletil50 (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים). החל משחת עיניים אופתלמית על העין של העכבר. חכו עד שלא תהיה תגובה של צביטת אצבע.
      הערה: העכבר מוכן להליך כאשר אין באפשרותו להתהפך באופן עצמאי.
    3. חבר את העכבר ללוח קצף מרופד ביריעות סטריליות. השתמשו בסרט הדבקה כדי לקשור את העכבר למשטח הניתוח במצב שכיבה (איור 2A).
    4. פתח את חלל הפה של העכבר. מקם שתי מחטים (26 גרם x 0.63 אינץ ') לפני מישור האוזן המסלולית ושתיים נוספות מאחוריו. מניחים גומייה סביב המחטים וחוצים את החותכות כדי להחזיק את הפה פתוח. השתמשו בפינצטה מיקרוכירורגית כדי לפתוח את זוויות הפה (איור 2B).
      הערה: ודא שהחיך הקשיח חשוף בבירור. קבע את הלשון מתחת לגומייה כדי למנוע חסימה של שדה הראייה וצריבה במהלך הניסויים הבאים.
  2. צרו את הפיסטולה האורונזאלית (ONF) על החיך הקשה (איור 3A-F).
    1. אחזר את הצריבה אופתלמולוגית, אשר כבר מחומם ל 250 ° C במשך 20 דקות. מניחים את קצה הצריבה במרחק של 1 מ"מ מההצטלבות של קו האמצע של החיך וקו הטוחנת הקדם-טוחנת הראשונה, ויוצרים פגיעה ברירית בעובי מלא לחיך הקשה בקו האמצע.
      הערה: הימנע מצריבת לשון העכבר.
    2. לאחר מספר שניות, הסר את הצריבה האופטלמולוגית כאשר הרירית סביב קצה הצריבה הופכת לבנה.
    3. מניחים את הצריבה האופטלמולוגית בנבט וממשיכים לחמם אותה ל 250 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חזור על השלב הקודם כדי להגדיל את הפצע סביב הקצוות עד שהוא מגיע לאורך של 2.0 מ"מ ורוחב של 1.5 מ"מ.
      הערה: כל הארכה צריכה לעקוב אחר קצה הפציעה האחרונה. השתמש בקליפר ורנייר כדי למדוד את אורך ורוחב הפציעה. הפציעה צריכה לכסות 10% מהחיך.
    4. השתמש מספריים microsurgical כדי להסיר כל רקמה רכה denatured עודף סביב הפצע. השתמש כותנה סטרילית כדי לעצור דימום ולמנוע שאיפה חנק של העכבר. מדדו את הפצע כדי לוודא שהוא יוצר פגיעה ברירית החיך הקשה בעובי מלא בגודל 2.0 x 1.5 מ"מ בקו האמצע.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. מתן Meloxicam לעכבר בזמן התעוררות לאחר הניתוח, במינון של 5 מ"ג / ק"ג / d במשך 3 ימים, תת עורית29.
  2. הניחו את העכבר על מכשיר לשמירת טמפרטורה עד שהוא חוזר להכרה מלאה.
    הערה: ודא שהעכבר ממוקם באופן המאפשר נשימה. סובבו את העכברים כל 10-15 דקות כדי למנוע איגום דם או קריסה של אונות ריאה. לאחר שהעכבר התחמם, החזירו אותו לכלוב שלו. לספק ג'לי סטרילי ומזון מוקרן בתחתית הכלוב עבור העכברים לצרוך.

4. אימות יצירת פיסטולה אורונזאלית

הערה: ההצלחה של יצירת פיסטולה oronasal (ONF) מוערכת ביום השביעי לאחר ההליך הכירורגי.

  1. הכינו את הציוד הכירורגי הדרוש: גומייה, סרט הדבקה, מזרקים, וילונות כירורגיים, כפפות לטקס, יריעות סטריליות, רדיד מתכת סטרילי וקרש קצף.
  2. יש ללבוש וילונות כירורגיים וכפפות סטריליות כדי לשמור על תנאים אספטיים. יש לחטא את לוח הקצף, מקור האור ומכשיר תחזוקת הטמפרטורה באלכוהול.
  3. יש לגרום להרדמה כללית על ידי הזרקה תוך צפקית של Zoletil50 (80 מ"ג/ק"ג). חכו עד שלא תהיה תגובה של צביטת אצבע. השתמש באותה שיטה כמתואר בשלב 2.1.3 ו- 2.1.4 כדי לשתק את העכבר ולחשוף את החיך הקשה.
  4. בצעו אימות אנטומי מבני על-ידי כך שתבטיחו שהמחיצה עדיין נראית לעין באתר הפצע, מה שמעיד על יצירת ONF מוצלחת (איור 4A,B).
  5. ביצוע אימות פונקציונלי: סגור את חלל הפה של העכבר והזריק מים סטריליים לחלל הפה שלו באמצעות מזרק סטרילי. היצירה המוצלחת של ONF מאושרת כאשר נוזל זורם מנחיריו של העכבר.
  6. הניחו את העכבר על מכשיר שמירת הטמפרטורה (37°C) עד שהוא חוזר להכרה מלאה. סובבו את העכברים כל 10-15 דקות כדי למנוע איגום דם או קריסה של אונות ריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את ההיתכנות והיציבות של שיטה ניסיונית זו, בוצע אותו הליך על עשרה עכברים, ונעשו תצפיות לגבי תמותה, שינויים בגודל הפצע, משקל הגוף וניתוח היסטולוגי. העכברים הומתו ביום השביעי.

ההליך הציג שיעור תמותה נמוך. הצריבה האופטלמולוגית והנביט, המתוארים באיור 1A-C, היו מכשירי המפתח שבהם נעשה שימוש בניסוי הזה. מודל ONF נוצר על פי הפרוטוקול שסופק. מבין עשרת העכברים שנותחו, רק אחד פג ביום השביעי שלאחר הניתוח. שיעור התמותה הכולל לאורך הנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חוקרים חקרו חומרים שונים, תרופות וטכניקות חדשניות לטיפול ב- ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. עם התקדמות בהליכים כירורגיים, השכיחות וההישנות של ONF הופחתו. עם זאת, בשל המאפיינים הייחודיים של המחלה, מספר חולי ONF במרפאה מוגבל, מה שמחייב מודל סטנדרטי לחקר טיפולים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח, בית החולים לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (RD-02-202107), תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2022NSFSC0743), ומענק הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסצ'ואן (TB2022005) לה. הואנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופיה אלקטרוניתשל נביטה66118-20ציוד חימום וחיטוי
כפפות לטקסAllmedאו אורות דומים
OlympusA1813
MeloxicamMedChemExpressHY-B0261כתוש; 5 מ"ג/ק"ג
מכשירים מיקרוכירורגיים (מספריים ופינצטה)ג'יאנגסו Tonghui Medical Devices Co.M-Y-0087מכשיר כירורגי
צריבה אופטלמולוגיתSuqian Wenchong ציוד רפואי ושות '1.00234E+13מכשיר כירורגי
כותנה סטרילית,Yancheng Begu Technology Co.או
רדיד מתכת סטריליBiosharpאו
יריעות סטריליות3MXH003801129או
וילונות כירורגייםYancheng Begu Technology Co.או מזרקים דומים
Yancheng Begu Technology Co.S-015301או קלטת דומה
Bkmamlabאו
מכשיר דומה לתחזוקת טמפרטורהמכשיר הרווארד LE-13-2104
Zoletil50Virbac80 מ"ג/ק"ג
מדעי   דומה דומות דומים

מקורות

  1. Alonso, V., et al. Three-layered repair with a collagen membrane and a mucosal rotational flap reinforced with fibrine for palatal fistula closure in children. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 127, 109679(2019).
  2. Garg, R., Shah, S., Uppal, S., Mittal, R. K. A statistical analysis of incidence, etiology, and management of palatal fistula. National Journal of Maxillofacial Surgery. 10 (1), 43-46 (2019).
  3. Mahajan, R. K., Kaur, A., Singh, S. M., Kumar, P. A retrospective analysis of incidence and management of palatal fistula. Indian Journal of Plastic Surgery. 51 (3), 298-305 (2018).
  4. Huang, H., et al. Validation of the Chinese Velopharyngeal Insufficiency Effects on Life Outcomes Instrument. Laryngoscope. 129 (11), E395-E401 (2019).
  5. Sakran, K. A., et al. Evaluation of Postoperative Outcomes in Two Cleft Palate Repair Techniques without Relaxing Incisions. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2023).
  6. Sakran, K. A., et al. Evaluation of late cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. Journal of Stomatology, Oral and Maxillofacial Surgery. 124 (4), 101403(2023).
  7. Sakran, K. A., et al. The Sommerlad-Furlow modified palatoplasty technique: postoperative complications and implicating factors. Laryngoscope. 133 (4), 822-829 (2023).
  8. Sakran, K. A., et al. Early cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. , (2022).
  9. Chen, J., Yang, R., Shi, B., Xu, Y., Huang, H. Obturator manufacturing for oronasal fistula after cleft palate repair: a review from handicraft to the application of digital techniques. Journal of Functional Biomaterials. 13 (4), 251(2022).
  10. Yussif, N., Wagih, R., Selim, K. Propylene mesh versus acrylic resin stent for palatal wound protection following free gingival graft harvesting: a short-term pilot randomized clinical trial. BMC Oral Health. 21 (1), 208(2021).
  11. Miron, R. J., et al. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (1), 83-99 (2017).
  12. Ballestas, S. A., et al. Improving hard palate wound healing using immune modulatory autotherapies. Acta Biomaterialia. 91, 209-219 (2019).
  13. Ferreira, C. L., et al. Electrical stimulation enhances early palatal wound healing in mice. Archives of Oral Biology. 122, 105028(2021).
  14. Lindley, L. E., Stojadinovic, O., Pastar, I., Tomic-Canic, M. Biology and Biomarkers for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 18s-28s (2016).
  15. Xu, Y., et al. Rapid Additive Manufacturing of a Superlight Obturator for Large Oronasal Fistula in Pediatric Patient. Laryngoscope. 133 (6), 1507-1512 (2022).
  16. Leenstra, T. S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. The healing process of palatal tissues after palatal surgery with and without implantation of membranes: an experimental study in dogs. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 9 (5), 249-255 (1998).
  17. In de Braekt, M. M., van Alphen, F. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. Wound healing and wound contraction after palatal surgery and implantation of poly-(L-lactic) acid membranes in beagle dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 50 (4), 359-365 (1992).
  18. Suragimath, G., Krishnaprasad, K. R., Moogla, S., Sridhara, S. U., Raju, S. Effect of carbonated drink on excisional palatal wound healing: A study on Wistar rats. Indian Journal of Dental Research. 21 (3), 330-333 (2010).
  19. Zhu, T., Park, H. C., Son, K. M., Yang, H. -C. Effects of dimethyloxalylglycine on wound healing of palatal mucosa in a rat model. BMC Oral Health. 15 (1), 60(2015).
  20. Kirschner, R. E., et al. Repair of oronasal fistulae with acellular dermal matrices. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 1431-1440 (2006).
  21. Rohleder, N. H., et al. Repair of oronasal fistulae by interposition of multilayered amniotic membrane allograft. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 172-181 (2013).
  22. Kesting, M. R., et al. Repair of oronasal fistulas with human amniotic membrane in minipigs. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 131-135 (2010).
  23. Ayvazyan, A., et al. Collagen-gelatin scaffold impregnated with bFGF accelerates palatal wound healing of palatal mucosa in dogs. Journal of Surgical Research. 171 (2), e247-e257 (2011).
  24. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  25. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
  26. Shan, L., Flavell, R. A., Herndler-Brandstetter, D. Development of humanized mouse models for studying human NK cells in health and disease. Methods in Molecular Biology. 2463, 53-66 (2022).
  27. Keswani, S. G., et al. Role of salivary vascular endothelial growth factor (VEGF) in palatal mucosal wound healing. Wound Repair and Regeneration. 21 (4), 554-562 (2013).
  28. Amanso, A. M., et al. Local delivery of FTY720 induces neutrophil activation through chemokine signaling in an oronasal fistula model. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (2), 160-174 (2021).
  29. Antiorio, A. T. F. B., et al. Administration of meloxicam to improve the welfare of mice in research: a systematic review (2000 - 2020). Veterinary Research Communications. 46 (1), 1-8 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פגיעה בחך קשיחכויית עינייםריפוי פצעי החךפגיעה ריריתעכברי C57BL/6אנליזה היסטולוגיתתגובה דלקתיתטכניקה כירורגית
הקמת מודל עכברי פיסטולה אורונזלית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.