מאמר שיטה

מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65590

⸱

23 באוגוסט 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

במאמר זה

סיכום

מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.

תקציר

שומנים הם מגוונים מאוד, ושינויים קטנים במבנה השומנים ובהרכבם יכולים להיות בעלי השפעות עמוקות על תפקודים ביולוגיים קריטיים. תיוג איזוטופים יציבים (SIL) מציע מספר יתרונות לחקר פיזור השומנים, ניודיזציה ומטבוליזם, כמו גם סינתזת שומנים דה נובו . היישום המוצלח של טכניקת SIL דורש הסרת הפרעות ממולקולות אנדוגניות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לבדיקת שומנים SIL מדגימות ביולוגיות; יוצגו דוגמאות לזיהוי שומנים דה נובו במהלך התפתחות שחלות יתושים. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה מאפשר הפרדה והקצאת שומנים מדגימה בודדת בסריקה אחת (<1 שעות). הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים, תוך שימוש בצבירה מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. מדידת SIL ברמת שרשרת חומצות השומן מגלה שינויים בדינמיקה של שומנים במהלך התפתחות השחלה של יתושים. מבני השומנים דה נובו מוקצים בביטחון בהתבסס על זמן השמירה שלהם, ניידות ודפוס הפיצול שלהם.

מבוא

בעת ניתוח נתוני שומנים, תיוג איזוטופים יציבים (SIL) הוא שיטה יעילה להערכת מסלולים מטבוליים באורגניזמים חיים. בשיטה זו, אטומים בתוך אנליט מוחלפים על ידי איזוטופים יציבים המכילים 13C או 2H. איזוטופים אלה משולבים עוד יותר בקודמנים, אשר מוטמעים מאוחר יותר בתוך חומצות השומן, ומסמנים את האזורים שבהם הם שוכנים. עם איזוטופים אלה, ניתן לזהות את התפלגות ומטבוליזם של שומנים, כפי שהם יהיו בניגוד לרקע ללא תווית1. פלטפורמות ספקטרומטריית מסות נפוצות אינן מסוגלות להבחין בין האות המגיע ממולקולות אנדוגניות2. ההצלחה של SIL דורשת שימוש בכלים אנליטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד. כרומטוגרפיה נוזלית המצומדת לספקטרומטריית ניידות יונים לכודים ברזולוציה גבוהה-צבירה מקבילית, ספקטרומטריית מסה טנדם רציפה של פיצול רציף-זמן-טיסה (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) מאפשרת הפרדה בין מינים מסומנים ללא מסומנים2. היתרון של ניתוח LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS הוא שניתן לסנן את אות הטרשת הנפוצה לפי זמן השמירה (RT) והניידות, ובכך להפחית הפרעות פוטנציאליות של מולקולות אנדוגניות, כמו גם כימות והפרדה של כל המינים הרצויים2. ב-TIMS, יון מוחזק תחילה במצב נייח כנגד פאזה ניידת גז ולאחר מכן משוחרר בהתאם לניידות שלו. זה מספק ניידות ברזולוציה גבוהה תוך פעולה במתח נמוך יותר מאשר מכשור IMS מוקדם יותר3. מובילוגרמות הן חלקות של מסה לטעינה לעומת זמן סחף שניתן להשתמש בהן כדי להבחין בין תרכובות בהתבסס על זמן הסחף שלהן וכמות החפיפה שלהן4.

על ידי שימוש בטכניקת PASEF נוספת, מהירות הרצף גדלה מאוד מבלי להקריב את רגישות5. תאוריית PASEF כוללת הצטברות של יונים ואחריה שחרורם הרציף לפי סדר ניידותם. זה נעשה על ידי צבירת יונים ביישור מקביל לניידות שלהם. ההצטברות באופן זה מונעת אובדן יונים. יתר על כן, בחירת היונים המקדימים מתרחשת בו זמנית עם הצטברות ושחרור היונים. בשיטה זו, PASEF בוחר מבשרי סדרה מרובים במהלך כל סריקת TIMS, במקום קודמנים בודדים לכל סריקה האופייניים למכשיר TIMS שאינו משתמש ב- PASEF. כאשר היונים המקדימים מצטברים בו זמנית ומשוחררים בפסגות של 2 אלפיות השנייה בסריקת TIMS של כ-100 מילישניות לפריים, האות מוגבר ביותר מסדר גודל אחד, ובכך מגדיל את יחס האות לרעש3. תוספת PASEF ל- TIMS מגבירה את היעילות של MS/MS. מכיוון ש-TIMS-PASEF משולב עם MS/MS, פיצול יעיל יותר אפשרי. שלא כמו זיהוי MS/MS קונבנציונלי, האות המקדים נדחס מה-TIMS-PASEF, ויוני השבר מזוהים בו זמנית לזמן האלוציה של TIMS ולמיקום ניידות היונים של קודמן3.

בעת רכישת נתונים מספקטרומטר מסות, ישנן אפשרויות במצב הסריקה הרצוי. רכישה תלוית נתונים (DDA) בוחרת יונים מקדימים מסריקת MS1 בהתבסס על השפע שלהם, לפני פיצול שלהם וביצוע סריקת MS2. מצב סריקה זה מקטעים כמה שיותר סימנים מקדימים. גישת DDA ממוקדת, והתוצאות יהיו תלויות בבחירת היונים3. עם זאת, DDA-PASEF לעתים קרובות יש בעיות ביכולת השחזור בין משכפלים. בעוד DDA הוא כלי נהדר בניתוח ממוקד, תערובות מורכבות יש קושי גדול יותר ברכישת הנתונים שלהם6. הסיבה לכך היא שרק כמות קטנה של יונים ניתן לנטר בו זמנית3. רכישה עצמאית של נתונים (DIA) היא שיטה שבה חלונות m/z שנבחרו מראש מפוצלים בנפרד מעוצמתם, וכולם נסרקים בטווח7. במצב סריקה זה, ענני יונים שלמים משודרים מה-IMS לספקטרומטר המסות3. במחקרי פרוטאומיקה התוצאה היא שכמויות גדולות יותר של חלבונים מכומתות בטווח זמן קצר יותר בהשוואה ל-DDA. בנוסף, DIA מחמיץ פחות ערכי m/z בהשוואה ל- DDA. לכן, חלופה זו הראתה שיפורים גדולים ביכולת שחזור הנתונים ביחס אות לרעש וכימות טוב יותר מאשר DDA. בעבודה הנוכחית מטרתנו היא ליישם DIA בשיטה שדווחה על ידי Tose et al.2. שיפרנו את יכולת השחזור והעוצמה של אותות, והפקנו מידע נוסף וחד משמעי יותר על ניוד, הפצה ומטבוליזם של שומנים ב-SIL בדגימות ביולוגיות תוך ניצול רכישת DDA ו-DIA.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. נתיחת חרקים
    1. לנתח שחלות יתוש Aedes aegypti כאשר הם בני 7 ימים בתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים.
    2. לאסוף שמונה שחלות מתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C.
    3. לאסוף שחלות בשכפולים ביולוגיים.
  2. מיצוי שומנים
    1. הוסף 10 μL של תקן פנימי (ISTD) לשמונה השחלות שנאספו בריכוז של 1 ppm. ISTD היא תערובת שומנים מסומנת עם שבעה דאוטריום של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine-D7 (15: 0-18:1 (D7) PC), lysophosphatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), cholesteryl oleate-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
    2. יש להמתין עד לייבוש בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של butanol/מתנול ו 3 μL של hydroxytoluene butylated. הומוגניזציה ידנית במשך 10 שניות עם 1.5 מ"ל פוליפרופילן מזיקים.
    3. שטפו את המזיק עם 200 מיקרוליטר בוטנול/מתנול ושלבו עם התמיסה ההומוגנית.
    4. הפעל את צינור המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ובעוצמה בינונית למשך 30 דקות.
    5. צינורות צנטריפוגה ב 1600 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון דוגמים אוטומטי עם 300 מיקרוליטר של תוספות זכוכית סילניות.

2. הגדרת מכשירים

  1. הכנת שלב המובייל
    1. הכן שלב נייד עם הרכב של 30:40:30 (שלב נייד A) ו- 10:5:85 (שלב B נייד) באמצעות אצטוניטריל, מים ואיזופרופנול כיחס המתאים. בשני השלבים הניידים, הוסף פורמט אמוניום 10 mmol / L במים ו- 0.1% חומצה פורמית כדי ליצור מצב חיץ.
    2. שוקלים 3.15 גרם של פורמט אמוניום ב 10 מ"ל של מים. הוסף 500 μL של פתרון זה ב 12.5 מ"ל של מים. ברצף, לשים לתוך בקבוק נפח 250 מ"ל ולמלא isopropanol על 2/3 של הצלוחית. מערבבים על ידי ערבול.
    3. מוסיפים 250 מיקרוליטר חומצה פורמית (85%), ממלאים ב-25 מ"ל אצטוניטריל ואיזופרופנול לקו מילוי של 250 מ"ל, ומערבבים.
  2. במערכת MS, בצד שמאל של המסך בהגדרות MS, קבע את טווח המסה על ידי בחירת 50 כמינימום ו- 1850 כהגדרת הסריקה המקסימלית.
    1. בחר Polarity כמצב יונים חיובי. בחר במצב סריקה כ - DIA-PASEF. לשם כך, בחר כוונון ושיטת ניתוח פתוחה משיטת DDA קודמת עם פרמטרי LC הבאים.
      1. להפרדת מעבר צבע:
        הזרקת דגימה: 0% B, זמן המתנה 1 דקה.
        להגדיל ל-55% B, להחזיק עד 6.4 דקות.
        להגדיל ל-65% B, להחזיק עד 24 דקות.
        להגדיל ל 88% B, להחזיק עד 40.8 דקות.
        להגדיל ל-95% B, להחזיק עד 48.1 דקות.
        מנמיכים ל-35% B, מחזיקים עד 56 דקות.
        הפחיתו ל-0% B, החזיקו עד 60 דקות.
      2. עבור תנאי HPLC:
        נפח הזרקה: 5 μL
        קצב ממס: 0.25 מ"ל/דקה
        זמן פעולה כולל: 60 דקות, בהן 5 דקות הן להתנות מראש את העמודה.
      3. הכן את הכרומטוגרף הנוזלי על ידי הכנסת העמודה לכרומטוגרף הנוזלי. הפעל ריק כדי לנקות את העמודה ולבדוק אם יש נזילות. ניתן לראות זאת בכך שהמכשיר אינו מחזיק לחץ או זרימה.
  3. כדי ליצור שיטה חדשה, בצע את השלבים המתוארים להלן (תרשים 1 ו תרשים 2).
    1. פתח את התוכנה ולחץ על חבר את כל המכשירים. אם החיבור מצליח, מערכת LC תצפצף פעם אחת, ומסך הבקרה מפרט את HyStar בתיבה מצב ללא הודעות שגיאה.
    2. לחץ על הכרטיסייה רכישה . ב- Sample Table Navigator, אתר את התפריט הנפתח Tag ובחר שיטה קודמת.
    3. הכפילו את טבלת הדוגמאות העדכנית ביותר. לחץ על שמירה בשם... ושמור רשימה חדשה לדוגמה עם הפורמט: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) כאשר (XXXX) הוא תיאור קצר של הניתוח.
    4. לחצו לחיצה ימנית על שיטת ההפרדה ולחצו על עריכת שיטה. לחץ על ערוך שיטת מודול.
    5. לחץ על הורד. אם תצליח, ההורדה הצליחה תופיע. סגור את המסך ללא שיטת שמירה.
    6. תחת הגדרות MS עבור אל הגדרות TIMS, בחר את 1/k0 להתחיל ב- 0.70 ו- 1/k0 להסתיים ב- 1.85. הגדר את זמן הרמפה ל- 150 אלפיות השנייה. עם זאת, מחזור העבודה ואת קצב הרמפה מותאמים באופן אוטומטי.
    7. בחלון התחתון, בחר בכרטיסיה מקור . בחר את סוג המקור כ - ESI והגדר את הסטת לוח הקצה ל- 800 V ואת הנימים ל- 4500 V. סמן את תיבת הנבולייזר והגדר את הלחץ ל- 4.0 בר. כוונו את הגז היבש ל-4.0 ליטר/דקה ואת הטמפרטורה היבשה ל-250°C.
    8. משמאל לכרטיסיית המקור, בחר בכרטיסיה כוונון. לחץ על הכרטיסיה משנה כללית ותחת כותרת ההעברה ודא את הפרמטרים הבאים:
      סטייה 1 דלתא: 70 V
      משפך 1 RF: 250 vpp
      אנרגיית isCID: 0 eV
      משפך 2 RF: 250 vpp
      RF רב-קוטבי: 500 vpp.
      1. תחת הכותרת תא התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים:
        אנרגיית התנגשות: 6.0 eV
        התנגשות RF: 1200 vpp.
      2. תחת הכותרת quadrupole ודא את הפרמטרים הבאים:
        אנרגיית יונים: 6 eV
        משקל נמוך: 250 m/z.
      3. תחת הכרטיסייה מיקוד טרום TOF ודא את הפרמטרים הבאים:
        זמן העברה: 45 μs
        אחסון טרום פולס: 5.0 μs.
    9. לחץ על הכרטיסיה משנה עיבוד . תחת גילוי שיא ספקטרום מסה ודא את הפרמטרים הבאים:
      סף מוחלט: 667
      סף מוחלט (לכל 100 אלפיות השנייה AccuTime): 445.
      1. תחת זיהוי שיא ניידות ודא את הפרמטרים הבאים:
        סף מוחלט: 30.00.
    10. לחץ על כרטיסיית המשנה TIMS . תחת הכרטיסייה קיזוזים, ודא את הפרמטרים הבאים:
      Δt1: -20 V
      Δt2: -150 V
      Δt3: 70 V
      Δt4: 150 V
      Δt5: 0 V
      Δt6: 150 V
      תא התנגשות: 300 V.
    11. משמאל לכרטיסיית הכוונון, לחץ על הכרטיסיה MS/MS . תחת הכרטיסייה יונים מקדימים, ודא את הפרמטרים הבאים:
      מספר רמפות PASEF: 8
      מינימום טעינה: 1
      טעינה מקסימלית:1.
      1. תחת הכרטיסיה תזמון, לחץ על מתקדם וודא את הפרמטרים הבאים:
        עוצמות: 0,1500, 5000, 10000
        חזרות: 1, 10, 5, 1
        סף עצימות: 1500.
      2. תחת הכרטיסייה אי-הכללה פעילה, ודא את הפרמטרים הבאים:
        סימן ביקורת פעיל של אי-הכללה
        שחרור אחרי: 0.4 דקות
      3. תחת הגדרות אנרגיית התנגשות ודא את הפרמטרים הבאים:
        K0 (V-s/cm3): 0.70, 1.60
        אנרגיית התנגשות (eV): 20.00, 35.00.
      4. תחת הגדרות רוחב בידוד ודא את הפרמטרים הבאים:
        מסה (m/z): 622, 1222
        רוחב (m/z): 1.00 2.50.
    12. הגדרת DIA -PASEF: בחר DIA-PASEF ממצב סריקת הגדרות MS בצד שמאל. תחת הכרטיסיה MS/MS, בחר Window Editor. כאן, ודא את הפרמטרים הבאים (איור 3):
      הגדרות חלון: רוחב מסה: 50 Da; חפיפה המונית: 0.0 Da; חישוב מצולע: צעדים המוניים; מספר חלונות ניידות: 1.

3. כיול

  1. כיול מכשירים (איור 4)
    1. תחת הכרטיסייה משנה כיול לחץ על m/z, בחר Tuning Mix מתיבת השחרור ולחץ כיול בפינה השמאלית התחתונה.
    2. המשך ללחוץ על כיול עד להשגת ציון של 100%.
    3. כעת בחר בכרטיסיה ניידות ובצע את אותם השלבים שתוארו לעיל עד שתגיע לציון הכיול של 100%.
  2. עקומת כיול
    1. ספייק תערובת סטנדרטית פנימית של שומנים עם 10 μL של תערובת סטנדרטית פנימית מפורקת.
      השתמש בשבע נקודות כיול מ- 0.1-500 ננוגרם/מ"ל של תערובת סטנדרטית עם 10 מיקרוליטר של התערובת הסטנדרטית הפנימית המפורקת.
    2. הוסף ביאורים ידניים לשרשראות חומצות השומן המבוססות על תבניות PASEF MS/MS שכבר תוארוב-2.
  3. יעילות התוויה SIL
    1. חשב את היחס בין שטח האיזוטופים המכילים SIL לשטח האיזוטופים שאינם מכילים SIL.
    2. חישוב הטפיחה התיאורטית על ידי קביעת ההסתברות למצוא אטום מסומן בכל אתר.
    3. חישוב העשרת SIL על ידי התאמת פרופילי האיזוטופים הניסיוניים לתבנית התיאורטית המדומה בתוכנת ניתוח נתונים.
  4. התחלת הריצה
    1. הפעל תנור עמודים על ידי לחיצה על כפתור המדחום . הפעל משאבות על ידי לחיצה על כפתור שסתום .
    2. הגדר את שיטת MS לשיטה שנשמרה קודם לכן. ודא שנפח ההזרקה הוא 5 μL ושקו 1 יכוון לבקבוקון 20:1.
    3. ודא שבקבוקון 20:1 מכיל 50% IPA/ACN. שמור רשימה לדוגמה.
    4. התחל רצף וודא שבוצעה הזרקה מוצלחת (אושר על ידי הודעה המוצגת במערכת המציינת מוזרק).
    5. העתק את שורה 1 והדבק למטה כדי ליצור שורה חדשה. אכלס את קו 2 בדגימות בהתאם לניסוי הנוכחי. ודא שנעשה שימוש במיקום הנכון בדוגם האוטומטי.
    6. אם השלב הנייד טרי, בצע תחילה בדיקת צורת שיא על ידי הזרקת תקני תערובת השומנים מהיצרן. השווה עם תוצאות קודמות. 2 התקנים הם תערובת שומנים של 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (15: 0-18: 1 PC), lysophosphatidylcholine (18: 1 Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamine (15: 0-18: 1 PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18: 1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (15: 0-18: 1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (15: 0-18: 1 PS), 1,2- dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), cholesteryl oleate (18: 1 Chol Ester).
    7. ודא שלקווים חדשים יש את שיטת ההפרדה הנכונה ולא את שיטת ההתניה מראש הנהוגה בשורה 1. ודא כי שיטת MS נכונה (השיטה של היום הנוכחי).
    8. ודא ששיטת העיבוד הנכונה נטענת ושהאפשרות הפעל תהליך אוטומטי מופעלת.
    9. שמור רשימה לדוגמה כדי לוודא שדוגמאות ינותחו לאחר סיום ההפעלה הנוכחית.

4. ניתוח נתונים

  1. תוכנה פתוחה לניתוח נתונים (איור 5). בפינה השמאלית העליונה לחץ על קובץ כפתור ובחר פתח ...
  2. בחר את הקבצים הנבחרים. לחץ לחיצה ימנית על שם הקובץ ובחר מאפיינים.
    1. בחר מצב כיול (איור 6). בתיבה הנפתחת, בחר כיול ראשוני עבור ספקטרומטר המסות. ודא שכל השגיאות קטנות מ- 1 עמודים לדקה.
    2. לאחר מכן, בחר כיול ניידות ראשוני ואשר שהשגיאה קטנה מ- 1 עמודים לדקה.
    3. לחץ לחיצה ימנית על כרומטוגרמה ובחר ערוך כרומטוגרמה (איור 6C). תחת סוג, לחץ על התיבה הנפתחת ובחר כרומטוגרמה של יונים שחולצו (איור 6D). תחת סינון, בחר כל MS ובמצב סריקה בחר הכל. זאת כדי לראות את הפסגות של המולקולה המעניינת ולא רק את השברים שלה.
      1. מתחת לזה, יש שתי אפשרויות סינון לבחירת מולקולות: מסות או נוסחה. אם בוחרים מסות , אפשר לבחור את ה-m/z התיאורטי של המולקולות המעניינות. במקרה זה, בחר 829.7985 m/z. אם נבחרה פורמולה , ניתן לבחור את הנוסחה עבור המולקולה, כמו גם את צורות היונים המעניינות את הכרומטוגרמה. במקרה זה, בחר אמוניום [M+NH4]. הסיבה לכך היא חיץ האמוניום בשלב הנייד שיעדיף יינון בצורת יונים זו (איור 7).
      2. בתיבה width, בחר ±1. עבור קוטביות להבטיח כי הוא שומר על מצב חיובי. תחת ניידות, בחר 1.455-1.465. זה נעשה כדי לסנן את כל המולקולות שאינן נופלות בתוך ערכים אלה ולבודד את המולקולה של עניין.
  3. לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.
  4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קו הבסיס בתחילת שיא העניין וגרור תוך כדי החזקה לסוף הפסגה. אינטגרציה ידנית זו תספק ספקטרום מסה חי של מקטעים בתוך זמן שמירה זה.
  5. מובילוגרמה
    1. לחץ לחיצה ימנית בצד שמאל של המסך ב - Mobilogram ובחר Edit Mobilogram (איור 8). יופיע חלון בשם Edit Mobilogram Traces. בצעו את אותם השלבים C.e.i.1 עד C.e.i.5 (איור 9).
    2. בזמן השמירה הזן את זמן השמירה של שיא הריבית. במקרה זה, 37.45-37.55 דקות.
    3. לאחר בחירת הפרמטרים, לחץ על הוסף > אישור בפינה השמאלית העליונה. לאחר פרק זמן קצר, התוכנה תעבד את הבחירות ותפיק כרומטוגרמה.
  6. עבור יונים שחולצו, חזור על שלבים 4.2.3.1-4.3.2.2 עד ליצירת רשימה של יונים.
  7. בחלק התחתון של חלון MS, בחר פרופיל MS ו פרגמנט MS. זה יאפשר מבט ספקטרום של יונים מסריקה מלאה ו- PASEF.
    1. בתצוגת ספקטרום, לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק ספקטרום מורכב. בעזרת נתוני הספקטרום המופיעים מימין, ניתן למצוא מידע נוסף על התרכובת כגון רזולוציה המספקת עוצמה, עוצמה ויחס אות לרעש (S/N; איור 10).
  8. עיבוד
    1. כדי לעבד את הנתונים, שלבו ידנית את שיאי הכרומטוגרמה והניידות כדי להפיק מידע רב ערך על המולקולה המעניינת (איור 10).
    2. לחץ לחיצה ימנית על חפש ובחר שלב רק כרומטוגרמה או ניידות (איור 11). לחץ לחיצה שמאלית וסמן את הפסגה הרצויה. מידע זה כולל זמן שמירה, אזור, S/N וניידות.

תוצאות

תיוג האיזוטופ היציב מאפשר הדמיה של טריגליצרידים במחקרי דינמיקת שומנים של שחלות יתושים נקבות. בתחום הניידות הדו-ממדית, הטריגליצרידים 48:1 מוצגים באזור עם זמן שמירה ספציפי ביחס לניידות 1/K0. את עוצמת הטריגליצרידים ניתן לדמיין על ידי קו כחול כהה יותר. כתמים אחרים מייצגים טריגליצרידים נוספים הנמצאים בתוך השחלה. זמני השמירה והניידות משתנים בשל ההבדלים במסות ובמבנים, ולכן מופיעים באזורים שונים בגרף. ההבדלים האלה הם המפתח כאשר מבחינים בין טריגליצרידים בדגימה (איור 12A,B). היטל ספקטרום המסה המוגבר של האזור מציג יון טריגליצרידים 48:1 המחובר ליון אמוניום במהירות 822 m/z. טריגליצרידים אחרים, כמו למשל 50:2 ו-52:3, מוצגים גם הם, אבל באזורי m/z גבוהים יותר בגלל ההבדלים במבנה, בגודל ובפיצול (איור 12C,D). בדוגמה זו התעניינו בניתוח האיזוטופים המסומנים בדאוטריום. האזור של TG 48:1 הוגבר עוד יותר כדי להמחיש את היונים המסומנים איזוטופית. ככל שכמות הדאוטריום על היון גדלה, עוצמת השיא יורדת. זה קורה מכיוון שיש מופעים נמוכים יותר של היונים המסומנים בדאוטריום גבוה. יחס m/z עולה מעט עם כל תוספת של דאוטריום עקב עלייה במסה. עוצמות אלה יקבעו עוד יותר את הכמות של כל איזוטופ הקיים בדגימה.

כאשר מעריכים את העוצמות של המקטעים בספקטרום המסות, יש להשוות את האיזוטופים שאינם מסומנים עם אלה המסומנים ב-2H(איור 12E). בכחול היא העוצמה הלא מסומנת עם הקווים השחורים המקווקווים כעוצמות תיאורטיות. באדום, התוצאות המסומנות באיזוטופ נצפות. הם מציגים עוצמות גדולות יותר הן מהעוצמות הלא מתויגות והן מהעוצמות התיאורטיות. העשרת המין בתיוג איזוטופי מניבה עוצמה גבוהה יותר מהמינים התיאורטיים שאינם מסומנים. העוצמות הגדולות יותר מאפשרות הדמיה של הטריגליצרידים בשל הפערים המחוזיים. הפיצול ממלא גם תפקיד מפתח בזיהוי שומנים, שכן PASEF יספק פיצול מוגבר בהשוואה לסריקה מלאה של MS/MS. הסיבה לכך היא שחומצות השומן בשרשראות השומנים עשויות להתפרק בדפוסים שונים, ולכן הקווים בספקטרום מראים את עוצמת המקטעים בהתבסס על תהליך הפיצול של הטריגליצרידים (איור 12F). זה מספק מידע מבני על חומצת השומן ומסייע לקבוע איזה איזומר של מין קיים. בעת ניתוח נתונים משיטת DIA, מספר המקטעים יגדל, ולכן התוצאה תהיה סריקת MS/MS טובה יותר וזיהוי טוב יותר מאשר בשיטת DDA טיפוסית.

figure-results-1
איור 1: מסך בית טיפוסי של התוכנה. מסך הבית מאפשר יצירת שיטה והפעלת המכשיר. (A) מסך תוכנה המכיל הגדרות בקרת TIMS ו-MS/MS. בתחתית המסך נמצאת כרטיסיית המקור לעריכת פקדים אלה במכשיר. (B) מסך תוכנה עם כרטיסיית המנגינה פתוחה. (ג) כאן אפשר להכין את הכלי למנגינה כללית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מסך תוכנה עם כרטיסיית המנגינה פתוחה. כאן ניתן לערוך את הפרמטרים של מנגינה עיבוד. (A) מסך תוכנה עם כרטיסיית המנגינה פתוחה. כאן ניתן לערוך את פרמטרי המנגינה עבור חלק ה- TIMS של הכלי. (B) מסך תוכנה עם בחירת הכרטיסייה MS/MS בתחתית המסך. (C) כאן ניתן לערוך פרמטרים עבור ספקטרומטר המסות הדו-צדדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מסך לבחירת רוחב חלונות DIA-PASEF. כאן ניתן לערוך את הצבעים לשפע, כמו גם לערוך את גודל החלונות לרכישת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: כיול ספקטרומטר המסות לפי יחס מסה למטען (m/z). רשימת ההפניות נבחרת עבור הכיול. (A) בפינה השמאלית התחתונה, לוחצים על לחצן כיול עד שמופיע ערך קביל. כיול ספקטרומטר ניידות היונים על ידי ניידות. רשימת ההפניות נבחרת עבור הכיול. (B) בפינה השמאלית התחתונה, לוחצים על לחצן כיול עד שמופיע ערך קביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מסך בית טיפוסי עבור תוכנת ניתוח הנתונים. כדי לפתוח קובץ, לוחצים על הלחצן השמאלי העליון קובץ כדי שתיבת השחרור עם אפשרויות יופיעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: תוכנה לניתוח נתונים. מסך התוכנה המאשר כיול מוצלח עם (A) כיצד לבחור תוצאות כיול ו-(B) בחירת קטגוריית הכיול. (C) בחירת כרומטוגרמה לניתוח ו-(D) בחירת כרומטוגרמה של יונים שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: מסך מוקפץ. חלון מוקפץ לבחירה וחילוץ של כרומטוגרמת יונים על-ידי מסנן מסה (A) ומסנן נוסחאות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: תוכנה לניתוח נתונים. מסך התוכנה שבו בצד שמאל, mobilogram נבחר לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: מסך קופץ עבור מובילוגרמה. חלון מוקפץ לבחירת ניידוגרמה של יונים שחולצו על-ידי מסנן מסה (A) ומסנן נוסחאות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 10: מסך ניתוח נתונים. (א) מסך התוכנה; מודגש משמאל ניתן ליצור רשימת יונים שחולצו. (B) מסך ניתוח נתונים שבו בתחתית מוכן ספקטרום מורכב מהיונים שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 11: מסך ניתוח נתונים. מסך התוכנה מדגים את התוצאות של אינטגרציה ידנית של ספקטרום מורכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 12: תוצאת LC-TIMS MS. (A) ניתן לראות את ה- LC-TIMS MS ב- 4 ימים לאחר האכלת דיאטתסוכרוז 2 H ושחלות החרקים בתחום הניידות הדו-ממדית. (B) הקרנות MS אופייניות עבור האות המתאים ל-TG 48:1, TG 50:2 ו-TG 52:3 מהדגימה המסומנת. (C) אזור MS מוגבר 822 - 827 m/z המציין פרופיל TGs מסומן. (D) שימו לב במיוחד לכך שפסגות טרשת נפוצה באדום מוגברות פרופיל האיזוטופים. (ה-ו) פרופיל האיזוטופ המסומן ב-2H מסומן באדום; מתחת לפרופיל איזוטופ שאינו מסומן מסומנים בכחול. פרופילי האיזוטופים התאורטיים מסומנים כקווי מקף (13C בשחור; 2H בירוק). מבנה פוטנציאלי לטריגליצרידים 48:3 מוצג גם בפינה השמאלית העליונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בעת הערכת השימוש בפרוטוקול זה, חיוני לוודא שהפרמטרים DIA-PASEF ו- MS/MS ישימים לטריגליצרידים המדוברים. באופן ספציפי, חלונות ניידות רוחב החלון צריך לעקוב אחר דפוס של טריגליצרידים. ניתן לקבוע זאת באמצעות הפעלה קודמת בשיטת DDA. בעת מעקב אחר הטריגליצרידים בתקן הפנימי, החלונות להגדרת DIA צריכים לכסות את כל המולקולות המזוהות מראש המעניינות. כל החלונות צריכים להיות בגדלים שווים, והטווחים נמצאים בתוך m/z ו-1/k0 של התרכובות הרצויות (איור 7). עם גודל שגוי של החלונות, היונים שיש להפריד ידלגו עליהם וספקטרום היבול יהיה בעל יכולת שחזור נמוכה יותר. בעיקרו של דבר, ללא אופטימיזציה נכונה של טווח חלונות בליפידומיה, תוצאות DIA לא ישפרו את נתוני ה- DDA. החלונות צריכים לייצג צורה מדורגת עבור תהליך רכישת הנתונים. אם זה לא המקרה, יש לשנות את הפרמטרים בחלון DIA-PASEF שהוגדר כך שייצגו את פרופיל השומנים המלא. ללא שלב זה, חומצות שומן קריטיות יושמטו מהנתונים שנרכשו.

מגבלות אינסטרומנטליות כוללות בעיקר את אלה שמגיעות עם שיטות LC-MS. זה כולל מגבלות ריבוב ברוחב שיא. לכן, חייבת להיות אופטימיזציה בשיא האלוציה לכימות מתאימה, המקדמת סלקטיביות במהלך איסוף הנתונים. בדרך כלל, זה עם מבשרים נבחרים כגון עם DDA. עם זאת, עם DIA, לא נבחרים סימנים מקדימים, ולכן מסתכנים במגבלות בסלקטיביות אינסטרומנטלית8. בעוד ששיטות DIA מספקות פיצול מוגבר, עדיין קיימות מגבלות. המגבלה הבולטת ביותר היא הפחתת הסלקטיביות המבשרת. החלונות עבור שיטת DIA רחבים פי 5 עד 10 משיטת DDA טיפוסית. כתוצאה מכך, בעוד שהוא מאפשר פיצול גדול יותר, הוא יכול להפחית את מחזור העבודה ואת הרכישה הסדרתית. ניתן לראות זאת בספקטרומטרים של מסות המשתמשים בקוואדרופול מדורג. מכיוון שאין מבחר של קודמנים ואילו יונים צריכים להיות מפוצלים, חלונות בידוד סטטיים עוברים ברצף כדי לכסות את חלון m/z. מכיוון שהחלון גדול בהרבה משיטת DDA טיפוסית, יש להשתמש בטווחים רחבים יותר כדי לנסות להשיג רגישות9. לכן הבעיה ברכישה הסדרתית מפחיתה את הרגישות. מגבלה שנייה נוגעת ליצירת ספריות. זה לוקח זמן רב ודורש כמויות גדולות של דגימות כדי לגבש. בעוד שניתן להשתמש בספריות חיצוניות, דפוסי הפיצול עשויים להיות שונים בין תנאי ניסוי לבין מכשור10.

בעת ניתוח נתוני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים, יש צורך למזער הפרעות ממולקולות אחרות הנמצאות באורגניזם. זה נעשה באמצעות כלי ניתוח ברזולוציה גבוהה כגון LC-TIMS-TOF-MS/MS2. נכון לעכשיו, השימוש בכלים אלה ברזולוציה גבוהה כדי להפריד את האיזוטופים המסומנים מרעשי הרקע הוא עדיין חדשני מאוד בהשוואה לשיטות מסורתיות. שיקולים אינסטרומנטליים מסורתיים מיישמים הפרדה על ידי כרומטוגרפיית גז ואחריה יינון כימי או אלקטרונים. זה מאפשר גזירה כימית עם pentafluorobenzyl bromide או פיצול מיינון אלקטרונים. זה לאחרונה שבו LC-MS משמש מחקרים איזוטופיים. השימוש בספקטרומטרים של מסות ברזולוציה גבוהה מאפשר דיוק מסה גבוה ויכולת לבצע מולטי-נותב שנחקר על ידי שימוש בתוויות איזוטופיות מרובות ולא באיזוטופ יחיד. ללא הרזולוציה הגבוהה של המכשיר לא ניתן היה להבדיל בין דרגות תיוג שונות כגון 13C2 ו- 13C. זה מאפשר מידע רב יותר מריצה אחת בהשוואה למכשור מסורתי עם רזולוציה נמוכה יותר10.

בעוד של- DIA יש יכולת שחזור טובה יותר מאשר DDA, שיטות רכישת נתונים מתפתחות אחרות יכולות להשוות. אסטרטגיות DIA-DDA היברידיות כגון p-SMART מסוגלות לשלב את נקודות החוזק של כל שיטה כדי לשמור על זיהוי וכימות מעולים, תוך שמירה על רמה גבוהה של ניתוחים איכותיים ממוקדים. בשיטה זו, שימוש ביון מוצר תואם אחד יכול להגביר את הרגישות והסלקטיביות של DIA, מכיוון שהוא יצמצם את חלונות ה- DIA בהשוואה לגישה רחבה ולא ממוקדת8. בליפידומיה, המבנה של טריגליצרידים יכול להשתנות עם המבנה האיזומרי. PASEF מאפשר הדמיה של דפוסי פיצול שונים, שיפור זיהוי מינים2. עם השימוש ב- DIA-PASEF, הפיצול המוגבר מספק מידע על איזומרים רבים ככל הדומה לאחרים, אשר בדרך כלל אינם ניתנים לפתרון בשל מגבלות שיטת DDA. מידע זה מספק ראיות על אילו חומצות שומן נמצאות בשחלות היתושים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת במחקרי שומנים אחרים של דה נובו באורגניזמים מגוונים.

גילויים

מתיו ווילטס ומלווין א. פארק הם עובדים של Bruker Daltonics Inc, יצרנית המכשיר המסחרי timsTOF. המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

המחברים אוהבים להכיר בתרומתו של ד"ר סזאר רמירז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים. מחקר זה מומן על ידי מענקי NIAID R21AI167849 FGN, פרויקט 22-21244S מקרן המדע הצ'כית, צ'כיה למינסוטה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Data AnalysisBruker Daltonics Inc2363525870גרסה 5.2
d-גלוקוז-13C6סיגמא-אולדריץ' 
389374 שפופרות אפנדורףפישר סיינטיפיק14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
בקבוקוני זכוכיתתרמו פישר סיינטיפיק11-417-236
מים כבדים (2H2O)סיגמא-אולדריץ' 1.13366
עלי פוליפרופילןפישר סיינטיפיקBAF199230001
בולטות LC-20 CE כרומטוגרף נוזלי מהיר במיוחדShimadzuL20234651907
מוסיף זכוכית סילאניתרמו פישר סיינטיפיק03-251-826
סוכרוז-13C12סיגמא-אולדריץ' 
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
כיול תערובת כוונון סטנדרטיAgilent Technologies36
605417

מקורות

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.