Method Article

"אווטאר", ניסויי לולאת עבודה ex vivo מותאמים באמצעות מתח והפעלה in vivo

DOI:

10.3791/65610

⸱

August 18th, 2023

 , 
1Northern Arizona University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מפרט את המתודולוגיה לחיקוי ייצור כוח שריר in vivo במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo באמצעות שריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה כדי להעריך את התרומות של מעברי מתח והפעלה לתגובת כוח השריר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנהגויות תנועה הן מאפיינים מתעוררים של מערכות דינמיות הנובעות מייצור כוח שרירים ותפוקת עבודה. יחסי הגומלין בין מערכות עצביות ומכניות מתרחשים בכל רמות הארגון הביולוגי בו זמנית, החל מכוונון תכונות שרירי הרגליים בזמן הריצה ועד לדינמיקה של הגפיים המקיימות אינטראקציה עם הקרקע. הבנת התנאים שבהם בעלי חיים משנים את אסטרטגיות הבקרה העצבית שלהם לעבר מכניקת שרירים פנימית ('פרפלקסים') בהיררכיית הבקרה תאפשר למודלים של שרירים לחזות את כוח השריר in vivo ולעבוד בצורה מדויקת יותר. כדי להבין את מכניקת השרירים in vivo, נדרשת חקירה ex vivo של כוח השריר ועבודה בתנאי מתח ועומס משתנים דינמית הדומים לתנועה in vivo. מסלולי מתח in vivo מציגים בדרך כלל שינויים פתאומיים (כלומר, מעברי מתח ומהירות) הנובעים מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה. המטרה העיקרית של טכניקת ה"אווטאר" שלנו היא לחקור כיצד השרירים מתפקדים במהלך שינויים פתאומיים בקצב המתח והעומס כאשר התרומה של תכונות מכניות מהותיות לייצור כוח השריר עשויה להיות הגבוהה ביותר. בטכניקת "אווטאר", גישת לולאת העבודה המסורתית משתנה באמצעות מסלולי מתח נמדדים in vivo ואותות אלקטרומיוגרפיים (EMG) מבעלי חיים במהלך תנועות דינמיות כדי להניע את שרירי ex vivo דרך מחזורי קיצור מתיחה מרובים. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי המתח in vivo מותאמים כראוי ונכפים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. טכניקה זו מאפשרת לאדם: (1) לחקות מתח in vivo, הפעלה, תדירות צעדים ודפוסי לולאת עבודה; (2) לשנות את הדפוסים הללו כך שיתאימו לתגובות הכוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות מאפיינים ספציפיים של מתח ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעלי חיים נעים משיגים הישגים אתלטיים מרשימים של סיבולת, מהירות וזריזות בסביבות מורכבות. תנועת בעלי חיים מרשימה במיוחד בניגוד למכונות מהונדסות על ידי בני אדם - היציבות והזריזות של רובוטים בעלי רגליים, תותבות ושלדים חיצוניים נותרו גרועות בהשוואה לבעלי חיים. תנועת רגליים בשטח טבעי דורשת שליטה מדויקת והתאמות מהירות כדי לשנות את המהירות ולתמרן תכונות סביבתיות הפועלות כהפרעות בלתי צפויות1,2,3,4. עם זאת, הבנת תנועה לא יציבה היא מאתגרת מטבעה מכיוון שהדינמיקה תלויה באינטראקציות מורכבות בין הסביבה הפיזית, מכניקת השרירים והשלד ושליטה סנסורית-מוטורית1,2. תנועת רגליים דורשת תגובה להפרעות בלתי צפויות עם עיבוד רב-מודאלי מהיר של מידע חושי והפעלה מתואמת של גפיים ומפרקים1,5. בסופו של דבר, התנועה מתאפשרת על ידי שרירים המייצרים כוח באמצעות תכונות מכניות מהותיות של מערכת השלד והשרירים כמו גם משליטה עצבית1,5,6,7. שאלה בולטת של נוירומכניקה היא כיצד גורמים אלה מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת בתגובה להפרעות בלתי צפויות. הטכניקה הבאה משתמשת בתגובה המכנית הפנימית של השריר לעיוות באמצעות מסלולי מתח in vivo במהלך ניסויים ex vivo הניתנים לשליטה עם שריר "אווטאר".

טכניקת לולאת עבודת השרירים סיפקה מסגרת חשובה להבנת מכניקת השרירים הפנימית במהלך תנועות מחזוריות8,9,10. טכניקת לולאת העבודה המסורתית מניעה את השרירים דרך מסלולי מתח מוגדרים מראש, בדרך כלל סינוסואידים, באמצעות תדרים ודפוסי הפעלה שנמדדו במהלך ניסויים in vivo2,8,9,11. שימוש במסלולי אורך סינוסואידליים יכול להעריך באופן מציאותי את העבודה ותפוקת הכוח במהלך טיסה12 ו-swimming2 בתנאים שבהם בעלי חיים אינם עוברים שינויים מהירים במסלולי המתח עקב אינטראקציה עם הסביבה וקינמטיקה של שרירים ושלד. עם זאת, מסלולי מתיחת שרירים in vivo במהלך תנועת רגליים נובעים באופן דינמי מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה5,7,13,14. יש צורך בטכניקת לולאת עבודה מציאותית יותר כדי לחקות עומסים, מסלולי מתח וייצור כוח התואם את הדינמיקה של שריר-גיד in vivo ומספק תובנה לגבי האופן שבו מכניקת שרירים פנימית ושליטה עצבית מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת מול הפרעות.

כאן, אנו מציגים דרך חדשה לחקות כוחות שרירים in vivo במהלך תנועת הליכון על ידי שימוש בשריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים ex vivo עם מסלולי מתח in vivo המייצגים עומסי in vivo משתנים בזמן. שימוש במסלולי המתח הנמדדים in vivo משריר מטרה על שרירים מחיית מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים ex vivo יחקה עומסים שחווים במהלך תנועה. בניסויים המתוארים כאן, שריר ex vivo mouse ex vivo extensor digitorum longus (EDL) משמש כ"אווטאר" לשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי (MG) של חולדה in vivo במהלך הליכה, ריצה ודהירה על הליכון13. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי המתח in vivo מותאמים כראוי ונכפים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. בעוד ששרירי ה-EDL של העכבר שונים בגודל, בסוג הסיבים ובארכיטקטורה בהשוואה לחולדה MG, ניתן לשלוט בהבדלים אלה. טכניקת ה"אווטאר" מאפשרת לאדם: (1) לחקות מתח, הפעלה, תדירות צעדים ודפוסי לולאת עבודה; (2) לשנות את הדפוסים הללו כך שיתאימו לתגובות הכוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות מאפיינים ספציפיים של מתח ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת צפון אריזונה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשרירי Extensor digitorum longus (EDL) מעכברי בר זכרים ונקבות (זן B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), בגילאי 60-280 יום. בעלי החיים הושגו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים), והוקמו במושבה באוניברסיטת צפון אריזונה.

1. בחירת מסלול מתח in vivo והכנה לשימוש במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo

הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במדידות קודמות מתנועה דינמית in vivo, שסופקו ישירות למחברים (ניקולאי קונו, UMass Lowell, תקשורת אישית), בניסויים ex vivo. הנתונים המקוריים נאספו עבור Wakeling et al.15. זמן, אורך או מתח, EMG/הפעלה ונתוני כוח נדרשים כדי לשכפל את הפרוטוקול.

  1. פלח את כל ניסוי in vivo לצעדים בודדים באמצעות כל פלטפורמת תכנות (קוד MATLab מסופק בקובץ קידוד Suplementary 1).
    1. שרטט את שינויי האורך לעומת הזמן עבור כל משפט in vivo. זה משמש כדי להמחיש צעדים בודדים (עמידה לעמידה) ולהעריך שונות בין צעדים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1).
    2. חשב מתח לכל הניסוי (אורך (L) / כוח איזומטרי מקסימלי באורך אופטימלי L0).
    3. בחר צעד מתוך הניסיון כולו המייצג את כל הצעדים, ומתחיל ומסתיים באורכים דומים. ניתן לעשות זאת באופן חזותי על ידי גרף האורכים זה על גבי זה כדי להשוות כל צעד.
    4. לאחר בחירת צעד מייצג, פלח נתוני מתח, EMG/הפעלה וכוח מהניסוי כולו באמצעות פלטפורמת תכנות כלשהי (ראה קובץ קידוד משלים 1 לקודים המשמשים ב-MATLab16).
    5. אם תדירות הדגימה שונה עבור מתח, EMG/הפעלה או כוח, אינטרפולציה של נקודות הנתונים כך שכולן ידגמו באותה תדירות.
      הערה: חוקרים יכולים לקבוע את תדירות הלכידה על סמך מרווחי הזמן בין כל נקודה שנדגמה בניסוי כולו. אם משתנים נלכדים באותה תדירות, זמני הדגימה יהיו זהים.
  2. חשב את תדירות הצעדים המקוטעים.
    1. חשב את התדירות על ידי קביעת משך הצעד המפולח בשניות וחלוקת 1 (שנייה) במשך (1/משך = # צעדים לשנייה).
    2. קבע באופן ידני כמה נקודות נתונים יש לרכוש בניסויים ex vivo כדי להתאים לתדר.
    3. חשב את הזמן הנדרש לשני צעדים. חזור על הצעדים לפחות פעם אחת להערכה בתוך שגיאת מדידת השרירים, שתידרש לניתוח סטטיסטי לאחר מכן.
  3. קבע את שלב הגירוי ביחס לקלט המתח באמצעות פעילות ה-EMG הנמדדת כדי לקבוע את תחילת ומשך הגירוי עבור לולאות העבודה ex vivo. ניתן להשתמש בכל פלטפורמת תכנות (ראה קובץ קידוד משלים 1 לקוד ששימש במחקר זה).
    1. הצג את אות EMG על פני אותו תחום ציר x (זמן) כמו שינוי המתח (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1). הגדל את אות ה- EMG כך שיהיה גלוי; ניתן לעשות זאת על ידי הכפלת אות ה-EMG במספר שרירותי, שינוי קנה המידה של המתח וה-EMG כך שיהיו באותו קנה מידה, ו/או הוספת אות ה-EMG למתח.
      הערה: המחברים שינו את קנה המידה של הזן וה-EMG כך שיהיו באותו קנה מידה באמצעות פונקציית "קנה מידה מחדש" ב-MATLab (ראה איור משלים 1).
    2. מצא היכן מתחילה והיכן פעילות EMG מתחילה ומסתיימת, כפי שמצוין על ידי שינוי בעוצמה של שתי סטיות תקן17,18.
      הערה: בהתאם לבעל החיים ולשריר, הופעת EMG עשויה להתאים או לא להתאים למגע בכף הרגל (מוניקה דיילי, UC Irvine, תקשורת אישית) (ראה סעיף דיון).
    3. חשב את אחוז מחזור המתח (למשל, 40%) שבו מתרחשת הפעלת ה-EMG ולמשך כמה זמן יתרחש הגירוי (למשל, 222 אלפיות השנייה).
      הערה: החוקרים יצטרכו לקחת בחשבון עיכוב צימוד עירור-התכווצות (ECC) השונה בין תנועת in vivo ללולאות עבודה ex vivo ועשוי להיות שונה עבור כל חיה ושריר (למשל, ECC in vivo הוא 24.5 ms עבור חולדה MG, ex vivo ECC הוא ~5 ms עבור EDL של עכבר).
  4. הכן כניסות מתח מייצגות עבור תוכנית בקר לולאת העבודה. כל תוכנה שיכולה ללכוד פלט כוח עם קלט למתח וגירוי יכולה לשמש עבור תוכנית בקר לולאת העבודה (ראה סעיף דיון).
    1. קח את הצעד שנבחר ובצע אינטרפולציה למספר הנקודות המתאים הדרוש כדי ללכוד את הצעד בתדר in vivo למשך שני מחזורים (ראה שלב 1.2).
    2. שנה את קנה המידה של הצעד כדי להתחיל ולעצור ב"אפס מאמץ" (למשל, L0 או 95% L0) לאחר מתיחה על ידי סטיית אורך שנקבעה מראש (ראה שלב 3.3).
    3. "קנה מידה" בחר צעד, במידת הצורך, כדי להשתמש בו כקלט לשינויי מתח ב-EDL של העכבר (ראה סעיף דיון). כדי לשנות את קנה המידה, בחר חריגת אורך שאליה ניתן למתוח את ה-EDL של העכבר ללא נזק (למשל, אנו בדרך כלל מותחים את ה-EDL של העכבר ב-10% L0 ללא קשר למין in vivo). ייתכן שיהיה צורך לשנות זאת על סמך תוצאות ראשוניות (ראה שלב 3.3).

figure-protocol-1
איור 1: אורך לאורך זמן של ניסוי שלם in vivo. אורך (מ"מ) משורטט כנגד הזמן של חולדה MG. צעדים מסומנים על ידי מעגלים, מהאורך הקצר ביותר לאורך הקצר ביותר, הנחשבים לצעד בודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הערכת הכוח האיזומטרי המרבי של שריר העכבר ex vivo

  1. הגדר ציוד וניתוח.
    הערה: עיין בסעיף הדיון להסבר על הציוד הדרוש ללולאת העבודה ex vivo.
    1. הכן אמבט איברי רקמות על ידי החדרת שסתום מחט החמצן לאמבט הרקמות של מעיל המים (ראה טבלת חומרים). חבר את צינור החמצן לבלון גז עם 95% 0,2-5% CO2. אפשר 20 psi למלא את אמבט הרקמות של מעיל המים.
    2. יש להכין את אזור הניתוח על ידי הזרמת צינור חמצן נוסף מקו הגז לצלחת התגבשות מלאה בתמיסת קרבס-הנסלייט (שלב 2.1.3) בסמוך לאזור הניתוח. זה ישמש לשמירה על השרירים מאווררים ולחות במהלך הניתוחים ואחריהם.
      הערה: ניתן לאחסן שרירים בתמיסה מאווררת זו עד 4 שעות, אם מוציאים יותר משריר אחד מהעכבר בכל פעם.
    3. הכן 1 ליטר של תמיסת קרבס-הנסלייט המכילה (במימול l-1): NaCl (118); KCl (4.75); MgSO4 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl2 (2.54); וגלוקוז (10.0) בטמפרטורת החדר ו-pH ל-7.4 באמצעות HCl ו-NaOH (ראה טבלת חומרים). בעת טיפול ב-HCl ו-NaOH, יש ללבוש את ה-PPE המתאים של משקפי מגן וכפפות.
    4. מלאו את האמבטיה בתמיסת קרבס-הנסלייט בטמפרטורת החדר וב- pH 7.4. טבלו את השריר ואת הקרס לחלוטין בתמיסה.
    5. הפעל את כל הציוד; מערכת ידית שרירים דו-מצבית, ממריץ וממשק אותות (לוח DAQ) (ראה טבלת חומרים).
  2. דיסקציה של שרירי EDL.
    1. הרדמה עמוקה של העכבר ולאחר מכן ביצוע המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם. הנח את העכבר בתנוחת שכיבה לרוחב ימין או שמאל כשהגפה האחורית העליונה מתוחה ואצבעות הרגליים נוגעות בלוח הדיסקציה. הסר את הפרווה מהקרסול מעל מפרק הברך.
    2. אוהל את העור במלקחיים וחתוך ממפרק הקרסול לאזור הירך. לאחר שהשריר נחשף, חתכו סביב הקרסול כמו "שולי מכנסיים". משוך את העור כלפי מעלה כדי לחשוף את שרירי הרגליים בצורה ברורה יותר.
    3. אתר את קו הפאשיה המפריד בין השוקה הקדמית (TA) והגסטרוקנמיוס, הפרד באמצעות מספריים לדיסקציה כדי לחשוף את גידי הברך. הנח מספריים לדיסקציה בין שני גידי הברך החשופים. מספריים "יתפסו" בכיס ממש מתחת לגידי הברך החשופים. בלאנט לנתח "כיס" תוך כדי משיכת המספריים מהרגל עד שהמספריים מגיעים לקרסול כדי לחשוף את ה-EDL.
    4. בעזרת קשר לולאה קשור מראש בתפר כירורגי משי בגודל 4-0 (ראה טבלת חומרים), שרוך קצה אחד של התפר מתחת לגיד הקרוב ביותר לברך. קשרו קשר מרובע כפול מעל צומת השריר-גיד הפרוקסימלי מבלי להניח אותו על השריר או לכלול את הגיד. חותכים מעל הקשר. משוך בעדינות את הלולאה הקשורה לגיד, וה- EDL ייצא מה"כיס ".
    5. הדביקו את הלולאה לאזור הדיסקציה כדי ליצור מתח ב-EDL. קשרו קשר מרובע כפול באמצעות קשר לולאה נוסף שנקשר מראש בצומת השריר-גיד הדיסטלי מבלי להניח אותו על השריר או לכלול את הגיד. חותכים את הקשר בצד קרוב יותר לרגל כדי להסיר את כל ה-EDL מהעכבר. חותכים את התפר הנוסף הרחק מהקשרים המרובעים הכפולים בצדדים הפרוקסימליים והדיסטליים של השריר ומניחים את השריר באמבטיה המאווררת ליד אזור הניתוח.
      הערה: הקפד לשים לב איזה צד פרוקסימלי ו/או דיסטלי אם מניחים את השריר באמבטיה סודה.
    6. כדי למקם על אסדת ידית מנוע הסרוו, חבר את EDL אנכית בין אלקטרודות פלטינה תלויות. חבר את קשר הלולאה הדיסטלי לוו הנייח והצמד את קשר הלולאה הפרוקסימלי לוו המחובר לזרוע הסרוו-מוטורית. הרם את אמבט הרקמות כדי לטבול את השריר בתמיסת קרבס-הנסלייט המאווררת.
      הערה: אוורור לא אמור להפריע לשריר כשהוא שקוע. אם כן, הורד את לחץ הגז. אפשר לשריר להתייצב במשך 10 דקות לפני תחילת הגירוי.
  3. מדוד את הכוח האיזומטרי המרבי של שריר EDL.
    הערה: עיין בטבלה 1 לפרוטוקול כיצד למדוד כוח איזומטרי מרבי באמצעות עווית וטטנוס. ראה איור משלים 1 להמחשה של התוכנית שבה השתמשו המחברים.
    1. לעורר את השריר בעזרת עווית על-מקסימלית כדי להבטיח שהשריר לא נפגע במהלך הניתוח (80 וולט, 1 עמודים, 1 אלפיות השנייה; טבלה 1; ראה איור משלים 2). אם לא נגרם נזק, השתמש בכפתור האורך במערכת ידית השריר כדי למצוא אורך שריר באמצעות גירוי עווית שבו המתח הפעיל הוא ~1V / 0.1271 N עם פחות מ-~0.1V / 0.01271N מתח פסיבי.
    2. רשום את אורך ההתחלה של השריר מקשר תפר לקשר תפר בוולט ובמילימטרים. הזן מדידות לחלק הכיול של התוכנית עבור אורך התחלתי (ראה איור משלים 1).
    3. מצא כוח איזומטרי מקסימלי של עווית על-מקסימלית באורך אופטימלי (L0) של EDL (טבלה 1). מבחינה טכנית אין צורך בתקופת מנוחה, אך המתנה של דקה אחת בין גירוי לגירוי תייצב את המתח הפסיבי. רשום את האורך (בוולט) שבו העווית העל-מקסימלית היא המקסימלית. זהו האורך האופטימלי של השריר (L0) לעווית.
    4. מדוד את השריר בעזרת מחוגה באורך זה. מדוד את השריר מקשר תפר לקשר תפר. לאחר שנמצא L0, קצר את השריר בחזרה לאורך ההתחלתי (מתח פעיל ~ 1V / 0.1271 N).
    5. מצא כוח איזומטרי מקסימלי של טטנוס על-מקסימלי של EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; טבלה 1). רשום את האורך (בוולט ובמילימטרים) של הכוח הטטני העל-מקסימלי ב-L0 ומדוד את הסיבים מקשר תפר לקשר תפר שוב עם מחוגה.
      הערה: הגדלת אורך השריר בצעדים של 0.5 V/0.65 מ"מ תביא ל-L0 מדויק יותר הן עבור עווית והן עבור טטנוס.
    6. מצא את הכוח האיזומטרי התת-מקסימלי של EDL (45 V, 110 pps, 500ms; טבלה 1) ב-L0 לפני ואחרי הניסוי כדי להבטיח שלא תתרחש עייפות מפרוטוקול הגירוי. ירידה של 10% בכוח נחשבת לשריר "עייף".
ניסויעוצמת סימולציה (V)תדר דופק (pps / Hz)משך גירוי (ms)תגובות
1. "חימום"8011הגדל או הקטן את האורך ב-0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של V 1
2. עווית אורך שריר אופטימלי (L0)8011הגדל או הקטן את האורך ב-0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של ~1 V
3. אורך שריר אופטימלי טטנוס (L0)80180500מנוחה של 3 דקות בין שינוי האורך ב-0.50 וולט
4. L0 תת-מקסימלי לפני הניסוי45110500באורך L0
6. ניסויי אווטאר45110השתמש באופן מחזורי בשינויי אורך מייצגים עבור EDL של עכבר
7. L0 תת-מקסימלי לאחר הניסוי45110500חזור ל-L0 לאחר הניסוי ומדוד L0

טבלה 1: פרוטוקול גירוי. פרוטוקול גירוי למציאת אורך אופטימלי של עווית וטטנוס על-מקסימליים ותת-מקסימליים. הפרוטוקול משתנה לפי עוצמת הגירוי, התזמון והפולסים לשנייה.

3. השלמת טכניקת לולאת עבודה "אווטאר" באמצעות מסלולי מתח נבחרים in vivo

  1. הגדר את התוכנה הדרושה להשלמת טכניקות לולאת עבודה "אווטאר" (ראה טבלת חומרים).
    הערה: יש צורך בקלט file (.csv או דומה) המציין את אורך השריר בכל שלב זמן (ראה שלב 1.4). יש צורך בקלט עבור אחוז המחזור שבו מתחיל הגירוי ולמשך הגירוי (ראה איור משלים 3 למשל).
  2. השלם טכניקת לולאת עבודה "אווטאר".
    הערה: בעוד שאנו משתמשים בתוכנית LabView מותאמת אישית, חוקרים יכולים להשתמש בכל תוכנית המאפשרת שליטה בשינויי אורך ב-EDL של העכבר על ידית סרוו-מוטורית, שליטה בתחילת (% מחזור) ומשך (ms) של הגירוי בזמנים מוגדרים, ומדידת כוח השרירים. ראה איור משלים 3 להמחשה של התוכנית שבה משתמשים המחברים.
    1. העלה את שינויי המתח המוגדלים עם טיול אורך בקנה מידה לתוכנית משלב 1.4. ראה שלבים 1.4, 3.3 וסעיף הדיון למידע נוסף על "שינויי מתח בקנה מידה".
    2. התאם את אורך ההתחלה של השריר במידת הצורך (ראה סעיף 3.3). הזן את אורך ההתחלה ב-V ו-mm כדי לכייל את התוצאות (ראה איור משלים 3).
    3. השתמש בהתחלת הגירוי ומשך הזמן המחושבים בשלב 1.3.
    4. העבירו את השריר דרך שינויי האורך המוגדלים עם סטיית אורך קבועה למשך שני מחזורים.
    5. שמור נתונים. אם נאספים מספר פרוטוקולי גירוי על אותו שריר, המתינו 3 דקות בין כל גירוי.
    6. יש לעורר באורך אופטימלי (L0) באמצעות הפעלה תת-מקסימלית כדי לקבוע אם התרחשה עייפות. אם הכוח יורד ביותר מ -10%, השרירים נחשבים עייפים. ראה טבלה 1 לפרוטוקולי גירוי.
    7. הסר את השריר מהאמבטיה. חתכו קשרים בלולאה מהשריר וטפחו את התמיסה העודפת מהשריר. שקלו את השריר. קבע שטח חתך פיזיולוגי באמצעות הנוסחה הסטנדרטית: מסת שריר/(L0*1.06)19.
  3. כוונון פרמטרים לטכניקת לולאת עבודה "אווטאר" (ראה סעיף דיון).
    1. קבע את אורך ההתחלה וסטיית האורך על ידי התאמת עליית המתח הפסיבי ex vivo לעליית המתח הפסיבית שנצפתה in vivo (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2).
      הערה: מחקר זה השתמש באחוז L0 כדי להגדיל את אורך ההתחלה (מ"מ) ואת החריגה (% L0; ראה שלב 1.4 וסעיף דיון). כדי להתאים את עליית המתח ב-EDL של עכבר ex vivo לזו של החולדה in vivo MG, המחברים מצאו שאורך התחלתי ב-L0 ייצר את ההתאמה הטובה ביותר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2).
    2. בחר שלושה אורכי התחלה (למשל, -5% L0, L0 ו-+5% L0). בצע את לולאת העבודה "אווטאר" בכל אחד מאורכי ההתחלה הללו עם סטיית אורך מוגדרת (למשל, 10% L0).
      הערה: בניסויי ה"אווטאר" הנוכחיים באמצעות EDL של עכבר, נעשה שימוש בסטיית אורך של 10% L0.
    3. חזור על הפעולה עם אורכי התחלה ו/או סטייה חדשים עד שקצב עליית המתח הפסיבי ex vivo דומה לקצב עליית המתח הפסיבי in vivo (ראה <מחלקה חזקה = "xfig">איור 2B).
    4. בהתאם לסוגי הסיבים ודינמיקת ההפעלה של השרירים המשמשים, הגדל או הקטן את משך הגירוי כדי לייעל את ההתאמה בין ex vivo לכוח in vivo. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את תחילת ו/או משך הגירוי כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לייצור כוח in vivo במהלך ניסויי "אווטאר".
    5. כדי להחליט אם זה הכרחי (ראה סעיף דיון), התווה כוח לאורך זמן של "אווטאר" ושריר in vivo (איור 3) וחשב את מקדם הקביעה R2 על ידי ריבוע המתאם המוגדל בין כוח השריר המטרה לכוח השריר "אווטאר" (ראה תוצאות מייצגות).

figure-protocol-2
<מחלקה חזקה="xfig">איור 2: עליית מתח פסיבית תואמת. לולאות עבודה המציגות את עליית המתח הפסיבי in vivo ו-ex vivo (חיצים). לולאת עבודה בקנה מידה in vivo מחולדה MG (שחור) הולכת במהירות 2.9 הרץ (נתונים מ-Wakeling et al.15). לולאות עבודה בקנה מידה Ex vivo מהעכבר EDL (ירוק) ב-2.9 הרץ. (A) האורך ההתחלתי של שריר ה-EDL של העכבר הוא +5% L0. (B) אורך ההתחלה של שריר ה-EDL של העכבר הוא L0. שימו לב שעליית המתח הפסיבי ex vivo תואמת את עליית המתח in vivo ב-A אך לא ב-B. קווים עבים יותר מצביעים על גירוי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3: אופטימיזציה של משך הגירוי של EDL של עכבר כך שיתאים לכוח in vivo של חולדה MG (קו שחור). הכוח שנוצר על ידי EDL של העכבר באמצעות גירוי מבוסס EMG (קו מקווקו ירוק) פוחת מוקדם יותר מכוח in vivo, ככל הנראה עקב השבתה מהירה יותר של ה-EDL של העכבר בהשוואה ל-MG של חולדה. כדי לייעל את ההתאמה בין כוחות in vivo ו-ex vivo, ה-EDL של העכבר היה מגורה למשך זמן ארוך יותר (קו ירוק מלא). גירוי מבוסס EMG R2 = 0.55, גירוי אופטימלי R2 = 0.91. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של ניסויי ה"אווטאר" היא לשכפל את ייצור הכוח ותפוקת העבודה in vivo קרוב ככל האפשר במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo. מחקר זה בחר להשתמש ב-EDL של עכבר כ"אווטאר" עבור חולדה MG מכיוון ש-EDL של עכבר ו-MG של חולדה מורכבים שניהם בעיקר משרירים20,21. שני השרירים הם המניעים העיקריים של מפרק הקרסול (EDL קרסול דורסיפלקסור, MG קרסול פלנטרופקסור) עם זוויות פנציה דומות (עכבר EDL 12.4 + 2.12°22, חולדה MG 20° בשימוש במחקר זה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שאורגניזמים נעים בצורה חלקה על פני נופים, העומסים והמתחים הבסיסיים שהשרירים חווים משתנים באופן דרסטי 1,6,23. הן במהלך תנועה in vivo 1,24 והן בניסויי "אווטאר", השרירים מגורים באופן תת-מקסימלי בתנאים מחזוריים ולא יציבים. יחסי הכוח-אורך האיזומטרי והכוח-מהירות האיזוטוניים אינם מתאימים היטב לחיזוי כוח השריר בתנאים אלה2. הבנת ההשפעות של מת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מודים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ניקולאי קונאו על שסיפק את הנתונים ששימשו במחקר זה. ממומן על ידי NSF IOS-2016049 ו-NSF DBI-2021832.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תפר משי קלוע שאינו נספג 4-0 מרסילק 734H
סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2)סיגמא-אולדריץ1086436קרבס-הנסליט  תמיסה
: דקסטרוז סיגמא-אולדריץ'D9434קרבס-הנסלייט  פתרון
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  תמיסה
: חומצה הידורכלורית (HCl) סיגמא-אולדריץ'1.37055קרבס-הנסלייט  פתרון
LabView איסוף נתונים (
MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  תמיסה
אשלגן כלורי (KCl) סיגמא-אולדריץ'P3911קרבס-הנסלייט  תמיסה
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  פתרון
S88 דשא ממריץM643H05זמין לרכישה במערכת
המנוף מסדרת Ebay 300BAurora1200Aכולל אמבט רקמות מעטפת מים
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  תמיסה
נתרן כלורי (NaCl) סיגמא-אולדריץ'S9888קרבס-הנסלייט  תמיסה
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'S5881קרבס-הנסלייט  פתרון
עכברים מסוג ברמעבדת ג'קסוןB6C3Fe a/a Ttn mdm/J
' מגנזיום גופרתי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561(2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242(2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312(2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721(2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669(2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019(2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ex Vivo Work LoopIn Vivo MuscleMuscle Force ProductionStrain TrajectoriesNeural ActivationMuscle MechanicsStretch Shortening CyclesElectromyographic SignalsServo MotorLocomotion Dynamics

Related Articles