הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

"אווטאר", ניסויי לולאת עבודה ex vivo מותאמים באמצעות מתח והפעלה in vivo

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65610

⸱

18 באוגוסט 2023

 , 
1Northern Arizona University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מפרט את המתודולוגיה לחיקוי ייצור כוח שריר in vivo במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo באמצעות שריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה כדי להעריך את התרומות של מעברי מתח והפעלה לתגובת כוח השריר.

תקציר

התנהגויות תנועה הן מאפיינים מתעוררים של מערכות דינמיות הנובעות מייצור כוח שרירים ותפוקת עבודה. יחסי הגומלין בין מערכות עצביות ומכניות מתרחשים בכל רמות הארגון הביולוגי בו זמנית, החל מכוונון תכונות שרירי הרגליים בזמן הריצה ועד לדינמיקה של הגפיים המקיימות אינטראקציה עם הקרקע. הבנת התנאים שבהם בעלי חיים משנים את אסטרטגיות הבקרה העצבית שלהם לעבר מכניקת שרירים פנימית ('פרפלקסים') בהיררכיית הבקרה תאפשר למודלים של שרירים לחזות את כוח השריר in vivo ולעבוד בצורה מדויקת יותר. כדי להבין את מכניקת השרירים in vivo, נדרשת חקירה ex vivo של כוח השריר ועבודה בתנאי מתח ועומס משתנים דינמית הדומים לתנועה in vivo. מסלולי מתח in vivo מציגים בדרך כלל שינויים פתאומיים (כלומר, מעברי מתח ומהירות) הנובעים מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה. המטרה העיקרית של טכניקת ה"אווטאר" שלנו היא לחקור כיצד השרירים מתפקדים במהלך שינויים פתאומיים בקצב המתח והעומס כאשר התרומה של תכונות מכניות מהותיות לייצור כוח השריר עשויה להיות הגבוהה ביותר. בטכניקת "אווטאר", גישת לולאת העבודה המסורתית משתנה באמצעות מסלולי מתח נמדדים in vivo ואותות אלקטרומיוגרפיים (EMG) מבעלי חיים במהלך תנועות דינמיות כדי להניע את שרירי ex vivo דרך מחזורי קיצור מתיחה מרובים. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי המתח in vivo מותאמים כראוי ונכפים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. טכניקה זו מאפשרת לאדם: (1) לחקות מתח in vivo, הפעלה, תדירות צעדים ודפוסי לולאת עבודה; (2) לשנות את הדפוסים הללו כך שיתאימו לתגובות הכוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות מאפיינים ספציפיים של מתח ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

מבוא

בעלי חיים נעים משיגים הישגים אתלטיים מרשימים של סיבולת, מהירות וזריזות בסביבות מורכבות. תנועת בעלי חיים מרשימה במיוחד בניגוד למכונות מהונדסות על ידי בני אדם - היציבות והזריזות של רובוטים בעלי רגליים, תותבות ושלדים חיצוניים נותרו גרועות בהשוואה לבעלי חיים. תנועת רגליים בשטח טבעי דורשת שליטה מדויקת והתאמות מהירות כדי לשנות את המהירות ולתמרן תכונות סביבתיות הפועלות כהפרעות בלתי צפויות1,2,3,4. עם זאת, הבנת תנועה לא יציבה היא מאתגרת מטבעה מכיוון שהדינמיקה תלויה באינטראקציות מורכבות בין הסביבה הפיזית, מכניקת השרירים והשלד ושליטה סנסורית-מוטורית1,2. תנועת רגליים דורשת תגובה להפרעות בלתי צפויות עם עיבוד רב-מודאלי מהיר של מידע חושי והפעלה מתואמת של גפיים ומפרקים1,5. בסופו של דבר, התנועה מתאפשרת על ידי שרירים המייצרים כוח באמצעות תכונות מכניות מהותיות של מערכת השלד והשרירים כמו גם משליטה עצבית1,5,6,7. שאלה בולטת של נוירומכניקה היא כיצד גורמים אלה מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת בתגובה להפרעות בלתי צפויות. הטכניקה הבאה משתמשת בתגובה המכנית הפנימית של השריר לעיוות באמצעות מסלולי מתח in vivo במהלך ניסויים ex vivo הניתנים לשליטה עם שריר "אווטאר".

טכניקת לולאת עבודת השרירים סיפקה מסגרת חשובה להבנת מכניקת השרירים הפנימית במהלך תנועות מחזוריות8,9,10. טכניקת לולאת העבודה המסורתית מניעה את השרירים דרך מסלולי מתח מוגדרים מראש, בדרך כלל סינוסואידים, באמצעות תדרים ודפוסי הפעלה שנמדדו במהלך ניסויים in vivo2,8,9,11. שימוש במסלולי אורך סינוסואידליים יכול להעריך באופן מציאותי את העבודה ותפוקת הכוח במהלך טיסה12 ו-swimming2 בתנאים שבהם בעלי חיים אינם עוברים שינויים מהירים במסלולי המתח עקב אינטראקציה עם הסביבה וקינמטיקה של שרירים ושלד. עם זאת, מסלולי מתיחת שרירים in vivo במהלך תנועת רגליים נובעים באופן דינמי מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה5,7,13,14. יש צורך בטכניקת לולאת עבודה מציאותית יותר כדי לחקות עומסים, מסלולי מתח וייצור כוח התואם את הדינמיקה של שריר-גיד in vivo ומספק תובנה לגבי האופן שבו מכניקת שרירים פנימית ושליטה עצבית מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת מול הפרעות.

כאן, אנו מציגים דרך חדשה לחקות כוחות שרירים in vivo במהלך תנועת הליכון על ידי שימוש בשריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים ex vivo עם מסלולי מתח in vivo המייצגים עומסי in vivo משתנים בזמן. שימוש במסלולי המתח הנמדדים in vivo משריר מטרה על שרירים מחיית מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים ex vivo יחקה עומסים שחווים במהלך תנועה. בניסויים המתוארים כאן, שריר ex vivo mouse ex vivo extensor digitorum longus (EDL) משמש כ"אווטאר" לשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי (MG) של חולדה in vivo במהלך הליכה, ריצה ודהירה על הליכון13. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי המתח in vivo מותאמים כראוי ונכפים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. בעוד ששרירי ה-EDL של העכבר שונים בגודל, בסוג הסיבים ובארכיטקטורה בהשוואה לחולדה MG, ניתן לשלוט בהבדלים אלה. טכניקת ה"אווטאר" מאפשרת לאדם: (1) לחקות מתח, הפעלה, תדירות צעדים ודפוסי לולאת עבודה; (2) לשנות את הדפוסים הללו כך שיתאימו לתגובות הכוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות מאפיינים ספציפיים של מתח ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל מחקרי בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולהם שימוש (IACUC) באוניברסיטת צפון אריזונה. שרירי כותב האצבעות הארוך (EDL) נלקחו מעכברים זכרים ונקבות מסוג פרא (wild-type, זן B6C3Fe a/a-Ttn)MDMבמטרת המחקר הנוכחי נעשה שימוש בחיות בגילאי 60-280 ימים. החיות נרכשו ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים), והוקמו כמושבה באוניברסיטת צפון אריזונה (Northern Arizona University).

1. בחירה in vivo מסלול המתיחה וההכנה לשימוש במהלך ex vivo ניסויי לולאת עבודה

הערה: בפרוטוקול זה, מדידות קודמות של תנועה דינמית in vivo, אשר סופקו ישירות למחברים (Nicolai Konow, UMass Lowell, תקשורת אישית), שימשו בניסויי ex vivo. הנתונים המקוריים נאספו עבור Wakeling et al.15. נתוני זמן, אורך או מאמץ, EMG/הפעלה וכוח נדרשים כדי לשחזר את הפרוטוקול.

  1. פלח את כולו in vivo ניסוי של פסיעות בודדות באמצעות כל פלטפורמת תכנות (קוד MATLAB מסופק ב- קובץ קידוד משלים 1).
    1. שרטט את השינויים באורך נגדזמן לכל ה- in vivo ניסוי. הדבר משמש להדמיה של פסיעות בודדות (ממגע למגע) ולהערכת השונות בין הפסיעות (איור 1).
    2. חשב את המתיחה (strain) עבור הניסוי כולו (אורך (L) / כוח איזומטרי מקסימלי באורך אופטימלי L)0).
    3. בחרו פסיעה מכלל הניסוי שהיא מייצגת עבור כל הפסיעות, אשר מתחילה ומסתיימת באורכים דומים. ניתן לבצע זאת באופן ויזואלי על ידי שרטוט האורכים זה על גבי זה כדי להשוות בין כל פסיעה.
    4. לאחר בחירת פסיעה מייצגת, יש להפריד נתוני מאמץ, EMG/הפעלה וכוח מכל הניסוי באמצעות כל פלטפורמת תכנות (ראה קובץ קידוד משלים 1 עבור הקודים שנעשה בהם שימוש ב-MATLab16).
    5. אם תדר הדגימה שונה עבור המתיחה (strain), ה-EMG/הפעלה או הכוח, בצעו אינטרפולציה לנקודות הנתונים כך שכולן יידגמו באותו תדר.
      הערה: חוקרים יכולים לקבוע את תדירות הדגימה על סמך מרווחי הזמן בין כל נקודה שנדגמה לאורך כל הניסוי. אם משתנים נדגמים באותה תדירות, זמני הדגימה יהיו זהים.
  2. חשב את תדירות הפסיעות המקוטעות.
    1. חשבו את התדר על ידי קביעת משך הזמן של פסיעה מקוטעת בשניות וחילוק המספר 1 (שנייה) במשך הזמן (1/משך הזמן = מספר הפסיעות לשנייה).
    2. קבעו באופן ידני כמה נקודות נתונים יש לרכוש ב- ex vivo ניסויים להתאמת התדר.
    3. חשבו את הזמן הדרוש לשני פסיעות. חזרו על הפסיעות לפחות פעם אחת כדי לאפשר הערכה בטווח השגיאה של מדידת השריר, דבר שיידרש עבור הניתוח הסטטיסטי העוקב.
  3. קבע את שלב הגירוי ביחס לקלט המתיחה באמצעות פעילות ה-EMG שנמדדה, כדי לקבוע את תחילתו ואת משכו של הגירוי עבור ה- ex vivo לולאות עבודה. ניתן להשתמש בכל פלטפורמת תכנות (ראו קובץ קידוד משלים 1 עבור הקוד שנעשה בו שימוש במחקר זה).
    1. צפייה באות EMG לאורך אותו טווח ציר x (זמן) כשל שינוי המתיחה (איור 1). הגדילו את אות ה-EMG כדי שיהיה גלוי; ניתן לעשות זאת על ידי הכפלת אות ה-EMG במספר שרירותי, שינוי קנה המידה של המאמץ (strain) וה-EMG כך שיהיו באותו קנה מידה, ו/או הוספת אות ה-EMG למאמץ.
      הערה: המחברים נתנו קנה מידה מחדש למאמץ (strain) ול-EMG כדי שיהיו על אותו קנה מידה, באמצעות פונקציית "rescale" ב-MATLab (ראו איור משלים 1).
    2. יש לקבוע את נקודות ההתחלה והסיום של פעילות ה-EMG, כפי שמעיד שינוי בעוצמה של שתי סטיות תקן17,18.
      הערה: בהתאם לבעל החיים ולשריר, תחילת ה-EMG עשויה או שאינה עשויה להתבצע במקביל למגע של כף הרגל (מוניקה דאלי, UC Irvine, תקשורת אישית) (ראו פרק הדיון).
    3. חשבו את אחוז מחזור המתיחה (למשל, 40%) שבו מתרחש תחילת ההפעלה של ה-EMG ולמשך כמה זמן תימשך הגירוי (למשל, 222 מילי-שניות).
      הערה: חוקרים יצטרכו להתחשב בעיכוב של צימוד עירור-התכווצות (ECC) המשתנה בין in vivo תנועה ו- ex vivo לולאות עבודה ועשויות להיות שונות עבור כל חיה ושריר (למשל, in vivo ה-ECC עבור MG של חולדה הוא 24.5 מילי-שניות, ex vivo ה-ECC הוא כ-5 מילי-שניות עבור שריר ה-EDL של עכבר).
  4. הכינו קלטים מייצגים של מאמץ (strain) עבור תוכנית בקר לולאת העבודה (work loop controller). ניתן להשתמש בכל תוכנית המסוגלת ללכוד פלט של כוח עם קלט למאמץ וגירוי עבור תוכנית בקר לולאת העבודה (ראו סעיף דיון).
    1. קח את הפסעה שנבחרה ובצע אינטרפולציה למספר הנקודות המתאים הדרוש כדי לתפוס את השלב ב- בתוך הגוף (in vivo) תדירות לשני מחזורים (ראה שלב 1.2).
    2. שנו את קנה המידה של הפסע כך שיתחיל ויסתיים ב"מאמץ אפס" (למשל, L0 או 95% L0) לאחר מתיחה לפי טווח תזוזה שנקבע מראש (ראה שלב 3.3).
    3. במידת הצורך, בצע "סקלינג" (Scale) לפסע שנבחר, כדי להשתמש בו כקלט לשינויי מאמץ בשריר ה-EDL של עכבר (ראו פרק דיון). לצורך הסקלינג, בחר טווח אורך שניתן למתוח אליו את שריר ה-EDL של העכבר ללא גרימה לנזק (למשל, בדרך כלל אנו מותחים את שריר ה-EDL של העכבר ב-10% L0 בלא קשר ל- in vivo מינים). ייתכן שיהיה צורך לשנות זאת בהתבסס על תוצאות ראשוניות (ראו שלב 3.3).

נתוני התכווצות שריר הלב; גרף של אורך לעומת זמן המראה דפוסי תנועה מחזוריים.
איור 1: אורך לאורך זמן של ניסוי שלם in vivo . אורך (mm) של MG בחולדה כפונקציה של זמן. פסיעות מסומנות בעיגולים, מהאורך הקצר ביותר לאורך הקצר ביותר, הנחשבים כפסיעה אחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הערכת כוח איזומטרי מרבי של שריר עכבר ex vivo

  1. הכנת הציוד והניתוח.
    הערה: ראו את סעיף הדיון (Discussion) להסבר על הציוד הדרוש למעגל העבודה ex vivo.
    1. הכינו אמבט רקמה-איבר על ידי הכנסת שסתום המחט של ה-oxytube לאמבט רקמה בעטיפת מים (ראו טבלת חומרים). חברו את ה-oxytube לגליל גז עם 95% O2-5% CO2. אפשרו ללחץ של 20 psi למלא את אמבט הרקמה בעטיפת המים.
    2. הכינו את אזור הניתוח על ידי העברת oxytube נוסף מקו הגז לצלוחית קריסטליזציה מלאה בתמיסת Krebs-Henseleit (שלב 2.1.3) בסמיכות לאזור הניתוח. צלוחית זו תשמש לשמירה על השרירים מאווררים ומחוברים למים במהלך ואחרי הניתוחים.
      הערה: ניתן לאחסן שרירים בתמיסה מאווררת זו למשך עד 4 שעות, במידה ומוצאים יותר משריר אחד מהעכבר בבת אחת.
    3. הכינו 1 L של תמיסת Krebs-Henseleit המכילה (ב-mmol l-1): NaCl (118); KCl (4.75); MgSO4 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl2 (2.54); וגלוקוז (10.0) בטמפרטורת החדר, והביאו את ה-pH ל-7.4 באמצעות HCl ו-NaOH (ראו טבלת חומרים). בעת עבודה עם HCl ו-NaOH, לבשו ציוד מגן אישי (PPE) מתאים הכולל משקפי מגן וכפפות.
    4. מלאו את האמבט בתמיסת Krebs-Henseleit בטמפרת החדר וב-pH 7.4. טבלו את השריר ואת הוו לחלוטין בתמיסה.
    5. הפעילו את כל הציוד: מערכת מנוף שריר במצב כפול (dual-mode muscle lever system), מעצב (stimulator), וממשק אותות (לוח DAQ) (ראו טבלת חומרים).
  2. דיסקציה של שריר ה-EDL.
    1. הרדימו את העכבר הרדמה עמוקה ובצעו לאחר מכן המתנסה על ידי פריקה צווארית. הניחו את העכבר במצב שכיבה צדית (ימין או שמאל) כאשר הגפה האחורית העליונה מתוחה והבהונות נוגעות בלוח הדיסקציה. הסירו את הפרווה מהקרסול ועד מעל מפרק הברך.
    2. הרימו את העור בעזרת פינצטה וחתכו מהמפרק בקרסול עד לאזור הירך. לאחר חשיפת השריר, חתכו מסביב לקרסול באופן דומה ל"מכפלה" של מכנסיים. משכו את העור למעלה כדי לחשוף את שרירי הרגל בצורה ברורה יותר.
    3. אתרו את קו הפסציה המפריד בין ה-tibialis anterior (TA) ל-gastrocnemius, והפרידו בעזרת מספרי דיסקציה כדי לחשוף את גידי הברך. מקמו את מספרי הדיסקציה בין שני גידי הברך החשופים. המספריים יילכדו ב"כיס" ממש מתחת לגידי הברך החשופים. בצעו דיסקציה קהה של ה"כיס" תוך משיכת המספריים הרחק מהרגל עד שהמספריים יגיעו לקרסול כדי לחשוף את ה-EDL.
    4. באמצעות קשר לולאה קשורה מראש בחוט תפר כירורגי משי בגודל 4-0 (ראו טבלת חומרים), השחילו קצה אחד של חוט התפר תחת הגיד הקרוב ביותר לברך. קשרו קשר ריבועי כפול מעל נקודת החיבור הפרוקסימלית של השריר והגיד, ללא הנחתו על השריר וללא הכללת הגיד בתוך הקשר. חתכו מעל הקשר. משכו בעדינות את הלולאה הקשורה לגיד, וה-EDL יצא מה"כיס".
    5. הדביקו את הלולאה לאזור הדיסקציה כדי ליצור מתיחה ב-EDL. קשרו קשר ריבועי כפול באמצעות קשר לולאה קשור מראש נוסף בנקודת החיבור הדיסטלית של השריר והגיד, ללא הנחתו על השריר וללא הכללת הגיד. חתכו את הקשר בצד הקרוב לרגל כדי להוציא את ה-EDL השלם מהעכבר. חתכו את שארית חוט התפר מהקשרים הריבועיים הכפולים בצד הפרוקסימלי והדיסטלי של השריר, והניחו את השריר באמבט המאוורר לצד אזור הניתוח.
      הערה: הקפידו לסמן איזה צד הוא הפרוקסימלי ו/או הדיסטלי כאשר מניחים את השריר באמבט מאוורר.
    6. להצבה על מתקן מנוף הסרוו-מוטור, הצמידו את ה-EDL בצורה אנכית בין אלקטרודות פלטינה תלויות. חברו את קשר הלולאה הדיסטלי לוו הנייח וחברו את קשר הלולאה הפרוקסימלי לוו המחובר לזרוע הסרוו-מוטור. הרימו את אמבט הרקמה כדי לטבול את השריר בתמיסת Krebs-Henseleit המאווררת.
      הערה: האוורור לא צריך להפריע לשריר כאשר הוא טבול. אם הדבר קורה, הנמיכו את לחץ הגז. המתינו 10 דקות להתאמת השריר (equilibrate) לפני תחילת העיבוב.
  3. מדידת הכוח האיזומטרי המקסימלי של שריר ה-EDL.
    הערה: עיינו בטבלה 1 לפרוטוקול למדידת כוח איזומטרי מקסימלי באמצעות twitch ו-tetanus. ראו איור משלים 1 להדגמה של התוכנה שבה השתמשו המחברים.
    1. עבבו את השריר בעזרת twitch סופרה-מקסימלי כדי לוודא שהשריר לא ניזוק במהלך הניתוח (80 V, 1 pps, 1ms; טבלה 1; ראו איור משלים 2). אם לא נגרם נזק, השתמשו בבורר האורך במערכת מנוף השריר כדי למצוא אורך שריר באמצעות גירוי twitch שבו המתח הפעיל הוא ~1V / 0.1271 N עם מתח פסיבי של פחות מ-~0.1V / 0.01271N.
    2. רשמו את אורך ההתחלה של השרירי מקשר תפר לקשר תפר ב-Volts ובמילימטרים. הזינו את המדידות לחלק הכיול של התוכנה עבור אורך ההתחלה (ראו איור משלים 1).
    3. מצאו את הכוח האיזומטרי המקסימלי של twitch סופרה-מקסימלי באורך אופטימלי (L0) של ה-EDL (טבלה 1). מבחינה טכנית אין צורך בתקופת מנוחה, אך המתנה של 1 דקה בין עיבובים תייצב את המתח הפסיבי. רשמו את האורך (ב-Volts) שבו ה-twitch הסופרה-מקסימלי הוא מקסימלי. זהו אורך השריר האופטימלי (L0) עבור twitch.
    4. מדדו את השריר באמצעות קליפר באורך זה. מדדו את השריר מקשר תפר לקשר תפר. לאחר מציאת L0, הקטינו את אורך השריר בחזרה לאורך ההתחלה (מתח פעיל ~1V / 0.1271 N).
    5. מצאו את הכוח האיזומטרי המקסימלי של tetanus סופרה-מקסימלי של ה-EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; טבלה 1). רשמו את האורך (ב-Volts ובמילימטרים) של כוח הטטני הסופרה-מקסימלי ב-L0 ומדדו שוב את הסיבים מקשר תפר לקשר תפר בעזרת קליפר.
      הערה: הגדלת אורך השריר בצעדים של 0.5 V/0.65 mm תביא ל-L0 מדויק יותר הן עבור twitch והן עבור tetanus.
    6. מצאו את הכוח האיזומטרי הסוב-מקסימלי של ה-EDL (45 V, 110 pps, 500ms; טבלה 1) ב-L0 לפני ואחרי הניסוי כדי לוודא שלא התרחשה עייפות כתוצאה מפרוטוקול העיבוב. ירידה של 10% בכוח נחשבת לשריר "עייף".
ניסויעוצמת הגירוי (V)תדירות הפולס (pps / Hz)משך הגירוי (ms)הערות
1. "חימום"8011הגדלה או הפחתה של האורך ב-0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של 1 V
2. אורך שריר אופטימלי למכווץ בודד (L0)8011הגדלה או הפחתה של האורך ב-0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של ~1 V
3. אורך שריר אופטימלי לטטנוס (L0)80180500מנוחה של 3 min בין שינויי אורך של 0.50 V
4. L0 סוב-מקסמלי לפני הניסוי45110500באורך L0
6. ניסויי אווטאר45110שימוש מחזורי בשינויי אורך מייצגים עבור EDL של עכבר
7. L0 סוב-מקסמלי לאחר הניסוי45110500חזרה ל-L0 לאחר הניסוי ומדידת L0

טבלה 1: פרוטוקול גירוי. פרוטוקול גירוי למציאת אורך אופטימלי של התכווצות (twitch) וטטנוס ברמה סופרא-מקסמלית וסוב-מקסמלית. הפרוטוקול משתנה בהתאם לעוצמת הגירוי, התזמון ומספר הפולסים לשנייה.

3. השלמת טכניקת לולאת עבודת "אוואטר" באמצעות מסלולי זנים נבחרים in vivo

  1. הגדירו את התוכנה הדרושה להשלמת טכניקות לולאת עבודה של "אוואטר" (ראו טבלת חומרים).
    הערה: נדרש קובץ קלט (.csv או דומה) המגדיר את אורך השריר בכל שלב של הזמן (ראו שלב 1.4). נדרשים קלטים עבור אחוז המחזור שבו מתחיל הגירוי ועבור משך הגירוי (ראו איור משלים 3 לדוגמה).
  2. בצעו את טכניקת לולאת העבודה של ה"אוואטר".
    הערה: בעוד שאנו משתמשים בתוכנת LabView מותאמת אישית, חוקרים יכולים להשתמש בכל תוכנה המאפשרת בקרה של שינויי אורך בשריר EDL של עכבר על גבי מנוע סרוו (servomotor lever), בקרה של תחילת הגירוי (% מחזור) ומשכו (ms) בזמנים מוגדרים, ומדידת כוח השריר. ראו איור משלים 3 להמחשה של התוכנה שבה השתמשו המחברים.
    1. העלו לתוכנה את שינויי המתיחה (strain changes) המנורמלים עם סטיית האורך המנורמלת מהשלב 1.4. ראו שלבים 1.4, 3.3 ואת פרק הדיון למידע נוסף על "שינויי מתיחה מנורמלים".
    2. כווןו את אורך ההתחלה של השריר במידת הצורך (ראו סעיף 3.3). הזינו את אורך ההתחלה ב-V וב-mm כדי לכייל את התוצאות (ראו איור משלים 3).
    3. השתמשו בתחילת הגירוי ובמשכו שחושבו בשלב 1.3.
    4. העבירו את השריר דרך שינויי האורך המנורמלים עם סטיית האורך שנקבעה למשך שני מחזורים.
    5. שמרו את הנתונים. אם נאספים מספר פרוטוקולי גירוי מאותו שריר, המתינו 3 דקות בין גירוי לגירוי.
    6. גריירו באורך אופטימלי (L0) תוך שימוש בהפעלה תת-מקסימלית (submaximal activation) כדי לקבוע אם חלה התעייפות. אם הכוח פוחת ביותר מ-10%, השרירים נחשבים להתעייפים. ראו טבלה 1 לפרוטוקולי הגירוי.
    7. הוציאו את השריר מהאמבט. חתכו את קשרי הלולאה מהשריר וספגו את עודפי התמיסה מהשריר. שקלו את השריר. קבעו את שטח החתך הפיזיולוגי באמצעות הנוסחה הסטנדרטית: מסת השריר/(L0*1.06)19.
  3. כווןו את הפרמטרים עבור טכניקת לולאת העבודה של ה"אוואטר" (ראו פרק הדיון).
    1. קבעו את אורך ההתחלה ואת סטיית האורך על ידי התאמה של עליית המתח הפסיבי ex vivo לעליית המתח הפסיבי שנצפתה in vivo (איור 2).
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש באחוזי L0 כדי לנרמל את אורך ההתחלה (mm) ואת הסטייה (% L0; ראו שלב 1.4 ופרק הדיון). לצורך התאמת עליית המתח ב-EDL של עכבר ex vivo לזו של MG של חולדה in vivo, המחברים מצאו שאורך התחלה ב-L0 הניב את ההתאמה הטובה ביותר (איור 2).
    2. בחרו שלושה אורכי התחלה (למשל, -5% L0, L0, ו-+5% L0). בצעו את לולאת העבודה של ה"אוואטר" בכל אחד מאורכי התחלה אלה עם סטיית אורך מוגדרת (למשל, 10% L0).
      הערה: בניסויי ה"אוואטר" הנוכחיים המשתמשים ב-EDL של עכבר, נעשה שימוש בסטיית אורך של 10% L0.
    3. חזרו על הפעולה עם אורכי התחלה ו/או סטיות אורך חדשות עד שקצב עליית המתח הפסיבי ex vivo יהיה דומה לקצב עליית המתח הפסיבי in vivo (ראו איור 2B).
    4. בהתאם לסוגי הסיבים ודינמיקת ההפעלה של השרירים שבהם נעשה שימוש, הגדילו או הפחיתו את משך הגירוי כדי לייעל את ההתאמה בין הכוח ex vivo לכוח in vivo. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את תחילת הגירוי ו/או את משכו כדי להתאים בצורה מיטבית לייצור כוח in vivo במהלך ניסויי ה"אוואטר".
    5. כדי להחליט אם הדבר נחוץ (ראו פרק הדיון), שרטטו את הכוח לאורך זמן של שריר "אוואטר" ושריר in vivo (איור 3) וחשבו את מקדם הדטרמינציה R2 על ידי העלאה בריבוע של המתאם המנורמל בין כוח שריר המטרה לכוח שריר ה"אוואטר" (ראו תוצאות מייצגות).

גרף שיווי משקל סטטי, ΣFx=0, המראה ניתוח לולאת עבודה; דיאגרמה של מאמץ מול מאמץ גזירה מנורמלים.
איור 2: התאמה של עלייה במתיחות פסיבית. לולאות עבודה המראות את העלייה במתיחות פסיבית in vivo ו-ex vivo (חצים). לולאת עבודה in vivo מנורמלת משריר MG של חולדה (שחור) בהליכה ב-2.9 Hz (נתונים מ-Wakeling et al.15). לולאות עבודה ex vivo מנורמלות משריר EDL של עכבר (ירוק) ב-2.9 Hz. (A) אורך התחלה של שריר EDL של עכבר הוא +5% L0. (B) אורך התחלה של שריר EDL של עכבר הוא L0. שימו לב כי העלייה במתיחות הפסיבית ex vivo תואמת את העלייה במתיחות in vivo ב-A אך לא ב-B. קווים עבים יותר מציינים גרייה. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גרף מאמץ מול זמן המראה עקומות תגובה דינמיות בניתוח בדיקות חומרים.
איור 3: אופטימיזציה של משך הגירוי בשריר ה-EDL של עכבר כדי להתאים לכוח in vivo של שריר ה-MG של חולדה (קו שחור). הכוח הנוצר על ידי ה-EDL של העכבר באמצעות גירוי מבוסס EMG (קו מקווקו ירוק) פוחת מוקדם יותר מהכוח in vivo$, וככל הנראה נובע מדה-אקטיבציה מהירה יותר של ה-EDL של העכבר בהשוואה ל-MG של חולדה. כדי לאפטמיזציה של ההתאמה בין הכוחות in vivo ו- ex vivo$, ה-EDL של העכבר גורה לגירוי למשך זמן ארוך יותר (קו ירוק רציף). גירוי מבוסס EMG R2 = 0.55, גירוי אופטימלי R2 = 0.91. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת ניסויי ה-"avatar" היא לשחזר את ייצור הכוח והתפוקת העבודה in vivo בצורה המדויקת ביותר האפשרית במהלך ניסויי לולאות עבודה ex vivo. במחקר זה נבחר להשתמש בשריר ה-EDL של עכבר כ-"avatar" עבור שריר ה-MG של חולדה, מכיוון ששני השרירים הללו מורכבים בעיקר משרירים בעלי התכווצות מהירה20,21. שני השרירים הם מניעים עיקריים של מפרק הקרסול (EDL הוא dorsiflexor של הקרסול, MG הוא plantarflexor של הקרסול) עם זוויות פנציה דומות (EDL של עכבר 12.4 + 2.12°

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעוד שאורגניזמים נעים בצורה חלקה על פני נופים, העומסים והמתחים הבסיסיים שהשרירים חווים משתנים באופן דרסטי 1,6,23. הן במהלך תנועה in vivo 1,24 והן בניסויי "אווטאר", השרירים מגורים באופן תת-מקסימלי בתנאים מחזוריים ולא יציבים. יחסי הכוח-אורך האיזומטרי והכוח-מהירות האיזוטוניים אינם מתאימים היטב לחיזוי כוח השריר בתנאים אלה2. הבנת ההשפעות של מת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מודים שאין ניגוד אינטרסים.

תודות

אנו מודים לד"ר ניקולאי קונאו על שסיפק את הנתונים ששימשו במחקר זה. ממומן על ידי NSF IOS-2016049 ו-NSF DBI-2021832.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר משי קלוע שאינו נספג 4-0 מרסילק 734H
סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2)סיגמא-אולדריץ1086436קרבס-הנסליט  תמיסה
: דקסטרוז סיגמא-אולדריץ'D9434קרבס-הנסלייט  פתרון
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  תמיסה
: חומצה הידורכלורית (HCl) סיגמא-אולדריץ'1.37055קרבס-הנסלייט  פתרון
LabView איסוף נתונים (
MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  תמיסה
אשלגן כלורי (KCl) סיגמא-אולדריץ'P3911קרבס-הנסלייט  תמיסה
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  פתרון
S88 דשא ממריץM643H05זמין לרכישה במערכת
המנוף מסדרת Ebay 300BAurora1200Aכולל אמבט רקמות מעטפת מים
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  תמיסה
נתרן כלורי (NaCl) סיגמא-אולדריץ'S9888קרבס-הנסלייט  תמיסה
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'S5881קרבס-הנסלייט  פתרון
עכברים מסוג ברמעבדת ג'קסוןB6C3Fe a/a Ttn mdm/J
' מגנזיום גופרתי

מקורות

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561(2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242(2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312(2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721(2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669(2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019(2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שריר In Vivoייצור כוח שרירימסלולי מאמץאקטיבציה עצביתמכניקה של השרירמחזורי מתיחה-קיצוראותים אלקטרומיוגרפייםמנוע סרוודינמיקת התניידות
"אווטאר", ניסויי לולאת עבודה ex vivo מותאמים באמצעות מתח והפעלה in vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.