Method Article

יישום של ניתוח זרימה ציטומטרית למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים תלת מימדיים במוח

DOI:

10.3791/65621

⸱

August 4th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדווח על שיטה ייחודית של שימוש בציטומטר זורם ונוגדנים מרובים להערכה בו-זמנית של פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל שינויים בנפח המיטוכונדריה, כמויות של תת-יחידות מורכבות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ושכפול DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא תורם ראשוני או משני שכיח לסוגים רבים של ניוון עצבי, ושינויים במסה המיטוכונדריאלית, קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ומספר עותק ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) מופיעים לעתים קרובות בתהליכים אלה. אורגנואידים של מוח אנושי שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מסכמים את הסידור הציטו-ארכיטקטוני התלת-ממדי של המוח ומציעים אפשרות לחקור מנגנוני מחלה ולסנן טיפולים חדשים במערכת אנושית מורכבת. כאן, אנו מדווחים על גישה ייחודית המבוססת על ציטומטריית זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC. דוח זה מפרט פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs, דיסוציאציה של תא בודד של אורגנואידים שנוצרו, קיבוע, צביעה וניתוח זרימה ציטומטרי לאחר מכן כדי להעריך פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-היחידה של קומפלקס MRC NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) או גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM) יחד עם ערוץ אניונים סלקטיבי תלוי מתח 1 (VDAC 1) מאפשר הערכה של כמות החלבונים הללו למיטוכונדריון. מכיוון שכמות ה-TFAM תואמת את כמות ה-mtDNA, היא מספקת הערכה עקיפה של מספר עותקי ה-mtDNA לכל תוכן מיטוכונדריאלי. ניתן להשלים את כל ההליך הזה תוך 2-3 שעות. באופן מכריע, הוא מאפשר כימות בו-זמני של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל רמות כוללות וספציפיות ביחס למסה המיטוכונדריאלית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים תאיים חיוניים והאתר העיקרי של ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP). מעבר לאספקת אנרגיה לתאים, המיטוכונדריה גם משתתפת בתהליכים תאיים מרובים, כולל העברת מידע תאי, התמיינות תאים ואפופטוזיס, ויש לה את היכולת לווסת את צמיחת התאים ואת מחזור התאים. זוהו שינויים בתפקוד המיטוכונדריה במחלות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD)1,2, מחלת אלצהיימר (AD)3 וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)4. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ממלא תפקיד בתהליך ההזדקנות, מצטבר מוטציות mtDNA סומטיות וירידה בתפקוד שרשרת הנשימה5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התמיינות של iPSCs לאורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכנת צלחות מצופות מטריצה
    1. הפשירו את הבקבוקון של מטריצת קרום הבסיס הזמינה מסחרית על קרח למשך הלילה. יש לדלל ל-1:100 בקור Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F12 DMEM/F12 של חזיר (ריכוז סופי של 1%). הכינו מינוסים ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים).
    2. מפשירים את תמיסת מטריצת הממברנה ב-4 מעלות צלזיוס (שומרים על קור) ומצפים את מספר הבארות הנדרש (1 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. קח את הצלחת מהחממה ותן לה להגיע לטמפרטורת החדר (RT) (השאירו אות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מספק ייצוג דיאגרמטי של תהליך ההתמיינות והאסטרטגיות המשמשות לניתוח זרימה ציטומטרית. iPSCs אנושיים תורבבו בצלחות של 96 בארות שאינן נצמדות ליצירת EBs ולאחר מכן הועברו לצלחות 6 בארות שאינן דבקות כדי להשיג אורגנואידים קליפת המוח שגדלו במלואם. ההרכב התאי של האורגנואידים אומת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר צביעה חיסונית עם עצב16 וסמני גליה17. אורגנואידים פורקו לתאים בודדים כדי להקל על מדידה מבוססת ציטומטריה של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs אנושיים ולביצוע ניתוח זרימה ציטומטרי של פרמטרים מיטוכונדריאלים בתאים בודדים שבודדו מהאורגנואידים הללו. ההרכב התאי של האורגנואידים אומת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני תאי עצב וגליה. הוכח כי האסטרטגיה המבוססת על ציטומטריית זרימה יחד עם אנטי-NDUFB10, VDAC 1 ו-TFAM מאפשרת מדידה של רמות ספציפיות של קומפלקס I ו-mtDNA ביחס למספר המיטוכונדריה בתא. פרוטוקול זה מתאים למדידת מיטוכונדריה בכל סוגי התאים דמויי המוח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מביעים את תודתנו הכנה לגארת' ג'ון סאליבן מהמכון למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת אוסלו, נורבגיה, על שסיפק לנו בנדיבות את קו התאים AG05836 (RRID:CVCL_2B58). אנו מודים באדיבות למרכז ההדמיה המולקולרית, מתקן הליבה של ציטומטריית זרימה באוניברסיטת ברגן בנורבגיה. עבודה זו נתמכה על ידי המימון הבא: K.L נתמכה בחלקה על ידי אוניברסיטת ברגן Meltzers Høyskolefonds (מספר פרויקט: 103517133) ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (מספר פרויקט: 103816102). L.A.B נתמכה על ידי מועצת המחקר הנורווגית (מספר פרויקט: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדנים המשתמשים בזרימה ציטומטריה
אנטי-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologicalsNBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647טכנולוגיית סנטה קרוזsc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L / D ניתן לתיקון קרוב IR ערכת כתמי תאים מתיםtechnologiesL10119
נוגדנים המשתמשים בצביעה אימונופלואורנטית
נגד Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
קמח אנטי-אלקסה 488תרמו פישר סיינטיפיקA28175
קמח אנטי-אלקסה 594תרמו פישר סיינטיפיקA-21442
<תאים מסחריים>חזקים
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)סופק על ידי גארת' ג'ון סאליבן מהמכון למדעי הרפואה הבסיסיים ב אוניברסיטת אוסלו, נורווגיה
Essential 8 Medium (מדיום תרבית iPSC)
Essential 8 Basal Medium תזונה Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
ב-4 מעלות; C ולחמם ל-RT לפני השימוש.
<חזק>מכשירים
Heracell 150i CO2 אינקובטוריםפישר סיינטיפיק, ארה"ב
שייקרים אורביטליים - SSM1, SSL1סטיוארט ציוד, בריטניה
CCD מיקרוסקופ מצלמה Leica DFC3000G Leica Microsystems, גרמניה
אמבט מים Jb אקדמיה בסיסי Jba5 JBA5 מענק מכשיריםמענק מכשירים, ארה"ב
מערכת שאיבת נוזלים בקרת BVCVacuubrand, גרמניה
Leica TCS SP8 STED מיקרוסקופ קונפוקליLeica Microsystems, גרמניה
50 מ"ל צינור בזSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, ארה"ב
ניתוח דגימת FlowjoFlowJo LLC, ארה"ב
10 מ"ל פיפטהסיגמא-אולדריץ'SIAL1100
1, 10, 100, 1000 מ"ל פיפטהסיגמא-אולדריץ'
40 ומיקרו; m Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
חיבור נמוך במיוחד צלחת 96 בארותS-BIOMS-9096UZ
Countess II מונה תאים אוטומטיThermo Fisher מדיום
<חזק>עצבי  (NDM+)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasalmedium Life technologies 2110349
תוסף Glutamax 1% (v/v)Life technologies35050
תוסף N2 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
תוסף B27 1% (v/v)Life טכנולוגיות17504-044
&בטא;-מרקפטואתנול 50 ומיקרו; Mסיגמא-אולדריץ'M3148
BDNF 20 ננוגרם/מ"לפפרוטק450-02
חומצה אסקורבית 200 ומיקרו; מסיגמא-אולדריץ' חנות A92902
ב-4° C למשך עד שבועיים
<חזק>מדיום התמיינות עצבית מינוס ויאטמין A (NDM-)
DMEM/F12טכנולוגיות חיים11330032
מדיום נוירובזאליטכנולוגיות חיים2110349
תוסף גלוטמקס 1% (v/v)Life technologies35050
תוסף N2 0.5% (v/ v)טכנולוגיות חיים17502-048
B27 תוספת ללא ויט. 1% (v/v)Life Technologies12587010
&בטא;-מרקפטואתנול 50 ומיקרו; חנות MSigma-aldrichM3148
ב-4° C למשך עד 8 ימים
<חזק>מדיום אינדוקציה עצבית (NIM)
DMEM/F12טכנולוגיות חיים11330032
תחליף סרום נוקאאוט 15% (v/v)טכנולוגיות חיים10828028
תוסף גלוטמקס 1% (v/v)טכנולוגיות חיים35050
β- מרקפטואתנול 100 ומיקרו; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 ננומטרStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 ומיקרו; MTocris1614
XAV939 2 ומיקרו; חנות MSigma-AldrichX3004
ב-4° C למשך עד 10 ימים
<חזק>מדיום נטרול
IMDMטכנולוגיות חיים21980032
FBS 10%סיגמא-אולדריץ'12103C
<חזק>ריאגנטים אחרים
DPBS (ללא Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific14190250
סרום בקר אלבומיןEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife טכנולוגיותA11105-01
GeltrexLife טכנולוגיותA1413302
טכנולוגיות EDTALife 15575038
טכנולוגיותDMEM / F12 Life מתקדמות12634010
רקמות עצביות ערכת דיסוציאציהMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 מעכב סלע דיהידרוכלורידBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ הרכבה בינוניתSouthernBiotech0100-20
PFAתרמו פישר סיינטיפיק28908
Life תוסף התמיינות מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBrain OrganoidsMitochondrial ParametersiPSC Derived OrganoidsMitochondrial DysfunctionSingle Cell DissociationMitochondrial MassMRC ComplexesTFAM StainingmtDNA Copy Number
Video Coming Soon

Related Articles