מאמר שיטה

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

DOI:

10.3791/65647

⸱

23 באוגוסט 2024

 ,  ,  , 
1Kindstar Global Technology Inc., 2Yongzhou Central Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת ניטור מחלה שיורית מינימלית (MRD) לאחר טיפול בגידול, ישנן דרישות גבוהות יותר של הגבול התחתון של גילוי מאשר בעת גילוי מוטציות עמידות לתרופות ומוטציות תאי גידול במחזור במהלך הטיפול. ריצוף סנגר מסורתי כולל 5%-20% זיהוי מוטציות מסוג פרא, כך שמגבלת הגילוי שלו אינה יכולה לעמוד בדרישות המתאימות. טכנולוגיות החסימה מסוג פרא שדווח כי התגברו על כך כוללות הגברת תזוזה חוסמת (BDA), חומצת גרעין נעולה שאינה ניתנת להארכה (LNA), בדיקות ספציפיות לנקודה חמה (HSSP) וכו '. טכנולוגיות אלה משתמשות ברצפי אוליגונוקלאוטידים ספציפיים כדי לחסום סוג פראי או לזהות סוג פראי ולאחר מכן משלבות זאת עם שיטות אחרות כדי למנוע הגברה מסוג פראי ולהגביר הגברה מוטנטית, מה שמוביל למאפיינים כמו רגישות גבוהה, גמישות ונוחות. פרוטוקול זה משתמש ב- BDA, PCR חוסם מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%, מה שיכול לספק בסיס לניטור MRD של לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלה שיורית מינימלית (MRD) היא המספר הקטן של תאים סרטניים שעדיין נמצאים בגוף לאחר הטיפול. בשל מספרם הקטן, הם אינם מובילים לסימנים או תסמינים פיזיים כלשהם. לעתים קרובות הם אינם מזוהים בשיטות מסורתיות, כגון הדמיה מיקרוסקופית ו / או מעקב אחר חלבונים חריגים בסרום בדם. תוצאת בדיקת MRD חיובית מצביעה על נוכחות של תאים חולים שיורית. תוצאה שלילית פירושה כי תאים חולים שיורית נעדרים. לאחר טיפול סרטני, התאים הסרטניים הנותרים בגוף יכולים להיות פעילים ולהתחיל להתרבות, גרימת הישנות המחלה. גילוי MRD מעיד על כך שהטיפול לא היה יעיל לחלוטין או שהטיפול לא היה שלם. סיבה נוספת לתוצאות MRD חיוביות לאחר הטיפול עשויה להיות שלא כל התאים הסרטניים הגיבו לטיפול או מכיוון שהתאים הסרטניים הפכו עמידים לתרופות המשמשות1.

לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T (באנגלית: Angioimmunoblastic T-cell lymphoma או AITL) היא תת-סוג של לימפומה היקפית של תאי T פוליקולריים (PTCL) שמקורה בתאי עזר פוליקולרייםמסוג T 2; זהו הסוג הנפוץ ביותר של לימפומה של תאי T, המהווה כ 15%-20% של PTCL3. זוהי קבוצה של ממאירויות הקשורות המשפיעות על מערכת הלימפה. תא המקור הוא תא עוזר T פוליקולרי. סיווג 2016 של ארגון הבריאות העולמי מסווג אותו כלימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T4. בשנת 2022, ארגון הבריאות העולמי שינה את שמו ללימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, מסוג אנגיואימונובלסטי (nTFHL-AI), יחד עם לימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, סוג פוליקולרי (nTFHL-F) ולימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, שלא צוין אחרת (nTFHL-NOS), המכונים ביחד לימפומה של תאי T מסייעים פוליקולרית נודולרית (nTFHL). זה נעשה כדי לזהות את התכונות הקליניות והאימונופנוטיפיות החשובות שלו וחתימות ביטוי גנים ומוטציות דומות של עוזר זקיקי T (TFH). מבחינה גנטית, nTFHL-AI מאופיין ברכישה מתקדמת של מוטציות סומטיות בתאי גזע המטופויטיים מוקדמים באמצעות מוטציות TET2 ו- DNMT3A, בעוד שמוטציות RHOA ו- IDH2 קיימות גם בתאי גידול TFH5. מספר מחקרים הראו כי מוטציית RHOA G17V מתרחשת ב 50%-80% מחולי AITL 6,7,8,9. חלבון RHOA המקודד על ידי הגן RHOA מופעל על ידי קישור גואנוזין טריפוספט (GTP) ומנוטרל על ידי קישור גואנוזין דיפוספט (GDP). כאשר הוא מופעל, הוא יכול להיקשר למגוון חלבונים משפיעים ולווסת מגוון תהליכים ביולוגיים. מבחינה פיזיולוגית, RHOA מתווך נדידה וקוטביות של תאי T, ממלא תפקיד בהתפתחות תימוציטים, ומתווך הפעלה של איתות קולטן תא קדם-T (pre-TCR)10. מוטציית RHOA G17V היא מוטציה של אובדן תפקוד הממלאת תפקיד מניע בפתוגנזה של לימפומה11. זיהוי המוטציה בתדר נמוך מועיל לניטור MRD של AITL.

ריצוף סנגר משמש כבר יותר מ-40 שנה כתקן הזהב לאיתור מוטציות ידועות ולא ידועות. עם זאת, מגבלת הגילוי שלו היא רק 5%-20%, מה שמגביל את היישום שלו לגילוי מוטציות בתדר נמוך12,13. בריצוף סנגר ניתן להפחית את רגישות הזיהוי ל-0.1% על ידי החלפת ה-PCR המסורתי ב-BDA, טכנולוגיית חסימה פראית14. טכנולוגיית BDA מוסיפה בעיקר פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי כדי להשיג את המטרה של הגברת הסוג המוטנטי. המפתח לעיצוב פריימר הוא פריימר לא תואם ושינוי הטרמינל. יחד עם זאת, על פי העיקרון המבני של הדנ"א, ההבדל בין האנרגיה החופשית של גיבס של שני הפריימרים הוא בין 0.8 קק"ל/מול לבין 5 קק"ל/מול. צעד מפתח נוסף בטכניקה זו הוא דיכוי הגברה מסוג פרא על ידי התאמת היחס בין פריימרים מסוג פרא וחסימת פריימרים14,15.

כיום, טכניקות נפוצות לזיהוי מוטציות סומטיות בתדר נמוך כוללות PCR ספציפי לאלל מבוסס PCR (תגובת שרשרת פולימראז ספציפית לאלל, ASPCR), מערכת מוטציות עמידה להגברה PCR (מערכת מוטציות עקשנית להגברה-PCR, ARMS-PCR) המשמשת לגנוטיפ SNP בעזרת פריימרים עקשנים. תכנון פריימרים לאללים המוטנטיים והנורמליים מאפשר הגברה סלקטיבית ו-PCR דיגיטלי (Droplet Digital PCR, ddPCR), שיטה לביצוע PCR דיגיטלי המבוססת על טכנולוגיית תחליב טיפות מים-שמן16. הדגימה מחולקת ל-20,000 טיפות, ועבור כל טיפה, הגברה PCR של מולקולות התבנית נעשית ברגישות של 1 x 10-5; הגברה של תזוזה חוסמת (BDA) היא גם שיטת העשרת אללים נדירים מבוססת PCR המשמשת לזיהוי וכימות מדויקים של SNV ואינדלים עד 0.01% VAF בסביבה מרובבת מאוד; טכנולוגיית חומצות גרעין נעולות (באנגלית: Locked Nucleic Acid Technology, LNA) היא סוג של אנלוגים של RNA בעלי זיקה גבוהה שבהם טבעת הריבוז נעולה בקונפורמציה האידיאלית לקשירת ווטסון-קריק; גשושיות ספציפיות לנקודה חמה (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), חופפות את רצף פריימר המטרה, כוללות מוטציה יחידה, ומשנות עם מרווח C3 בקצה C3' כדי למנוע הגברה על ידי qPCR 14,16,17,18. כאשר קיימת מוטציה ברצף, HSSP מתחבר באופן תחרותי למוטציית המטרה ומונע מהפריימר להיקשר לרצף מוטנטי המטרה אשר מפסיק את הגברת הרצף; NGS (ריצוף הדור הבא) - ריצוף אימונוגלובולין מבוסס תפוקה גבוהה (igHTS) סרטן פרופיל מותאם אישית על ידי ריצוף עמוק (CAAP-seq), זוהי שיטה מבוססת ריצוף הדור הבא המשמשת לכימות DNA במחזור בתאים סרטניים (רגישות היא 1 x 10-4); וכו. ביניהם, רוב השיטות מבוססות על PCR ויכולות לזהות רק מספר קטן של אתרי מוטציה, והשיטות מבוססות NGS יכולות לזהות אתרים מרובים, אך העלות גבוהה, והתהליך מסובך 14,16,17,18. היו דיווחים על זיהוי מוטציות בתדר נמוך RHOA G17V בהתבסס על qPCR, אך מגבלת הזיהוי יכולה להגיע רק לכ -2% 19. אין דיווח על זיהוי מוטציה בתדר נמוך RHOA G17V בהתבסס על ריצוף Sanger. כאן, אנו מדגימים את העלייה ברגישות שהושגה על ידי BDA, בלוק PCR מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%. נתונים נוספים עבור IDH2 ו- JAK1 מסופקים גם כן.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט של סכמת זיהוי תדר נמוך RHOA G17V על ידי ריצוף Sanger ומספק התייחסות לפיתוח זיהוי מוטציות בתדר נמוך יותר המבוסס על פלטפורמת ריצוף Sanger. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות ולנטר מוטציות עמידות אפשריות לתרופות ושאריות מינימליות בגידולים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המרכזי יונגג'ואו (מספר אישור: 2024022601). המשתתפים נתנו הסכמה מדעת.

1. עיצוב פריימר

  1. עיצוב פריימר קונבנציונלי: עיצוב פריימרים על פי כללי עיצוב פריימר20 המדווחים, עיצוב פריימר על ידי NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). עבור אתר המוטציה של RHOA G17V, כל רצפי הייחוס לתכנון פריימרים קונבנציונליים הם רצף הבסיס שעבר מוטציה. ודא שהפריימרים המתוכננים להגברה הפוכה מכילים את רצף אתר המוטציה וטמפרטורת החישול של הפריימרים היא כ- 60 מעלות צלזיוס.
  2. עיצוב פריימר BDA
    1. תכננו את פריימר החסימה הפראית באורך של כ-20-30 זוגות בסיסים (bp), המכיל 2-4 בסיסים מותאמים, ואת הבסיסים שהשתנו המורכבים מ-A ו-T. ודאו שלפריימר החוסם יש 6-14 bp החופף לפריימר הגברת המוטציות, המשמש להתחרות בפריימר להגברת מוטציות.
    2. תכננו את הפריימר עם טמפרטורת חישול עבור פריימרים להגברה מוטנטית שתוכננה סופית ופריימרים חוסמי פרא שנקבעו על כ-60 מעלות צלזיוס, וההבדל באנרגיה החופשית של גיבס בין 0.8-5 קק"ל/מול. לכללי חישוב מפורטים, עיין בספרות15.
      הערה: כאשר הפריימרים המתוכננים אינם עומדים בתנאים לעיל, ניתן להוסיף או להחסיר בסיסים באופן ידני לצורך התאמה. רשימת הפריימר המעוצבת הסופית מוצגת בטבלה 1 ובטבלה 2.

2. הכנת דגימות ומיצוי DNA

הערה: דגימות אימות ניסיוניות מגיעות כולן מדם היקפי, מח עצם או דגימות גידול מוצק של חולי לימפומה אנושית. נמצאו 10 דגימות חיוביות: 3 היו דגימות גידול מוצק, 4 דגימות מח עצם ו-3 דגימות דם היקפיות. יש 30 דגימות שליליות מאנשים בריאים.

  1. מיצוי דגימות מח עצם ודם היקפי
    1. הוסף 400 μL של מח עצם או דגימת דם היקפית ריאגנטים לתוך צינורות המתאימים על פי הדרישות לחלץ על פי הליך המיצוי של היצרן.
    2. הכינו צינורות מדגם חדשים וצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל. מספר את צינורות הדגימה מ 1-24. סמן את כיסויי הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם שם הדגימה ותאריך החילוץ לפי סדר השמות בצינורות איסוף הדם המתאימים. סמן 1-24 בצד צינור המיקרוצנטריפוגה לבדיקת התכתבות אחד על אחד.
    3. הוסף 40 μL של תמיסת proteinase K לצינור הדגימה והוסף 400 μL של דגימת דם שלמה (עבור נפחים פחות מ 400 μL, מלא ל 400 μL עם PBS).
    4. שים את צינור הדגימה (1-24), קצה פיפטה (כולל כיסוי פיפטה) וצינור איסוף במיקומים המתאימים. לחלץ DNA בהתאם לנוהל היצרן.
  2. חילוץ דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE)
    1. הכניסו את הדגימות והריאגנטים לצינורות המתאימים בהתאם לדרישות וחלצו בהתאם לנוהל המיצוי של היצרן.
    2. הוסף 1.1 מ"ל של מאגר אחסון פרוטאינאז K (תמיסת PK) לאבקה היבשה של פרוטאינאז K, מערבולת, וערבב היטב לקבלת תמיסת פרוטאינאז K בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
    3. הוציאו את תמיסת פרוטאינאז K והמיסו אותה לחלוטין בטמפרטורת החדר. הפעל את התרמוסטט היבש וקבע את הטמפרטורה על 55 °C.
    4. קח צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וכתוב עליו את שם המדגם. קח פחות מ 30 מ"ג של רקמה ולשים אותו לתוך צינור microcentrifuge. לאחר מכן, הוסף 500 μL של מאגר Deparaffin ו 20 μL proteinase K פתרון לצינור.
    5. לאחר ערבוב מערבולות במשך 10 שניות לפחות, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה בתרמוסטט יבש ושמרו אותו חם בטמפרטורה של 55°C למשך 90 דקות.
    6. ודא שעמודת הסחיטה מתאימה לצינור המסנן. לאחר השלמת הדגירה, העבירו את הדגימה, כולל נוזל ורקמות, לעמודת הספין. צנטריפוגה ב 16,500 x גרם במשך 5 דקות כדי לצנטריפוץ את כל הנוזל לתוך צינור המסנן.
    7. קח שפופרת דגימה אחת (ללא מכסה) המצורפת לערכה וכתוב עליה את שם הדגימה. העבר את הנוזל מצינור המסנן 400 μL לצינור הדגימה.
    8. לאחר השלמת הטיפול המקדים וההכנה של הדגימה, מניחים את החומרים המתכלים והריאגנטים המתאימים במיקומים המתאימים ומבצעים מיצוי DNA בהתאם להוראות היצרן.
  3. בקרת איכות DNA
    1. למדוד את הריכוז והטוהר של הדנ"א המופק ולוודא שריכוז הדנ"א הוא ≥ 25 ננוגרם/מיקרוליטר. רשום את ריכוז הדנ"א של כל דגימה והשתמש מיד לגילוי לאחר מכן או קפא בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: ערכי OD260/OD280 משמשים בדרך כלל לבדיקת טוהר דגימות DNA. הערך הנורמלי OD260/OD280 הוא בערך 1.7-1.9, מה שמצביע על כך שטוהר הדנ"א טוב; אם הערך OD260/OD280 הוא ≤1.7, הדבר מציין שייתכן שיש זיהום חלבון; אם הערך OD260/OD280 הוא ≥2.0, הדבר מציין שייתכן שיש זיהום ב-RNA או שה-DNA הושפל.

3. הגברה PCR

  1. הכנת פריימרים
    1. הכנת תמיסת מלאי פריימר
      1. הוציאו את האבקה היבשה והצנטריפוגה במשקל 5400-8400 x גרם למשך 2-3 דקות. בדוק את ערך nmol של פריימר ופתח לאט את המכסה. באמצעות פיפטה עם נפח המתאים של מים מזוקקים כפול (ddH2O), שהוא 10x של ערך nM, להוסיף אותו לאט לאורך הקיר של צינור פריימר.
      2. הכינו פריימרים בתמיסת מלאי של 0.1 ננומטר/מיקרומטר או 100 מיקרומטר (למשל, ערך הננומטר הוא 21.1; בהתאמה, המים שיש להוסיף הם 211 מיקרוליטר). מערבבים היטב, ואז צנטריפוגות לזמן קצר כדי להבטיח שהתמיסה תגיע לתחתית כל באר. כתוב את שם הפריימר, נתוני התצורה ואיש התצורה על מכסה הצינור. הכנס אותו למיקום האחסון המתאים של פתרון המלאי.
    2. הכנת פתרון עבודה פריימר
      1. פיפטה 5 μL של פריימר קדמי, 5 μL של פריימר הפוך, 50 μL של תמיסת מלאי פריימר wildtype, ו 40 μL של ddH2O בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. פיפטה שוב ושוב 2x-3x, מערבולת לערבב, ולהסתובב מיד.
      2. כתוב את שם הפריימר, תאריך התצורה והאדם שהגדיר אותו על מכסה הצינור והכניס אותו למיקום האחסון המתאים של פתרון העבודה.
  2. הליך הגברה PCR
    1. עבור כל תגובה, הוסף 5 μL של תערובת מאסטר אנזים להגברת PCR, 1 μL של תמיסת עבודה פריימר ו- 1 μL של תבנית DNA (כמות קלט התבנית צריכה להגיע ל- 400 ng, אם ריכוז ה- DNA אינו מספיק; להגדיל את נפח ה- DNA ולהפחית את נפח ddH2O נוסף) ו- 3 μL של ddH2O. מערבולת כדי לערבב ולהסתובב באופן מיידי.
    2. שים את צינור תגובת ה- PCR במכשיר ה- PCR שנקבע מראש להגברת PCR. הגדר את תוכנית המחזור התרמי של מכשיר ה- PCR כדלקמן והפעל:
      95 °C למשך 3 דקות; 20 מחזורים של 95 ° C במשך 30 שניות, 68 ° C במשך 15 s (ירידה של 0.5 ° C לכל מחזור), 72 ° C במשך 1 דקות; 16 מחזורים של 95 °C במשך 30 שניות, 58 °C במשך 15 שניות, 72 °C למשך דקה אחת; ו 72 ° C במשך 10 דקות.
  3. בצע אלקטרופורזה ג'ל על מוצר PCR עם 2% agarose כדי לבדוק אם מקטע המטרה מוגבר.
  4. טיהור מוצרי PCR
    1. הביאו את purificase I ואת purificase II לטמפרטורת החדר וסובבו מיד. הכן את תגובת טיהור המוצר PCR כדלקמן: 1 μL של purificase I, 0.5 μL של purificase II, 3 μL של מוצר PCR, ו 3.5 μL של ddH2O.
    2. שים את צינור תגובת ה- PCR במכשיר ה- PCR שנקבע מראש להגברת PCR. הגדר את תוכנית המחזור התרמי של מכשיר ה- PCR כדלקמן והפעל את המכונה:
      37°C למשך 30 דקות, 95°C למשך 15 דקות.

4. ריצוף מוצרי PCR לאחר טיהור

  1. רצף
    1. הביאו את תערובת מאסטר אנזים ההגברה לריצוף, חיץ ו-ddH2O לטמפרטורת החדר. לאחר שהמגיב נזל, יש לבצע ספין-אוף באופן מיידי.
    2. הכן את מערכת תגובת הרצף באופן הבא: 1.8 μL של מאגר ריצוף, 0.4 μL של תערובת מאסטר אנזים הגברה ריצוף, 1 μL של פריימר ריצוף, 0.8 μL של מוצר PCR מטוהר, ו 6 μL של ddH2O.
    3. שים את צינור תגובת ה- PCR במכשיר ה- PCR שנקבע מראש להגברת PCR. הגדר את תוכנית המחזור התרמי של מכשיר ה- PCR כדלקמן והפעל: 96 ° C למשך 3 דקות; 28 מחזורים של 96°C למשך 25 שניות, 56°C למשך 15 שניות, 60°C למשך 4 דקות.
    4. לאחר סיום תגובת הריצוף, הסר את המוצר ממכשיר ה- PCR. יש לאחסן מוצרי תגובה במקרר, מוגנים מפני אור.
  2. טיהור מוצרי ריצוף
    1. מערבלים היטב את החרוזים המגנטיים. הוסף 10 μL של חרוזים מגנטיים ו 40 μL של 80% אלכוהול לצלחת 96 באר ואטום את הצלחת עם סרט.
    2. הניחו את צלחת 96 הבארות עם חרוזים מגנטיים ואלכוהול על שייקר המערבולת למשך 10 שניות כדי להשהות ולערבב לחלוטין את החרוזים המגנטיים (שימו לב אם יש משקעים של חרוזים מגנטיים בתחתית והיזהרו לא לקבל את הנוזל על סרט האיטום). שים אותו על מתנד אופקי וקשר אותו עם גומייה לרטוט במשך 3-5 דקות (הילוך מרבי).
    3. לאחר תנודה, לשים את צלחת PCR על מעמד מגנטי, לשים לב ללחוץ אותו בחוזקה. השאירו את המעמד בטמפרטורה של 4°C לספיחה סטטית למשך 3 דקות, ולאחר שכל החרוזים המגנטיים נספגו על הקיר, הסירו את סרט האיטום ושפכו את נוזל הפסולת.
    4. הוסיפו 40 מיקרוליטר של 80% אלכוהול לצלחת ה-PCR, שטפו את החרוזים ושפכו את נוזל הפסולת. הניחו את הצלחת על נייר סופג וטפחו עליה בעדינות (אין לתת ללוחית ה-PCR להיפרד מהדיסק). חזור על הפעולה 1x.
    5. שים את נייר הספיגה הפוך יחד עם הלוח המגנטי לתוך הצנטריפוגה ב 120 x גרם לסיבוב מהיר.
    6. מכניסים את צלחת ה-PCR המכילה את החרוזים המגנטיים לאחר הוצאת האלכוהול לתנור ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. יבשו את החרוזים לחלוטין.
      הערה: אם אין תנור, מניחים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    7. יש להוסיף 40 מיקרוליטר מים טהורים לאחר הייבוש. מניחים את סרט האיטום על הצלחת ומנערים אותו על שייקר מערבולת למשך 3-5 שניות. הניחו את הצלחת על שייקר אופקי, קשרו אותה היטב ונערו אותה במשך 3-5 דקות כדי להמיס את מוצר הרצף המטוהר.
    8. סובב את מוצר הריצוף המומס ב- 180 x g והשתמש במוצר לניתוח גנומי באמצעות אלקטרופורזה נימית21 (שים לב שיש להוסיף את הדיסק התומך ללוח הדגימה).
  3. ניתוח תוצאות ריצוף
    1. השג את תוצאות הרצף מהתוכנה. עיין במדריך התוכנה לקבלת נהלי פעולה מפורטים. השתמש ברצף הייחוס של NCBI.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השווה את רצף דגימת הבדיקה לרצף הייחוס כדי לקבל את מצב המוטציה של דגימת הבדיקה. טכנולוגיית WBT-PCR מבוססת BDA יכולה לזהות את מוטציית RHOA G17V הידועה ומוטציות אחרות בתדר נמוך במרווח ההגברה של פריימרים במעלה ובמורד הזרם. ראו איור 1. שני גנים נוספים, כלומר IDH2 ו-JAK1, נותחו גם הם באמצעות השיטה הזאת, איור 2 ואיור 3, בהתאמה. התוצאות מראות כי שיטה זו רגישה למדי באיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

כרומטוגרמה של רצף DNA; PCR מסורתי לעומת WBT-PCR המציג השוואה לזיהוי מוטציות RHOA.
איור 1: תוצאת ריצוף עבור RHOA. מלמעלה למטה, האיור מראה את מוטציית הבסיס של אתר RHOA G17 המוגברת על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברת PCR מסורתית המתאימה ל- RHOA G17 מסוג פראי. התמונה האמצעית מראה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.50G>T לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הגילוי היא 0.5%. התמונה התחתונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.49-50delinsTT לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

WBT-PCR והשוואת כרומטוגרמה PCR מסורתית, c.515G>A זיהוי מוטציות, גן IDH2.
איור 2: תוצאת ריצוף עבור IDH2. מלמעלה למטה, האיור לעיל מראה את מוטציית הבסיס של אתר IDH2 R172 המוגברת על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברה מסורתית של PCR המתאימה ל- IDH2 R172 מסוג פראי. התמונה העליונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.515G>A לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואת ריצוף DNA, WBT-PCR לעומת PCR מסורתי עבור תרשים ניתוח מוטציות JAK1.
איור 3: תוצאת ריצוף עבור JAK1. מלמעלה למטה, האיור לעיל מראה את מוטציית הבסיס של אתר JAK1 S703 שהועצמה על ידי WBT-PCR ואת תוצאות הריצוף לאחר הגברה מסורתית של PCR המתאימה ל- JAK1 S703 מסוג פראי. התמונה העליונה מציגה את תוצאות הריצוף של מוטציית c.2108G>T לאחר הגברה עם פריימרים WBT-PCR כאשר רגישות הזיהוי היא 0.5%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תחלרצף פריימר
RHOA-VFATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-VRGCTGAAGACTATGAGCAAGCA
RHOA-WTBAGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA
פריימר ריצוףATAACCTTTTGGTGCCAGGT

טבלה 1: רשימת הפריימר המעוצבת הסופית של RHOA.

פריימר IDH2 R172
תחלרצף פריימר
IDH2-VFCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VRTACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTBGCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
פריימר ריצוףCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
פריימר גן JAK1
תחלרצף פריימר
JAK1-VFACTCTGAGGCCGAGTGTGT
JAK1-VRCCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTBGGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
פריימר ריצוףACTCTGAGGCCGAGTGTGT

טבלה 2: רשימת הפריימר המעוצבת הסופית של IDH2 ו - JAK1.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WTB-PCR המבוסס על טכנולוגיית BDA, המתואר במאמר זה, מציג פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי, לדכא את הסוג הפראי ולהגביר את המוצר המוטנטי. לאחר מכן, מוצרי WTB-PCR רוצפו לניתוח מוטציות. השירות של WTB-PCR / Sanger הוא הפשטות והרגישות הגבוהה שלו. על פי סכמת הזיהוי שנקבעה במאמר זה, ניתן להוסיף את רוב הבדיקות הקיימות מבוססות סנגר עם פריימרים מדכאים באמצעות BDA, ובכך להגביר את רגישות האיתור. מוטציית RHOA G17V שהוצגה במאמר זה רוצפה על ידי ריצוף Sanger לאחר WTB-PCR המבוסס על טכנולוגיית BDA. כאשר כמות הקלט של הדנ"א מגיעה ל-400 ננוגרם, רגישות הזיהוי יכולה להגיע ל-0.5% או אפילו ל-0.1%. רגישות הזיהוי של גנים שונים צריכה להיות מאושרת על ידי כמות קלט ה- DNA, רצף גנים וכו '.

המפתח WTB-PCR הוא עיצוב של פריימרים, וטכנולוגיה זו יכולה לזהות רק מוטציות ידועות. מאמר זה מתאר יישום של טכנולוגיה זו בריצוף Sanger. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם על ריצוף הדור הבא, PCR כמותי, וכו ', וזה יכול לשמש גם זיהוי PCR multiplex. WTB-PCR זה יכול להפחית את הגבול התחתון של שיטות זיהוי אלה וניתן ליישם אותו טוב יותר לניטור MRD. רוב השיטות המבוססות על PCR יכולות לזהות רק מספר קטן של אתרי מוטציה, ושיטות מבוססות NGS יכולות לזהות אתרים מרובים, אך העלות גבוהה, והתהליך מסובך 14,15,16,17,18. ל- WTB-PCR יש מאפיינים של רגישות גבוהה, עלות נמוכה וגמישות חזקה, מה שהופך אותו לבחירה אידיאלית לזיהוי מוטציות בתדר נמוך, מה שיכול לשפר מאוד את רגישות הזיהוי של ריצוף Sanger ויישומו בזיהוי MRD.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה הושלם בתמיכה כספית של Kindstar Global Corporation ובעזרתם של מנהיגי המעבדה לביולוגיה מולקולרית ועמיתים קשורים. תודה לחברה, למנהיגים ולעמיתים הרלוונטיים על התמיכה והעזרה. מאמר זה משמש למחקר מדעי בלבד ואינו מהווה פעילות מסחרית כלשהי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחלץ DNA אוטומטי9001301DNA Qiagen
Q32854תרמו פישר
P4600מכשיר PCR
C1000 מגעביורד
פרוטאינאז K תמיסתD3001-2-Aמחקר
zymo חלבון K מאגר אחסוןD3001-2-Czymo מחקר
ערכת אנזים הגברת ריצוףP7670-FINQiagen
גלאי חומצות גרעין ערכת הגברה PCR מרק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
  2. Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
  3. Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
  4. Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  5. Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
  6. Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
  7. Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).
  8. Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
  9. Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
  10. Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
  11. Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646(2019).
  12. Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  13. Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
  14. Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
  15. John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
  16. Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  17. Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
  18. Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597(2022).
  19. Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714(2014).
  20. Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  21. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים