הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65667

⸱

9 בפברואר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את ההליכים עבור FAM83A knockdown; הבדיקות לאיתור השפעותיו על התפשטות, הגירה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם; ואת הרגישות של תאים אלה כדי cisplatin. מחקר זה מספק גן מטרה מבטיח לסרטן צוואר הרחם והפניה למחקר תרופתי נוסף.

תקציר

חקר גני המטרה של הגידול הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסרטן צוואר הרחם. במחקר זה, אנו מתארים את השלבים הכרוכים בזיהוי גן מטרה לגידול FAM83A בסרטן צוואר הרחם. ראשית, מערך הנתונים של אטלס גנום הסרטן שימש כדי לאמת את הביטוי ואת המשמעות הפרוגנוסטית של FAM83A אצל נשים. RNA מפריע קטן (siRNA) שימש להפלה של הגן FAM83A בתאי HeLa ו-C33a . לאחר מכן, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) צביעה בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על יכולות ההתרבות של תאי הגידול. ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי בוצעו כדי להעריך את נדידת תאי הגידול ואת יכולות הפלישה.

כתם מערבי שימש לכימות רמות חלבון הקשורות לאפופטוזיס. צביעת JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. יתר על כן, נעשה שימוש בהתערבות cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP) כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של גן המטרה. בדיקות ציטומטריית זרימה והיווצרות מושבה נערכו כדי לאמת עוד יותר את המאפיינים האנטי-סרטניים של הגן. כתוצאה מכך, הוכח כי FAM83A מעכב התפשטות, נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם וגורם לרגישות תאים אלה לציספלטין. מתודולוגיות מקיפות אלה מאמתות באופן קולקטיבי את FAM83A כגן מטרה הקשור לגידול, וטומנות בחובן הבטחה כיעד טיפולי פוטנציאלי במניעה ובטיפול בסרטן צוואר הרחם.

מבוא

סרטן צוואר הרחם הוא דאגה עולמית מכיוון שהוא אחד הסוגים המובילים של ממאירות גינקולוגית בעולם והוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן בקרב נשים1. ניתוחים רדיקליים וכימותרפיה קשורים לשיעורי ריפוי גבוהים בשלב הראשוני. עם זאת, תוצאות הטיפול בחולות בשלב מתקדם של סרטן צוואר הרחם המפתחות מחלה גרורתית הן שליליות מאוד2. לכן, חיוני להבין עוד יותר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס ההגירה והפלישה של תאי סרטן צוואר הרחם ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות למניעה וטיפול במחלה זו.

זיהוי גני מטרה המעורבים בהתקדמות הסרטן ומציאת דרכים לעכב את ביטוים או פעולתם מציגים אפשרויות טיפול מבטיחות. במחקר זה זיהינו את FAM83 כגן הגורם לסרטן וחקרנו עוד יותר את ההשפעות המעכבות שלו על תאי C33a ו-HeLa. אונקוגנים ממשפחת FAM83 (FAM83A-H) מדווחים באופן נרחב בסרטן אנושי 3,4. לאחרונה דווח כי FAM83A מווסת בסרטן ריאות5, שד6, שחלות7 ולבלב8, דבר המצביע על כך ש-FAM83A ממלא תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן באמצעות קידום התפשטות, פלישה, תכונות דמויות תאי גזע ועמידות לתרופות בתאי הגידול. חשוב לציין כי FAM83A זוהה כאחד הגנים המועמדים החדשים הקשורים להתקדמות נגע צוואר הרחם ולסרטן9. למרות האישור של ביטוי מוגבר של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם האנושיים, ההשפעה הספציפית והמנגנונים הבסיסיים של FAM83A בסרטן צוואר הרחם עדיין אינם ברורים.

במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים המעורבים בזיהוי FAM83A כגן מטרה לגידול בסרטן צוואר הרחם ומשתמשים ב- RNA מפריע קטן (siRNA) להפלת הגן FAM83A בתאי HeLa ו - C33a . צביעת 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על התפשטות תאי הגידול, בעוד ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי סייעו להעריך נדידת תאי גידול ויכולות פלישה.

הקרישה המערבית בוצעה כדי לקבוע את רמות החלבונים הקשורים לאפופטוזיס, וצביעה של JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. לפיכך, דיווחנו כי FAM83A ממלא תפקיד קריטי בהתרבות תאים, גרורות ופלישה בסרטן צוואר הרחם. באמצעות הפרעות בתפקוד המיטוכונדריאלי הקשור למסלול PI3K/AKT ואפופטוזיס, FAM83A הפיל תאי סרטן צוואר הרחם רגישים לציספלטין (diaminedichloroplatinum, DDP). מחקר זה מספק יעד חדש לסרטן צוואר הרחם ואולי לסוגי סרטן אחרים והתייחסות לפיתוח אסטרטגיות להתגבר על עמידות תאי סרטן לתרופות כימותרפיות מסוימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר תאם לחלוטין את הנחיות הפרסום שסופקו על ידי TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ניתוח מקורות נתונים וביואינפורמטיקה

  1. קבל נתוני ריצוף RNA ממסד הנתונים של אטלס גנום הסרטן (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) לצורך ניתוח אשכולות. השתמש ב- GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), כלי מבוסס אינטרנט כדי לחשב מחדש נתוני RNA-Seq גולמיים של דגימות מפרויקטים של TCGA, כדי לסנן מטרות לתרופות מועמדות לסרטן עם צינור עיבוד סטנדרטי.
    הערה: אתר האינטרנט של GEPIA זמין באופן חופשי לכל המשתמשים.
  2. גש לדף הבית של אתר GEPIA ולחץ על ניתוח סוג סרטן, בחר באפשרות ניתוח גנים דיפרנציאלי והגדר את הפרמטרים הבאים: שם סרטן = CESE (מוגדר כקרצינומה של תאי קשקש צוואר הרחם ואדנוקרצינומה אנדוצרביקלית בדף זה), |Log2FC| חיתוך = 1, חיתוך ערך q = 0.01, שיטות דיפרנציאליות = ANOVA, והתפלגות כרומוזומלית = שניהם. לאחר מכן, לחץ על רשימה כדי לקבל רשימת גנים המראה ביטוי דיפרנציאלי בין הגידול לקבוצות נורמליות.
    הערה: זה דורש סקירת ספרות מקיפה כדי לזהות גנים מועמדים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. במחקר זה, בהתחשב ברקע מהספרות הזמינה, אנו מתמקדים בגן הגידול המעניין, FAM83A.
  3. לאחר מכן, בדוק את הביטוי של FAM83A בסרטן צוואר הרחם וברקמות נורמליות באמצעות GEPIA על ידי המשך לאפשרות ביטוי DIY באתר ובחר Boxplot כסוג התרשים. הזן FAM83A בשדה פרמטר הגן והגדר את הפרמטרים הבאים: |Log2FC| ערך חיתוך = 1; q-value Cutoff = 0.01. בחר CESE כשם הסרטן והתאם נתונים רגילים של TCGA עבור שדה הנתונים Matched Normal , תוך השארת כל ההגדרות האחרות כברירת מחדל. לחץ על Plot ואפשר לאתר ליצור boxplot המייצג את הביטוי הדיפרנציאלי של הגן FAM83A ; שמור את boxplot לעיון וניתוח עתידיים.
  4. לבסוף, לנתח את ההישרדות הכוללת של חולים הנושאים גידולים עם רמות שונות של ביטוי FAM83A בסרטן צוואר הרחם. נווט אל האפשרות חלקות הישרדות באתר, הגדר את הגן ל- FAM83A ובחר הישרדות כוללת כסוג הניתוח. הוסף את שם הגידול CESE, בחר חודשים עבור יחידות הציר והשאר את כל שאר הפרמטרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם. לחץ על התוויית אתר האינטרנט ותן לאתר ליצור תרשים עקומת הישרדות; שמור תרשים זה לעיון וניתוח עתידיים.
  5. יש לקחת בחשבון הן את הביטוי הדיפרנציאלי של FAM83A בגידולים והן את הקשר שלו עם ניתוח הישרדות המטופל כדי לזהות את FAM83A כגן מטרה טיפולי פוטנציאלי בסרטן צוואר הרחם.

2. ניסויים מבוססי תאים

  1. תרבית תאים
    1. תרבית שורות תאי גידול אנושיים בתווך שונה ב 37 ° C באטמוספירה לחה 5% CO2 .
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על קווי תאים ורכיבי מדיום תרבית.
  2. טרנספקציה של תאים
    1. השתמש ב- siRNA כדי להפיל ביטוי FAM83A בתאים.
      הערה: ראה טבלה 1 עבור רצף siRNA ספציפי.
    2. תאי זרעים בצלחות 6 בארות ודגרים עם תערובת של 50 ננומטר si-FAM83A או siRNA-NC ו 8 μL של סוכן transfection או רק 8 μL של סוכן transfection במשך 4-6 שעות לאחר השגת 50%-70% מפגש. הוסף DMEM ללא סרום בלבד לבקרה השלילית.
    3. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום המכיל את סוכן transfection עם DMEM + 10% סרום עגל העובר. יתר על כן, 48 שעות לאחר טרנספקציה, לטפל עם 5 מיקרומטר cisplatin (DDP) במשך 24 שעות כמתוכנן ולקצור את כל התאים עבור מיצוי RNA הכולל ניתוח qRT-PCR.

3. זיהוי EdU לבדיקת התפשטות תאים

הערה: השתמש בערכת התפשטות תאי EdU כדי להעריך את התפשטות התאים במבחנה בהתאם להוראות היצרן.

  1. זרעו את התאים בצלחות 6 בארות ודגרו עליהם בתמיסת EdU של 10 מיקרומטר למשך שעתיים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) וחדיר עם 0.3% Triton X-100 ב- PBS למשך 10 דקות ב- RT.
  2. הסר את מאגר החדירות והוסף 500 μL של תמיסת תגובה 1x. לאחר מכן, לדגור במשך 30 דקות ב RT בחושך עבור צביעה גרעינית.
  3. לצבוע תאים עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ולדמיין אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 200x. הכתימו את גרעיני התאים המתרבים עם EdU ובדקו אותם לפלואורסצנטיות אדומה.
  4. לבסוף, השתמש בתוכנה כדי לכמת את התוצאות על ידי ספירת לפחות 10 שדות אקראיים ולחשב את שיעורי ההתפשטות באמצעות היחס בין התאים החיוביים הפלואורסצנטיים לסך התאים.

4. בדיקת ריפוי פצעים

  1. תאי זרע בצלחות 6 בארות בצפיפות של 2 × 105 תאים לכל באר.
  2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, השתמשו בקצה מיקרופיפטה סטרילי של 10 μL כדי ליצור בעדינות שריטה ליניארית בשכבה האחידה של התא. שטפו בעדינות את הבארות עם PBS סטרילי כדי להסיר תאים מנותקים ופסולת הנגרמת על ידי שריטה.
  3. יתר על כן, לדגור את התאים בתווך המכיל 1% FBS. לאחר מכן, התבוננו וצלמו עם המיקרוסקופ ההפוך לריפוי האזור הפגוע ב-12, 24 ו-48 שעות.

5. בדיקת הוספת קרום נקבובי

  1. הכינו תרחיף תאים בתווך תרבית תאים בריכוז התאים הרצוי (המכיל 4 × 104 תאים), כולל תאי C33a נגועים או בקרה ו - HeLa. הוסף את מתלה התא לתא העליון של תוספות הממברנה, הבטחת חלוקה אחידה. הוסף מדיום שלם לתא התחתון.
  2. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, השתמש באלכוהול מתיל ו 0.1% סגול גבישי עבור קיבוע והכתמה של התאים הנודדים לחדרים התחתונים, בהתאמה.
  3. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לצלם תמונות ולאחר מכן נתח את מספר התאים הנודדים על-ידי ספירת לפחות 10 שדות אקראיים באמצעות ImageJ.
    1. לניתוח מספרים עם ImageJ, פתח את התמונה בתוכנת ImageJ, עבור אל הכרטיסייה תמונה בתפריט הכלי, בחר התאמה ולאחר מכן לחץ על סף. התאם את הגדרות הסף, במידת הצורך, עד שרק התאים יהיו גלויים על רקע לבן.
    2. לחץ על החל בחלון סף כדי להחיל הגדרות אלה על התמונה. כעת, בחר בכלי שרביט (מעקב) מסרגל הכלים (הממוקם בחלק העליון של החלון).
    3. לחץ על האזור בתמונה שבו ממוקמים התאים כדי לבחור את כל התאים בתמונת הסף. לאחר שהתאים מודגשים, עבור אל נתח בתפריט כלי ולאחר מכן, לחץ על נתח חלקיקים. בחלון ניתוח חלקיקים, הזן את הגודל הרצוי (לדוגמה, 0 - אינסוף) ואת ערכי המעגליות (לדוגמה, 0.00 - 1.00) בהתאם לדרישות הניסוי כדי לכלול את כל התאים בספירה.
    4. לחץ על אישור והמתן עד שהתוכנה תספור את התאים ויופיע חלון חדש עם תוצאות הניתוח.

6. בדיקת היווצרות מושבה

  1. זרעים 2 × 105 תאים לכל באר של קבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A בצלחת 6 בארות עם או בלי טיפול 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP) במשך 24 שעות.
  2. לאחר תקופה של 24 שעות של טיפול תרופתי, נתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין והשהה אותם מחדש בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% FBS. זרעו את התאים המרחפים מחדש בצלחת 6 בארות בצפיפות של 1 × 103 תאים לכל באר, ולאחר מכן לדגור באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר הדגירה במשך ~7-10 ימים כאשר המושבות גלויות, לתקן את התאים עם 4% Polyoxymethylene ולהכתים אותם עם תמיסת צביעה Giemsa במשך 20 דקות.
  4. שטפו מעט את התאים ותנו לצלחות להתייבש באוויר. צלמו את צבירי המושבה במיקרוסקופ וספרו את מספר המושבות המכילות יותר מ-50 תאים.

7. ניתוח דפולריזציה של קרום מיטוכונדריאלי (MMP) באמצעות צבע JC-1

  1. זרע 1.2 × 106 תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
  2. יש לדגור עם תמיסת צביעה JC-1 אחת למשך 15-20 דקות תחת 5% CO2 ב-37°C באמצעות ערכת בדיקת פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי בהתאם להוראות היצרן.
  3. שטפו את התאים ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 200 באמצעות אורכי גל עירור ופליטה עבור JC-1 ב~490 ננומטר ו-590 ננומטר, בהתאמה. כדי להמחיש את הפלואורסצנטיות של JC-1, השתמש במסננים מתאימים, כגון מסנן עירור כחול (450-490 ננומטר) ומסנן פליטה אדום (מעבר ארוך > 590 ננומטר) כדי ללכוד באופן סלקטיבי את האות הפלואורסצנטי הנפלט.

8. ניתוח ציטומטרי זרימה של mPTP

  1. זרע 1.2 × 106 תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
  2. הסר את מדיום התרבית מהתאים, השעה מחדש את התאים ב- PBS, והוסף 300 μL כל אחד (נפח 1x) של תמיסת צביעת AM Calcein ותמיסת עבודה מרווה פלואורסצנטית כדי לכסות את התאים באופן שווה. לדגור את התאים ב 37 ° C בסביבה מוגנת אור במשך 30-45 דקות, ולהחליף את המדיום עם מדיום תרבית טרי שחומם מראש ב 37 ° C. לדגור על התאים ב 37 ° C בסביבה מוגנת אור במשך 30 דקות נוספות כדי להבטיח הידרוליזה מלאה של Calcein AM על ידי אסטרזות תאיות, וכתוצאה מכך הדור של קלצאין ירוק-פלואורסצנטי תוך תאי.
  3. הסר את מדיום התרבית, שטוף את התאים 2-3x עם PBS, והוסף מאגר זיהוי. זהה mPTP של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה ואורך גל עירור של 488 ננומטר.

9. ציטומטריית זרימה

  1. זרע 1.2 × 106 תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
  2. לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, יש להשהות מחדש את התאים ב-200 μL של תמיסת חיץ קושרת ולערבב בעדינות 10 μL של Annexin V-FITC ו-5 μL של propidium iodide (PI) לתוך תרחיף התא. דוגרים על התערובת במשך 15 דקות תוך הימנעות מאור ומוסיפים 300 מיקרוליטר של תמיסת חיץ קושרת לתאים. זיהוי אפופטוזיס של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה באורך גל עירור של 488 ננומטר.

10. ניתוח RT-PCR

  1. זרע 1.2 × 106 תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
  2. חלץ את סך הרנ"א מתאי הגידול באמצעות מגיב מיצוי RNA והמיר את הרנ"א המופק לדנ"א משלים (cDNA) עם תערובת סינתזת cDNA על ידי דגירה ב 42 ° C במשך 45 דקות ולאחר מכן ב 95 ° C במשך 5 דקות.
  3. הכינו את תערובת תגובת ה-PCR המכילה DNA פולימראז, נוקלאוטידים, חיץ ואת הפריימרים הספציפיים לגן המתוכננים. הוסף את תבנית cDNA לתערובת התגובה עבור תגובת PCR בזמן אמת ובצע PCR במכשיר PCR כמותי בזמן אמת עם התנאים התרמו-מחזוריים הבאים: דנטורציה ב- 95 ° C למשך 30 שניות, ואחריה 40 מחזורים של 95 ° C עבור 5 שניות ו- 60 ° C במשך 30 שניות, ושלב עקומת ההתכה ב- 95 ° C למשך 15 שניות, 60°C למשך דקה אחת, ו-95°C למשך 15 שניות. כמת את רמות ה-mRNA בשיטת 2-ΔΔCq באמצעות GAPDH כבקרה פנימית.
    הערה: מערכת התגובה RT-PCR מוצגת בטבלה 1, ורצפי הפריימר מוצגים בטבלה 1.
    1. כדי לחשב את הערך 2−ΔΔCq , מדדו את ערכי Cq עבור גן המטרה וגן הייחוס (GAPDH) בדגימות. חשב את ה- ΔCq על ידי הפחתת ערך Cq של גן הייחוס מערך Cq של גן היעד עבור כל דגימה. חשב את ה- ΔΔCq על ידי הפחתת ה- ΔCq של דגימת בקרה מה- ΔCq של כל דגימת ניסוי. לבסוף, חשב את הערך 2−ΔΔCq על ידי העלאת 2 בחזקת הערך ΔΔCq.
      הערה: ערך Cq מייצג את מספר המחזור שבו האות הפלואורסצנטי מגיע לסף שנקבע.

11. ניתוח כתמים מערביים

  1. זרע 1.2 × 106 תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
  2. אספו את התאים שגודלו בתרבית ושטפו אותם במי מלח חוצצים בפוספט קר כקרח (PBS) כדי להסיר כל שאריות של מצע גידול או סרום. Lyse התאים באמצעות RIPA Lysis Buffer המכיל phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) כדי לשחרר את החלבונים התאיים. לדגור על התאים על קרח במשך כמה דקות כדי להבטיח ליזה מלאה וצנטריפוגה ב 4 ° C, 12,000 × גרם במשך 15 דקות. אספו את הסופרנאטנט כדי לקבוע את ריכוז החלבונים שלו.
  3. קבע את ריכוז החלבון בליזט התא באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. ערבבו את הליזט התא עם חיץ העמסה וחממו את התערובת בטמפרטורה של 95-100 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות כדי לפרק את החלבונים ולהבטיח הפרדה אחידה על הג'ל.
  4. מכל דגימה, טען 30 מיקרוגרם של חלבון כולל על ג'ל SDS-PAGE והפעל את SDS-PAGE תחת מתח קבוע של 80 V. עצור את האלקטרופורזה כאשר כחול הברומופנול מגיע לתחתית ג'ל ההפרדה.
  5. מעבירים את החלבונים המופרדים מהג'ל לקרום פוליווינילידיפלואוריד באמצעות מערכת העברה רטובה באמבט קרח עם זרם של 200 mA למשך שעה וחצי.
  6. חסום את הממברנה עם חלב 5% ללא שומן במי מלח חוצצים של Tris עם חיץ 0.05% Tween-20 (TBST) למשך שעה אחת ב- RT ודגור למשך הלילה ב- 4 ° C עם נוגדנים מתאימים הניתנים בטבלת החומרים.
  7. שטפו את הממברנה מספר פעמים עם TBST ודגרו עם הנוגדנים המשניים (Table of Materials) במשך שעה אחת ב-RT, ולאחר מכן שטפו עם TBST. דמיינו את רצועות החלבונים באמצעות ערכת זיהוי כימילומינסנציה משופרת ומערכת הדמיה.

12. ניתוח סטטיסטי

  1. מכיוון שכל נקודות הנתונים הניסיוניות יהיו בלתי תלויות, הציגו את הנתונים כממוצע ± SD. בצעו ניתוח סטטיסטי.
  2. השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) להשוואות מרובות ובמבחן של דנט להשוואה בין כל קבוצה לקבוצת הביקורת. השתמש במבחן t של תלמיד (דו-זנב לא מזווג) להשוואה בין שתי קבוצות; שקול P < 0.05 להיות משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח מסדי נתונים TCGA ותיקוף PCR

מניתוח מסד הנתונים של TCGA, ערכנו ניתוח השוואתי של רמות ביטוי mRNA ב-306 דגימות תאי סרטן צוואר הרחם וב-13 דגימות תאים נורמליים כדי לחקור את הביטוי הדיפרנציאלי של FAM83A. FAM83A היה מווסת בסרטן צוואר הרחם, בעוד שהביטוי שלו ברקמת צוואר הרחם הרגילה היה זניח (איור 1A). כדי לקבל תובנות נוספות לגבי ההשלכות הפרוגנוסטיות של ביטוי FAM83...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חקירת גני היעד של הגידול היא בעלת חשיבות עליונה הן למניעה והן לטיפול בסרטן צוואר הרחם. הבנת הגנים הספציפיים הממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות והתקדמות סרטן צוואר הרחם מספקת תובנה חשובה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של המחלה. יתר על כן, זיהוי גני מטרה אלה יכול להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות וטיפולים ממוקדים. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בניתוח מערך הנתונים של TCGA כדי לזהות את FAM83A כגן מטרה ולחקור את תפקידיו המכניסטיים בסרטן צוואר הרחם. אנו רואים ביטוי גבוה משמעותית של FAM83A בתאי סרטן צ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן לשכת המדע והטכנולוגיה של ג'ינגג'ואו (מס '2020HC06).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<>תאים חזקים ופורמולציה בינונית
C33aאוסף
הלהתרבית מסוג אמריקאי
שונהבינוני 10% סרום בקר עוברי ו+ אנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-100 U/מ"ל סטרפטומיצין)
<מידע על נוגדנים חזקים>
AKT4691, Cell Signaling Technology Inc.' 1:1,000
Bcl2 26593-1-AP, קבוצת פרוטאינטק, בע"מ 1:1,000
Caspase 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc' 1:2,000
cleaved-caspase3ABS132005; אבסין ביוסיינס בע"מ' 1:1,000
Cytc10993-1-AP; קבוצת 1:1,000
GAPDH 10494-1-AP, קבוצת פרוטאינטק בע"מ' 1:8,000
mTOR2983, Cell Signaling Technology Inc.' 1:1,000
PI3K4292, טכנולוגיית איתות סלולרית בע"מ 1:1,000
p-AKT 4060, טכנולוגיית איתות סלולרית בע"מ' 1:1,000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Cell Signaling Technology Inc.' 1:1,000
p-PI3K p85 תת-יחידה17366, Cell Signaling Technology Inc.' 1:1,000
נוגדנים משנייםGB23303, Servicebio' 1:2,000
<חזק>חומרים
6 בארותקורנינג, NPY
Alexa Fluor 555BCA Beyotime
 Beyotime, סין P0011
מערכת צילום ChemiDoc XRS BioRad
ערכה לזיהוי כימילומינסנציה משופרת Servicebio, Inc., סיןcat. מס' G2014
מיקרוסקופ פלואורסצנטי תאגיד אולימפוס, טוקיו, יפן
Hifair II גדיל ראשון סינתזת cDNA סופר מיקס 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., סין
מיקרוסקופ הפוך אולימפוס, טוקיו, יפן;
מוסיף טרנסוול של Millicell Millipore,Bedford, MA, ארה"ב
ערכת בדיקת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית Beyotime, סין
PMSF ST506, Beyotime Biotech, ג'יאנגסו, סין#ST506
מכשיר PCR כמותי בזמן אמת יישומי ביוסיסטמס, תרמו פישר סיינטיפיק. סין.
מאגר ליזה RIPA Beyotime Biotech, ג'יאנגסו, סין
מגיב TRIzolInvitrogen15596026
מגיב TRIzol Takara Bio Inc., Otsu, יפן
תוכנה
Image-Pro  פלוס 6.0   
תרביות מסוג אמריקאי אוסף תרביות מסוג אוסף פרוטאינטק ערכת בדיקת חלבון

מקורות

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454(2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172(2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697(2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87(2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302(2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השתקה של FAM83Aproliferציה של תאי גידולהגירה של תאיםצביעת EdUWestern Blotציטומטריית זרימהחלבוני אפופטוזיסיצירת מושבות
הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.