הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

3.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65698

⸱

1 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Zhejiang University School of Medicine, 3Hubei Normal University, 4National Clinical Research Center of Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing University School of Medicine, 5Clinical Laboratory, The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.

תקציר

אורגנואידים בכליות יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גישות שונות. אורגנואידים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה למידול מחלות, סינון תרופות ויישומים טיפוליים פוטנציאליים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), החל מהפס הפרימיטיבי האחורי (PS) ועד למזודרם הביניים (IM). הגישה מסתמכת על מדיום APEL 2, שהוא מדיום מוגדר ונטול רכיבים מן החי. הוא מתווסף עם ריכוז גבוה של אגוניסט WNT (CHIR99021) למשך 4 ימים, ואחריו גורם גדילה פיברובלסט 9 (FGF9)/הפרין וריכוז נמוך של CHIR99021 למשך 3 ימים נוספים. בתהליך זה, ניתן דגש לבחירת צפיפות התאים האופטימלית וריכוז CHIR99021 בתחילת תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שכן גורמים אלה קריטיים לייצור מוצלח של אורגנואידים בכליות. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא תרבית ההשעיה בלוח הדבקה נמוך, המאפשר ל- IM להתפתח בהדרגה למבני נפרון, הכוללים מבנים צינוריים גלומרולריים, פרוקסימליים ודיסטליים, כולם מוצגים בפורמט מובן חזותית. בסך הכל, פרוטוקול מפורט זה מציע טכניקה יעילה וספציפית לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מגוונים, ומבטיח תוצאות מוצלחות ועקביות.

מבוא

לכליה תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי, בהתאם ליחידה התפקודית שלה. נפרונים, המפרישים מוצרי פסולת, יכולים לווסת את הרכב נוזלי הגוף. מחלת כליות כרונית (CKD), הנגרמת על ידי מוטציות תורשתיות או גורמי סיכון גבוהים אחרים, תתקדם בסופו של דבר למחלת כליות סופנית (ESKD)1,2. ESKD נובע ככל הנראה מיכולת ההתחדשות המוגבלת של נפרונים. לפיכך, נדרש טיפול בתחליפי כליות. התמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מאפשרת יצירה חוץ גופית של אורגנואידים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל, אשר יכולים לשמש לחקר התפתחות כליות, מודל מחלות ספציפיות למטופל וביצוע בדיקות סקר של תרופות נפרוטוקסיות 3,4.

במהלך ההתפתחות העוברית, הכליות מקורן במזודרם הביניים (IM), המבדיל מהפס הפרימיטיבי (PS). מסלול האיתות הקלאסי של WNT עשוי לגרום לבידול נוסף של IM עם השתתפות מתואמת של FGF (FGF9, FGF20) ו- BMP (איתות Bmp7 באמצעות JNK)5,6,7. הם מייצרים שתי אוכלוסיות תאים חשובות של תאי אב נפריים (NPC): ניצן השופכה (UB), והמזנכימה המטנפרית (MM), ויוצרים את צינורות האיסוף ואת הנפרון, בהתאמה 8,9. כל נפרון מורכב מקטעים גלומרולריים וצינוריים, כגון הצינוריות הפרוקסימליות והדיסטליות, והלולאה של הנלה10,11. על פי התיאוריה שהוזכרה לעיל, הפרוטוקולים המפורסמים כיום מחקים את מפל האותות ואת גירוי גורם הגדילה כדי לגרום לאורגנואידים בכליות 5,12.

במהלך השנים האחרונות, פרוטוקולים רבים פותחו כדי להבדיל iPSCs אנושיים לתוך אורגנואידים בכליות 5,6,7,12. Takasato et al.7 ייעל את משך הטיפול ב- CHIR (אגוניסט WNT) לפני החלפתו ב- FGF9. על פי הפרוטוקול שלהם, חשיפה ל- CHIR במשך 4 ימים, ואחריה FGF9 למשך 3 ימים, היא הדרך היעילה ביותר לגרום ל- IM מ- iPSCs. מסנני Transwell שימשו כפורמט התרבות בהליך שלהם; עם זאת, שיטה זו קשה למתחילים. לכן, קומאר ואחרים ניסו לשנות את פורמט התרבות ובחרו להשעות את התרבות. הם ניתקו את התאים הדבקים ביום השביעי לזריעה בלוחות דבקים נמוכים כדי לעזור להם להתאסף לגוף עוברי (EBs) המכילים מבנים דמויי נפרון. עם זאת, אפקט האצווה של שיטות אלה היה ברור, במיוחד iPSCs שונים. בנוסף, ספרות שונה דיווחה כי ריכוז CHIR נע בין 7 מיקרומטר ל 12 מיקרומטר 5,13,14.

שיערנו כי ריכוז צפיפות התאים וה-CHIR עשויים להשפיע על ייצור אורגנואידים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שונים, וזה אומת פעמים רבות בניסויים שלנו. הפרוטוקול הנוכחי שינה מעט את שיטת המחקר של Kumar et al.13 וסיפק למשתמשים הליך שלב אחר שלב. לוח הזמנים והסכמה של הגישה מוצגים באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ה-iPSCs ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי. התאים נשמרו עם תווך mTeSR על לוחות ממברנות מרתף מצופים מטריצה זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). טבלה 1 מכילה את כל ההרכבים הבינוניים ששימשו במחקר.

1. ציפוי iPSCs להתמיינות והשראת פס פרימיטיבי אחורי (PS)

  1. שטפו iPSCs על צלחת 6 בארות מצופות מטריצת ממברנה עם DPBS של 2 מ"ל. שאפו את ה-DPBS באמצעות פיפטה.
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לנתק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ולדגור ב-37°C למשך 5 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של mTeSR לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים וודא שהתאים התרוממו משטח הפלסטיק.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השהה מחדש את גלולת התא וספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
  5. זרעו מגוון של צפיפויות תאים על צלחת של 24 או 6 בארות המצופה במטריצת ממברנה ותרבית עם mTeSR בתוספת מעכב Rho קינאז 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראו טבלת חומרים). תרבית אותם לילה באינקובטור CO2 של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי לגרום ל-PS, הריכוז האופטימלי של CHIR99021 וצפיפויות התאים המתאימות משתנים מקווי iPSC שונים. זרעו טווח של צפיפויות (למשל, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4*103 תאים בודדים לסנטימטר מרובע) וטווח ריכוז של CHIR99021 בין 7 מיקרומטר ל-12 מיקרומטר. התחילו את ההתמיינות של כל צפיפות וכל CHIR באותו יום. מצא את הריכוז האופטימלי של CHIR99021 ואת צפיפות התאים המתאימה בצלחת של 24 בארות ולאחר מכן הרחב את התרבית בצלחות של 6 בארות. כאן אנו מספקים פרוטוקול המבוסס על צלחת 6 בארות.
  6. למחרת, לשאוף את mTeSR ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DPBS.
  7. הוסף 2 מ"ל של מדיום שלב I (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 8-12 מיקרומטר CHIR99021) (טבלה 1), המכונה יום 0.
  8. תרבית אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים, רענון שלב I בינוני כל יומיים.

2. השראת מזודרם ביניים נפרוגנית (IM)

  1. ביום 4, להסיר את שלב I בינוני ולשטוף עם 2 מ"ל של DPBS.
  2. הוסף 2 מ"ל של תווך שלב II לתאים (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 200 ננוגרם/מ"ל FGF9, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-1 מיקרומטר CHIR99021) (טבלה 1).
  3. תרביתו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ורעננו את המדיום כל יומיים עד יום 7.

3. יצירת אורגנואידים בכליות בתרבות ההשעיה

הערה: במהלך תקופת התצפית מיום 0 עד יום 7, מצב התאים הוא קריטי. אם התאים מפגינים התרחבות מוצלחת ונערמים ללא פסולת תאים משמעותית, זה מדגים את הנגזרת המוצלחת של מזודרם הביניים (IM), מה שמצביע על הנכונות להמשיך לשלב הבא. עם זאת, אם התאים מראים סימנים של אפופטוזיס ראשוני, ואחריו נמק או שבירה, זה עשוי להצביע על ריכוזים לא מתאימים של CHIR99021 או צפיפות תאים.

  1. ביום 7, להסיר את שלב II בינוני ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DPBS.
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התא לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 5 דקות עד תאים נשברים תחת ניגודיות פאזה.
  3. פיפטה 1 מ"ל של שלב II בינוני לתאים, מערבבים, ומוודאים שהתאים התרוממו מפני השטח.
  4. אסוף את מתלה התא בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את כדורית התא ב-2 מ"ל של מדיום שלב III (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 200 ננוגרם/מ"ל FGF9, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-1 מיקרומטר CHIR99021 ב-0.1% מתילצלולוז (MC), 0.1% פוליוויניל אלכוהול (PVA)) בתוספת מעכב Rho קינאז 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.
  6. מערבבים את תרחיף התא והזרעים לצלחת בעלת 6 בארות בהידבקות נמוכה ביחס של 1:3. הניחו את הצלחת על שייקר אורביטלי (עמיד בפני CO 2, מסתובב ב-60 סל"ד) באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  7. 24 שעות לאחר מכן, יש להסיר את מעכב Rho קינאז (Y-27632) ולהוסיף מדיה שלב III (תוסף בינוני להתמיינות תאי גזע עם FGF9 של 200 ננוגרם/מ"ל, הפרין 1 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרומטר CHIR99021, 0.1% MC, 0.1% PVA). תרבות במשך יומיים. שנה את המדיום בתרבות המתלים על-ידי ביצוע השלבים הבאים:
    1. חותכים את קצה פיפטה 1 מ"ל עם מספריים אספטיים.
    2. נערו בעדינות את הצלחת בעלת 6 הבארות כדי לסדר את האורגנואידים במרכז הצלחת.
    3. שואפים את האורגנואידים עם פיפטות מוכן לתוך צינור 15 מ"ל ולאפשר להם לעמוד במשך 5 דקות.
    4. שאפו את הסופרנאטנט והשאירו את האורגנואידים בתחתית הצינור.
    5. מוסיפים את המדיום הטרי כדי להשהות מחדש את האורגנואידים ומחזירים לצלחת בעלת 6 בארות עם הדבקה נמוכה.
  8. ממשיכים לנער את צלחת ההדבקה הנמוכה ב-60 סל"ד באינקובטור. שנה את מדיום שלב III כל יומיים עד ליום ה -12.
  9. ביום ה-12, יש לשנות את המדיום לשלב IV (מדיום התמיינות תאי גזע המכיל 0.1% MC ו-0.1% PVA).
  10. החליפו את המדיום כל יומיים עד היום ה-25. האורגנואידים יכולים להתפתח בהדרגה למבני נפרון בוגרים מהיום ה-12-25.

4. מכתים immunofluorescence של אורגנואידים בכליות

  1. לאסוף אורגנואידים בכליות לתוך צינור 15 מ"ל ולשטוף עם 2 מ"ל PBS.
  2. לאחר שתאפשרו לו להתייצב למשך 5-10 דקות, תקנו את אורגנואידי הכליה ב-2% PFA טרי למשך 20 דקות ב-4°C.
  3. הסר את ה- PFA ושטוף את האורגנואידים עם PBS 1 מ"ל המכיל 0.3% Triton X-100 (0.3% PBST), נער אותו באופן שווה על שייקר (עם מהירות סיבוב שאינה עולה על 60 סל"ד) במשך 8 דקות, אפשר לו לעמוד במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
    הערה: ניתן לאחסן את האורגנואידים ב-0.3% PBST ב-4°C למשך 2-4 שבועות.
  4. יש לדגור על האורגנואידים הקבועים עם 10% נסיוב חמורים ב-PBST (חיץ חוסם) (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  5. לדלל את הנוגדנים הראשוניים (המפורטים בטבלת החומרים) במאגר חוסם ביחס של 1:300.
  6. לדגור את האורגנואידים עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 °C עם תסיסה.
    הערה: ודא שניתן להכתים גלומרולי וצינוריות בו זמנית על אורגנואיד אחד.
  7. לשטוף את האורגנואידים עם 1 מ"ל 0.3% PBST, לנער אותו באופן שווה על שייקר (עם מהירות סיבוב לא יעלה על 60 סל"ד) במשך 8 דקות, לאפשר לו לעמוד במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
  8. לדגור על האורגנואידים עם נוגדנים משניים (המפורטים בטבלת החומרים) ו- DAPI למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר מכן חזור על שלב 4.7.
    הערה: הן נוגדן משני והן DAPI מדוללים בתמיסת חסימה, נוגדן משני (1:400) ו- DAPI (1:1000).
  9. לאחר הצביעה, יש לייבש את האורגנואידים במתנול (25%, 50%, 75% ו-100% למשך 5 דקות כל אחד), ולאחר מכן לחדור עם בנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB, יחס של 1:2) (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות.
  10. הניחו את האורגנואידים המפונים על צלחת בעלת תחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) ובחנו אותם במיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: בעת ההדמיה, בחרו את צלחת הפטרי בתחתית צלחת הזכוכית, ובעת החלחול, הניחו את ה-BABB ישירות בצלחת הפטרי כדי לשמור על תחתית המנה לחה.

5. בדיקת ספיגת דקסטרן במבחנה

  1. ביום ה-25, יש לדגור על האורגנואידים עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית (ראו טבלת חומרים) במשך 4 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  2. 4 שעות לאחר מכן, עבור למדיום חדש וצלם תמונות של תרביות תאים חיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפקת IM מושגת על ידי הפעלת איתות WNT קנוני באמצעות מעכב GSK3 CHIR99021, ואחריו FGF9/הפרין. מיום 0 עד יום 4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחבים במהירות ומקבלים צורות רומבואידיות או משולשות. המפגש מגיע ל-90%-100% ומצטבר באופן שווה עד היום השביעי. בתרבית ההשעיה, הצברים יוצרים באופן ספונטני מבני נפרון לאחר התנתקות ביום 7. אורגנואידי הכליה שנוצרו באמצעות תרבית תרחיף מציגים מבנים דמויי צינוריות, וניתן לצפות בהם בקלות בתמונות שדה בהיר לאחר 18 יום של צבירה (איור 2 ואיור 3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול מפורט תואר ליצירת אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הכולל שינויים קלים בתווך הבסיסי, צפיפות התאים הראשונית וריכוז CHIR99021. בניסויים שונים, הגורמים הקריטיים ליצירת אורגנואידים מוצלחים בכליות נמצאו כהתמיינות הראשונית של מזודרם הביניים (IM) ומצב התא ביום 7. יתר על כן, קווי iPSC שונים הציגו שינויים בפוטנציאל התרבות והתמיינות תאים, וכתוצאה מכך צפיפות תאים אופטימלית משתנה וריכוזי CHIR99021 5,13,14. כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא דיווחו על ניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

אנו אסירי תודה לכל חברי מאו והו לאב, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו), והקרן למדעי הטבע של פרובינציית ג'יאנגסו (מענקים מס'. BK20210150 לגאנג וואנג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים 96 באר, חתול NEST עם תחתית שטוחה#701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #07920
נוגדנים
בנזיל אלכוהולסיגמא-אולדריץ'חתול #100-51-6
בנזיל בנזואטסיגמא-אולדריץ'חתול #120-51-4
ארון בטיחות ביולוגיהאייר קאט #HR40  figure-materials-1  A2
ביוטין אנטי אנושי LTL (1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
תאים חד-גרעיניים בדם hiPS-B1 (iPSc, נקבה)N/AN/A
שייקר רמת פחמן דו חמצניHAMANYCat #C0-06UC6
כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים
CHIR99021 (מפעיל מסלול Wnt)תא גזע טכנולוגיותחתול #72054
Costar מרובה 6 באר צלחת תרבית תאיםקורנינגחתול #3516
Costar חיבור נמוך במיוחד 6 באר צלחתקורנינגחתול #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
תמיסת כתמים DAPICoolaberCat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647Thermo SCIENTIFICחתול #D22914
DMEM/F-12שירות ללא HEPESביוחתול #G4610
חמור נגד כבשים IgG H& L (Alexa Fluor 647)AbcamCat #ab150179
סרום חמור StosteMeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS (ללא סידן, מגנזיום, פנול אדום)Solarbio Life Science#D1040
חממת אמבטיה יבשהShanghai JingxinCat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032620
מודלים ניסיוניים: קווי תאים
Forma Steri-Cycle CO2 חממהתרמו מדעיתחתול #370
ג'לטר ללא LDEVג'יבקוחתול #A1413202
כלי תרבות תחתית זכוכית NESTחתול #801002
עיזים אנטי אנושי CUBN (1:300)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהחתול #sc-20607
תמיסת הפרין (תוסף תרבית תאים)STEMCELL TechnologiesCat #07980
Human Recombinant FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
מיקרוסקופ הפוךOLYMPUSחתול #CKX53
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליOLYMPUSחתול #FV3000
מתיל תאיתסיגמא-אולדריץ'חתול #M7027
מיקרו צנטריפוגהHENGNUOCat #2-4B
עכבר אנטי אנושי CD31 (1:300)BD BiosciencesCat #555444
עכבר אנטי אנושי ECAD (1:300)BD BiosciencesCat #610182
עכבר אנטי-אנושי אינטגרין בטא 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
עכבר אנטי-אנושי MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo SCIENTIFICCat #39795
Mowiol 4-88 ( פוליוויניל אלכוהול 4-88)סיגמא-אולדריץ'חתול #81381
mTeSR1 5X תוסףSTEMCELLTechnologies חתול #85852
mTeSR1 בסיסי בינוניSTEMCELL Technologiesחתול #85851
Nunc CryoTube בקבוקוניםתרמו מדעיחתול #377267
אחרים
ארנב אנטי אנושי GATA3 (1:300)טכנולוגיית איתות תאיםחתול #5852S
ארנב אנטי אנושי LRP2 (1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
ארנב אנטי אנושי Synaptopodin (1:300)Abcam חתול #ab224491
ארנב אנטי אנושי WT1 (1:300)Abcamחתול #ab89901
ארנב נגד עכבר PDGFR (1:300)Abcamחתול #ab32570
אלבומין סרום אנושי רקומביננטי (rHSA)YEASENחתול #20901ES03
כבשים אנטי אנושי NPHS1 (1:300)R& D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat #15040066
Y-27632 (דיהידרוכלוריד)STEMCELL TechnologiesCat #72304
Cat

מקורות

  1. Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
  2. Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).
  3. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  4. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
  5. Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).
  7. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  8. Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
  9. SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
  10. Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
  11. Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
  12. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
  13. Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361(2019).
  14. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

WNTCHIR990219
יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.