מיצוי DNA ללא תאים של דגימות הומור זגוגיות ומימיות לאבחון וניטור של לימפומה זגוגית

סיכום

כאן נקבע הליך להפקת DNA נטול תאים מהומור זגוגי ומימי לביצוע מחקרים מולקולריים לאבחון לימפומה זגוגית. השיטה מציעה את היכולת לחלץ במקביל DNA מהמרכיב התאי של הדגימה או לשמור אותו לבדיקות נלוות.

תקציר

לימפומה זגוגית (VRL) מייצגת לימפומה אגרסיבית, המסווגת לעתים קרובות כלימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית המפזרת תאי B גדולים. כדי לאבחן VRL, דגימות כגון הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי נאספים. בדיקות אבחון VRL על דגימות אלה כוללות ציטולוגיה, ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. עם זאת, הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה, יחד עם בדיקות מולקולריות באמצעות DNA תאי, מחייבות תאים שלמים שלמים. האתגר טמון בעובדה שלהומור זגוגי ומימי יש בדרך כלל תאיות נמוכה, ותאים רבים נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. יתר על כן, דגימות אלה מציבות קשיים נוספים לבדיקה מולקולרית בשל הצמיגות הגבוהה של הומור הזגוגית והנפח הנמוך של הומור הזגוגית והמימית כאחד. מחקר זה מציע שיטה לחילוץ דנ"א נטול תאים מדגימות זגוגיות ומימיות. גישה זו משלימה את מיצוי הדנ"א התאי או מאפשרת להשתמש במרכיב התאי של דגימות אלה לשיטות אבחון אחרות, כולל ציטולוגיה וציטומטריית זרימה.

מבוא

לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית הקשורה ללימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית, מפושטת של תאי B גדולים ^1,2,3. VRL הוא בדרך כלל קטלני בשל מעורבותו במערכת העצבים המרכזית ^1,2. למרות נדיר^1,4, VRL לעתים קרובות מציג סימפטומים דומים uveitis האחורי ומחלות זגוגית אחרות ^4,5. כתוצאה מכך, חולים המציגים תסמיני אובאיטיס דורשים אבחנה כדי לאשר או לשלול VRL.

לאחרונה פורסמו קריטריונים מוסכמים לאבחון VRL, הכוללים שילוב של בדיקה קלינית וממצאי מעבדה⁶. דגימות נפוצות לאבחון VRL כוללות הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי⁷. הומור הזגוגית מתקבל באמצעות הליך כירורגי שנקרא pars plana vitrectomy, המאפשר גישה לחלק האחורי של העין⁸.

בפרוטוקול המוצג, נאספו דגימות הומור מימי והומור זגוגי לצורך מיצוי תאי ו- cfDNA. לאחר הרדמת החולים והנחת טרוקרים במרחק של כ-4 מ"מ מלימבוס הקרנית, התקבלה דגימת הומור מימית של כ-100-200 מיקרוליטר באמצעות מזרק שחפת 1 מ"ל בלימבוס הקרנית. עבור חולים פסאודופאקים, זגוגית לא מדוללת הושגה על ידי החדרת אוויר סטרילי לעירוי, המאפשר איסוף של כמות גדולה יותר של זגוגית לא מדוללת (עד 3.5 מ"ל). בחולים פאקיים, כ 500 עד 1000 μL של זגוגית לא מדוללת הוסרו לפני הפעלת עירוי של תמיסת מלח מאוזנת. במקרים מסוימים, זגוגית מדוללת משנית (500 עד 2,000 μL) נאספה על ידי החלפת העירוי לנוזל והצבת הוויטרקטור בתוך חצאית הזגוגית כדי לקבל דגימה זו. החלק הזגוגי המדולל ביותר נאסף על ידי שימור תיק הקלטות (איור משלים 1) בסוף הניתוח. ברגע ששקית זו הגיעה למחלקה הפתולוגית, הזגוגית המדוללת התקבלה מניקוז נוזל מתוך שקית זו לצינורות חרוטיים לצורך מיצוי DNA לאחר מכן.

ציטופתולוגיה של נוזל הזגוגית נחשבת לעתים קרובות לתקן הזהב⁹. עם זאת, מספר מחקרים הדגימו רגישות מוגבלת עקב עיבוד וסלולריות מינימלית^10,11,12. ציטומטריית זרימה יכולה לסייע בזיהוי תאי B משובטים, אך יכולה להיות מוגבלת גם על ידי תאים נמוכים ושבריריות של תאי לימפומה גדולים^13,14,15. הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה דורשות תאים שלמים שלמים. רבים מהתאים האלה נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. כאשר הבדיקה המולקולרית מבוצעת באמצעות דנ"א המופק מתאים שלמים (דנ"א תאי), הוא סובל מאותה מגבלה. בנוסף, חלוקת דגימת הזגוגית המוגבלת לכל הבדיקות הללו מפחיתה את כמות החומר הזמין לכל בדיקה.

דנ"א נטול תאים (cfDNA) מייצג מקור נוסף של דנ"א שאינו דורש תאים שלמים. cfDNA מדגימות זגוגית שימש לזיהוי VRL ^16,17 וכן מלנומה של uveal¹⁸. בפרוטוקול זה, דנ"א תאי ונטול תאים מופקים מנוזל זגוגי ומימי כדי לזהות VRL.

פרוטוקול

הפרוטוקול הנוכחי עוקב אחר הנחיות הטיפול האנושי ובאישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת מישיגן. ויתור על הסכמה מדעת התקבל לכך מ-IRB. אין קריטריוני הכללה או הדרה רלוונטיים עבור המטופלים המעורבים.

1. הפרדת רכיבים סלולריים ורכיבים נטולי תאים

הערה: ניתן לקבל שלושה סוגים של דגימות לבדיקת אבחון VRL: זגוגית (לא מדוללת; נוזל מויטרקטומיה שנאסף לפני תחילת העירוי), זגוגית מדוללת בתוך שקית קסטה (איור 1), והומור מימי (נוזל מהחדר הקדמי של העין).

1. עבור נוזל זגוגית לא מדולל, שהוא צמיג מאוד, לדלל עם 3-5 מ"ל PBS כדי להקל על pipetting.
2. עבור זגוגית מדוללת בתוך שקית הקלטות (איור משלים 1), יש לנקז את הנוזל לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל (אחד לכל 45 מ"ל נוזל).
3. הומור מימי נמוך מאוד בנפח (<200 μL). כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של תאים, להעביר את הדגימה לצינור 1.5 מ"ל, לשטוף את צינור מיקרוצנטריפוגה המקורי 500 μL הדגימה נאספה עם נפח שווה של PBS, ולהוסיף צינור 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה זגוגית או נוזל מימי ב 3,000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה, נזהר לא להפריע את התאים pelleted.

2. מיצוי DNA מהרכיב התאי

1. הוסף כמות מתאימה של תמיסת ליזה תאית (300 מיקרוליטר עבור גלולה קטנה, 1 מ"ל או יותר עבור גלולה גדולה יותר) (ראה טבלת חומרים). מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה.
2. לאחר ליזה מלאה, הוסף 1/3 נפח כולל של תמיסת המשקעים החלבוניים (100 μL עבור 300 μL ליזט) (ראה טבלת חומרים).
3. מערבולת במרץ במשך 20-30 שניות. סבבו במשך 3 דקות במהירות של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
4. פיפטה 300 μL של איזופרופנול לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. בזהירות פיפטה את supernatant מן השלב הקודם אל צינור isopropanol.
5. הוסף 1.5 μL של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן (עבור 300 μL ליזה) (ראה טבלת חומרים).
6. יש לערבב היטב בהיפוך, ולאחר מכן להכניס את הדגימה למקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך שעה עד לילה כדי לסייע במשקעים ב-DNA.
7. צנטריפוגה את הצינור 1.5 מ"ל למשך 5 דקות ב 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר. פיפטה מהאיזופרופנול.
8. הוסף 0.5 מ"ל של אתנול 70% והפוך את הצינור כדי לשטוף את הכדור.
9. יש לסחור במשך דקה אחת במהירות של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר ולרוקן את האתנול. חזור על שטיפת אתנול פעם אחת.
10. הפוך את הצינור על גזה נקייה כדי לנקז את התמיסה ולייבש את הגלולה או decant. סובבו במהירות את הדנ"א במיקרוצנטריפוגה ופיפטה את טיפת האתנול הנותרת עם קצה פיפט חד פעמי דק (ברגע שלא נשאר אתנול שאריות בצינור, הדנ"א צריך להיות יבש ומוכן להתייבש תוך 5-10 דקות).
11. הוסף 45 μL של תמיסת לחות DNA (ראה טבלת חומרים) לכדורית ה- DNA המיובשת.
12. הניחו את הצינור בבלוק חימום בטמפרטורה של 50°C ואפשרו לו להתסיס למשך 1-2 שעות. מפטמים את הדנ"א מעלה ומטה כדי להאיץ את תהליך ההידרציה.
    הערה: הוסף תמיסת הידרציה נוספת של DNA אם הדגימה נראית צמיגה מדי.

3. מיצוי DNA ללא תאים

1. כמות הסופרנאטנט משלב 1.5 משתנה. הוסף 70 μL של חיץ מיזוג (ראה טבלת חומרים) עבור כל מיליליטר של supernatant.
2. מערבבים היטב חרוזי ניקוי על ידי מערבולת. הוסף 10 μL של חרוזי ניקוי אם עיבוד <14 מ"ל של supernatant ללא תאים, 20 μL אם עיבוד 14-40 מ"ל.
3. מערבבים היטב מדגם / תערובת חרוזים על ידי ערבול. צנטריפוגה במהירות 3,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. מבלי להפריע לכדורית, פיפטה החוצה את supernatant משאיר מאחור 100 μL אם 10 μL של חרוזי ניקוי משמשים, ו 200 μL אם 20 μL של חרוזי ניקוי משמשים.
5. הוסף נפח שווה של מאגר עיכול גלולות השתן (ראה טבלת חומרים) לגלולה והשהה מחדש את הגלולה היטב על ידי מערבולות או פיפטציה.
6. הוסף פרוטאינאז K (5% (v/v)) לגלולה המרחפת מחדש (למשל, הוסף 10 μL של פרוטאינאז K לתערובת 200 μL) וערבב היטב על ידי מערבולות עדינות.
7. לדגור על תערובת הכדוריות ב 55 ° C במשך 30 דקות.
8. הוסף נפח אחד של חיץ ליזה גנומי (ראה טבלת חומרים) לתערובת העיכול (למשל, חיץ ליזה גנומי של 210 מיקרוליטר לתערובת עיכול של 210 מיקרוליטר) וערבב באמצעות מערבולת.
9. העבר את עמודת הספין הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) לשפופרת איסוף חדשה.
10. הוסף 200 μL של מאגר הכנת DNA בשתן לעמודת הספין, צנטריפוגה ב ≥16,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשליך את הזרימה.
11. הוסף 700 μL של מאגר שטיפת DNA בשתן לעמודה, צנטריפוגה ב ≥16,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והשליך את הזרימה.
12. חזור על השלב עם מאגר שטיפת DNA של 200 μL בשתן.
13. העבר את עמודת הספין לצינור מיקרוצנטריפוגה ללא DNase/RNase.
14. הוסף את הנפח המתאים של מאגר אלוציית DNA (בהתבסס על הבדיקות המולקולריות שיש לבצע) ישירות על מטריצת העמודה ואפשר לה לעמוד 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: 30 μL של מאגר elution שימש במקרים לדוגמה. נעשה שימוש במאגר אלוציה נוסף אם נדרשות בדיקות נוספות.
15. צנטריפוגה במהירות של ≥16,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לקבל את הדנ"א נטול התא.

תוצאות

שיטות מיצוי אלה בוצעו במספר מצומצם של מקרים כדי להבטיח תפוקה נאותה והגברה של DNA ללא תאים בהשוואה לדנ"א תאי מדגימות הזגוגית (ארבע) והמימית (ארבע). מדגימות אלה, תפוקת הדנ"א מהרכיב נטול התאים של נוזלים אלה דומה לזו של הרכיב התאי (טבלה 1). תאים ו- cfDNA מדגימות אלה הוערכו גם באמצעות בדיקות מולקולריות, כגון עבור מוטציה הקשורה ל- VRL MYD88 L265P. PCR ספציפי לאלל בזמן אמת עבור MYD88 L265P (איור 1) מדגים את הזיהוי של מוטציה זו הקשורה ל-VRL הן בדנ"א תאי והן ב-cfDNA...

דיון

לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית של תאי B גדולים ^1,2,3 שתסמיניה יכולים לחקות מחלות זגוגיות אחרות ^4,5. בדיקה מולקולרית של זגוגית, ולאחרונה גם הומור מימי, הפכה לשיטה קריטית לאבחנה של VRL או לשלילתה. עם זאת, נוזלים אלה הם נמוכים מאוד בנפח ולעתים קרובות יש תאים נמוכים. רבים מהתאים בתוך נוזלים אלה יכולים גם להיפגע במהלך איסוף, אחסון ועיבוד^13,14,15

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-פרופנול (איזופרופנול)	פישר	A415-500
DNA נקי & רכז-10	Zymo Research	D4011
DNA נקי & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene תמיסת ליזה של תאים	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene תמיסת משקעים של חלבון	Qiagen	158912
פוספט (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA ערכת שתן	Zymo Research	D3061	מאגר מיזוג; כולל גם חרוזי ניקוי, פרוטאינאז K ועמודות ספין
גליקוגן אולטרה-טהור, 20 ומיקרו; g/µ ליטר (20 מ"ג/מ"ל)	תרמו פישר/אינוויטרוגן	10814010