מאמר שיטה

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65733

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

תקציר

מסלולי איתות מתזמרים תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל התפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. שיטות למניפולציה ניסיונית של איתות נדרשות כדי להבין כיצד איתות מתפרש בהקשרים רחבים אלה. כלים אופטוגנטיים מולקולריים יכולים לספק מניפולציות הפיכות של פעילות מסלול איתות עם רמה גבוהה של שליטה מרחבית-טמפורלית ויושמו במבחנה, ex vivo ו-in vivo. כלים אלה משלבים תחומים חלבוניים מגיבי אור, כגון תחום חישת אור-חמצן-מתח (LOV) של אור כחול, עם אפקטי איתות כדי להעניק שליטה ניסיונית תלוית אור על איתות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש בחלבון מורפוגנטי עצם מבוסס LOV (BMP) ומפעילי איתות Nodal bOpto-BMP ו- bOpto-Nodal בעובר הנגיש אופטית של דגי זברה. הוא מתאר שני ניסויי בקרה: בדיקת פנוטיפ מהירה לקביעת תנאי ניסוי מתאימים, ובדיקת אימונופלואורסצנטיות להערכה ישירה של איתות. יחד, ניסויי בקרה אלה יכולים לסייע בהקמת צינור לשימוש בכלים אופטוגנטיים בעוברים מוקדמים של דגי זברה. אסטרטגיות אלה מספקות פלטפורמה רבת עוצמה לחקור את תפקידי האיתות בהתפתחות, בריאות ופיזיולוגיה.

מבוא

מסלולי איתות מאפשרים לתאים להגיב לסביבתם ולתאם פעילויות בקנה מידה של רקמות ואורגניזמים. אותות חיוניים להתפתחות עוברית כוללים את חברי משפחת TGF-beta חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) ו- Nodal 1,2,3. במהלך האמבריוגנזה, המסלולים המווסתים על ידי אותות אלה ואחרים מעצבים את תוכנית הגוף על ידי שליטה בביטוי גנים ותהליכים נוספים כדי להבטיח שרקמות ואיברים מגוונים יתפתחו ויתממשקו כראוי. פתולוגיות, כולל מומים מולדים וסרטן, יכולות להתרחש כאשר איתות או תגובות לאיתות מוטרדים 4,5,6,7. למרות חקירה קפדנית של אותות, נותר לגלות הרבה יותר על האופן שבו רמות ודינמיקה מפוענחות במגוון הקשרים 8,9,10,11, במיוחד במהלך פיתוח 12,13,14,15,16,17,18,19.

כדי להבין כיצד מפוענח איתות, ניסוי אידיאלי יהיה לתפעל את רמות האיתות, התזמון ו / או הדינמיקה - עם רמה גבוהה של שליטה מרחבית וזמנית - ולהעריך את התוצאות. לדוגמה, שיפועי איתות מרחביים מדויקים מוצעים לתבניות מתפתחותרקמות 20,21. שינוי ההתפלגויות המרחביות של שיפוע האיתות יסייע לבחון השערה זו22. בנוסף, חשיבותה של דינמיקת איתות ביצירת תגובות תאיות מגוונות הולכת ומתבהרת: אותו מסלול איתות יכול להורות לתאים להתמיין או להתרבות בהתאם לתדירות האיתות, למשל 9,23. פרדיגמות ניסיוניות שבהן ניתן לתפעל בקלות דינמיקת איתות יהיו בעלות ערך כדי לחקור את הקשר בין דינמיקה והחלטות גורל התא 8,12,13,14,15.

מבחינה היסטורית, שיטות רבות שימשו למניפולציה של איתות בהקשרים התפתחותיים, מה שהוביל לתגליות בסיסיות 1,2,3. ניתן לחסום איתות באמצעות מוטציות של אובדן תפקוד, ביטוי מעכב חוץ רחמי או תרופות אנטגוניסטיות. שיטות להפעלת איתות כוללות תרופות אגוניסטיות, ליגנדות רקומביננטיות, ביטוי חוץ רחמי של ליגנדות או קולטנים פעילים באופן קונסטיטוטיבי, ומוטציות של אובדן תפקוד של מעכבי מסלול. שיטות אלה נעות לאורך רצף של בקרה ניסיונית. לדוגמה, מוטנטים וביטוי חוץ רחמי עשויים ליפול בצד הפטיש של הרצף: בגישות אלה, שינויים דרמטיים ומערכתיים בפעילות המסלול עלולים לגרום למוות מוקדם ולמנוע חקירות בשלבים מאוחרים יותר, או לאורך זמן עלולים לגרום להשפעות פליוטרופיות שקשה להתיר אותן. בנוסף, לעתים קרובות מאתגר לתפעל באופן עצמאי תכונת איתות אחת בכל פעם, כגון רמה או משך. לקראת הקצה השני של הרצף, שיטות מסוימות מציעות בקרה ניסיונית מדויקת יותר, כגון התקנים מיקרופלואידים החושפים דגימות לתרופות או חלבונים רקומביננטיים עם בקרה טמפורלית ולעתים מרחבית 18,24,25, או שיטות גנטיות, כולל מקדמי הלם חום וספציפיים לרקמות שיכולים להציע יתרונות דומים16,26,27. עם זאת, שיטות אלה עשויות להיות קשות לביצוע, עשויות להיות בלתי הפיכות, עשויות להיות בעלות קינטיקה איטית יחסית או רזולוציה ירודה, ועשויות להיות בלתי זמינות במערכות מודל מסוימות.

גישות אופטוגנטיות מולקולריות הן תוספת רבת עוצמה לארגז כלים זה. גישות אלה משתמשות בחלבונים המגיבים לאורכי גל שונים של אור כדי לתמרן תהליכים ביולוגיים, כולל איתות 8,12,13,14,15, ופותחו במשך עשרות שנים לשימוש במגוון מערכות מתרבית תאים ועד בעלי חיים שלמים 12,13,28. בהשוואה לגישות היסטוריות, אופטוגנטיקה מולקולרית יכולה לעתים קרובות להציע רמה גבוהה יותר של שליטה מרחבית-זמנית על תהליכים ביולוגיים: הבקר במערכות אופטוגנטיות הוא קל, והשליטה באורך הגל של האור, בעוצמתו, במשך הזמן ובתדירות החשיפה פשוטה יחסית. עם מערכות מתוחכמות כגון מיקרוסקופים קונפוקליים ושני פוטונים, שליטה מרחבית בתחום התת-תאי אפשרית 29,30,31. כלים למניפולציה אופטוגנטית של איתות פותחו ויושמו במספר מערכות, כולל אלה המתוארים ב- Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 ו- Huang et al.34. לדוגמה, תוך ניצול השליטה המרחבית שמעניקה האופטוגנטיקה, אסטרטגיה זו שימשה לאחרונה לשינוי שיפוע איתות בעוברי דרוזופילה, והראתה כי אמבריוגנזה של זבובים עמידה באופן מפתיע לשינויים בשיפועזה 22. ההפיכות והקינטיקה המהירה/כבויה של מפעילי איתות אופטוגנטי הפכו אותם גם לכלים אטרקטיביים לחקר פענוח דינמיקת איתות 8,12,13,14,15,34,35,36.

העובר המוקדם של דג הזברה הוא מערכת in vivo המתאימה היטב למחקרים אופטוגנטיים מכיוון שהיא מופרית חיצונית, שקופה, ידידותית למיקרוסקופיה וניתנת למשיכה גנטית. קל יותר להעביר חשיפה לאור לעוברים המתפתחים מחוץ לאם, אור יכול לחדור ולגשת לרקמות הלא אטומות שלהם, עוברים חיים של דגי זברה סובלים היטב הדמיה (בנוסף להיותם שקופים), ושיטות גנטיות קיימות מספקות הזדמנויות פשוטות לניסויי הפלה וביטוי יתר, בנוסף לפיתוח טרנסגניות שימושיות37.

לאחרונה פותחו כלים אופטוגנטיים להפעלת איתות BMP38 ו-Nodal39 בעוברים של דגי זברה עם חשיפה לאור כחול (איור 1). אנו מתייחסים לכלים אלה כאל bOpto-BMP ו-bOpto-Nodal (b עבור אור כחול מופעל ו-Opto עבור אופטוגנטיקה). bOpto-BMP/Nodal מבוססים על מנגנוני הפעלת מסלולים דומים. הקישור של ליגנדות BMP או Nodal לקולטן המתאים שלהן serine-threonine kinases מניע אינטראקציות בתחום הקולטן קינאז המובילות לזרחון של אפקטי איתות (Smad1/5/9 עבור BMP ו- Smad2/3 עבור Nodal). לאחר מכן, גורמי איתות זרחניים עוברים טרנסלוקציה לגרעין ומווסתים את ביטוי גן המטרה3 (איור 1A,D). אינטראקציות קולטן קינאז אלה יכולות להיות תגובתיות לאור על-ידי צימוד קינאזות קולטן לחלבונים מתערבלים המגיבים לאור: עם חשיפה לאור, החלבונים הכימריים האלה אמורים להתעמעם, מה שגורם לתחומי הקולטן קינאז לקיים אינטראקציה ולהפעיל איתות (איור 1B,C,E,F). חשוב לציין, בניגוד לקולטנים אנדוגניים, bOpto-BMP/Nodal אינם מכילים תחומים קושרי ליגנדים חוץ-תאיים, מה שמבטיח פעילות בלתי תלויה בליגנד (איור 1C,F). אסטרטגיית הפעלה אופטוגנטית זו הושגה לראשונה עם קולטן טירוזין קינאזות40,41,42 ולאחר מכן יושמה על קולטן סרין-תראונין קינאזות.

bOpto-BMP/Nodal משתמש בתחום חישת אור-חמצן-מתח הומודימריזציה (LOV) המגיב לאור כחול (~450 ננומטר) מהאצות Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. המבנים האלה מורכבים ממוטיב מיריסטואילציה ממוקד קרום ואחריו תחומי קולטן BMP או Nodal receptor kinase, המאוחים לתחום LOV (איור 1B,E). חשיפה לאור כחול אמורה לגרום להומודימריזציה של LOV, וכתוצאה מכך לאינטראקציות בתחום הקולטן קינאז שיובילו לזרחן Smad ולהפעלת מסלול בהתאמה (איור 1C,F). עבור bOpto-BMP, נמצא כי שילוב של מבנים עם תחומי קולטן קינאז מסוג I מ-Acvr1l (הידוע גם בשם Alk8) ו-BMPR1aa (הידוע גם בשם Alk3) ותחום קולטן קינאז מסוג II מ-BMPR2a מפעיל בצורה אופטימלית איתות38 (Addgene #207614, #207615 ו-#207616). עבור bOpto-Nodal, שילוב של מבנים עם תחום קולטן קינאז מסוג I מ- Acvr1ba ותחום קולטן קינאז מסוג II מ- Acvr2ba משמש39.

bOpto-BMP/Nodal הוכנסו לעוברים מוקדמים של דגי זברה על ידי הזרקת mRNA בשלב התא האחד, ושימשו לחקר תפקיד משך האיתות בפירוש Nodal39, כדי לקבוע מדוע דגי זברה מאבדים את היכולת להגיב ל-Nodal45, וכדי לבחון כיצד גני המטרה של BMP מגיבים לרמות איתות BMP שונות38. סביר להניח כי כלים אלה ימשיכו להיות שימושיים במגוון רחב של חקירות עתידיות. עם זאת, כוחם של מפעילי איתות אופטוגנטי הוא גם חולשתם: דגימות רגישות לאור חייבות להיות מטופלות בזהירות כדי למנוע פעילות איתות חוץ רחמי בשוגג. חשיפה לאור החדר או לאור השמש יכולה להפעיל bOpto-BMP/Nodal.

פרוטוקול זה מספק הצעות מעשיות לשימוש במפעילי BMP ו-Nodal מבוססי LOV מקודדי mRNA בעוברים מוקדמים של דגי זברה. הוא מתחיל בפירוט אסטרטגיה אחת לבניית קופסת אור לבקרת חשיפה וטמפרטורה אחידות לאור (איור 2, קובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4, קובץ משלים 5, קובץ משלים 6, קובץ משלים 7, קובץ משלים 8). לאחר מכן הוא מתאר שני ניסויי בקרה מרכזיים שקובעים אם מפעיל איתות אופטוגנטי מתנהג כצפוי – כלומר, מפעיל פעילות מסלול רק כאשר הוא נחשף לאור (איור 3). בדיקת הבקרה הראשונה כוללת בחינת פנוטיפים יום אחד לאחר ההפריה בעוברים שנחשפו לאור ולא נחשפו (איור 3A). עוברים שנחשפו לאור בהזרקת mRNA, אך לא עוברים שלא נחשפו, צריכים להיות בעלי ביטוי יתר של BMP או Nodal (איור 4A,B; פנוטיפים BMP בפרט ניתנים להבחנה ברורה בנקודת זמן זו46). בדיקה זו מספקת קריאת פעילות מהירה. במבחן הבקרה השני, כדי לקבוע אם פנוטיפים נגרמים באופן ספציפי על ידי עודף BMP או איתות Nodal וכדי לצפות ישירות בשינוי ברמות האיתות, צביעה אימונופלואורסצנטית משמשת לזיהוי אפקטי איתות זרחניים (pSmad1/5/9 או pSmad2/3, בהתאמה) לאחר חשיפה לאור של 20 דקות סביב שלב הבלסטולה המאוחרת / הגסטרולציה המוקדמת, כאשר פעילות האיתות תוארה היטב12, 16,17,47,48,49,50 (איור 3B ואיור 4C). (שים לב שלמרות שהפעלה מקומית מרחבית הודגמה הן עבור bOpto-BMP38 והן עבור bOpto-Nodal39, פרוטוקול זה מתאר רק חשיפה אחידה לאור ואסטרטגיות הפעלת איתות.) מומלץ לבצע ניסויי בקרה אלה לפני החלת bOpto-BMP/Nodal על שאלות מחקר ספציפיות על מנת לקבוע תנאי ניסוי מקומיים אידיאליים.

פרוטוקול

פרוטוקולי המחקר של דגי הזברה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NICHD במכונים הלאומיים לבריאות (ASP 21-008). כל מחקרי דגי הזברה בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. בניית קופסת תאורה

  1. כדי לשלוט בחשיפה לאור ובטמפרטורה, בנו קופסת אור המשתמשת בתאורת מיקרו-לוחות של דיודה פולטת אור (LED) כמקור אור (איור 2A, טבלת חומרים, קובץ משלים 1, קובץ משלים 2). תאורה ניתנת להתאמה אישית זו מספקת שליטה דינמית וניתנת לתכנות על פני אורכי גל מרובים.
    הערה: ישנן אסטרטגיות אפשריות רבות לבניית קופסת אור, וגישה חלופית עשויה להיות מתאימה יותר (ראה למשל, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash 53, ועוד ב https://www.optobase.org/materials/).
  2. כלול את התכונות הבאות בתיבת התאורה: בקרת טמפרטורה (28 ° C אידיאלית לעוברים של דגי זברה), הרחקת אור לא רצוי (למשל, אור בחדר ואור שמש), העברה אחידה של אור כחול המכסה את אזור המטרה (למשל, צלחת 6 בארות), ושליטה על עוצמת האור ודינמיקת החשיפה.
    הערה: bOpto-BMP/Nodal מופעלים על ידי אור כחול, אך חלק מהכלים האופטוגנטיים מגיבים לאורכי גל אחרים. השתמש באורך הגל המתאים לכלי האופטוגנטי.
  3. קדח חור דרך החלק העליון של אינקובטור (איור 2B) שהוא מעט רחב יותר מעדשת יציאת ה-LED.
    1. יש לוודא שאין רכיבים חשמליים בחלק העליון של האינקובטור שייהרסו בקידוח (טבלת חומרים). ניתן לברר זאת על ידי פנייה ליצרן החממה ופנייה ישירה.
    2. אם יש חור קיים בלוח העליון של האינקובטור, השתמש במקדח שלב כדי להגדיל את גודל החור ל -1.25 אינץ '. אחרת, השתמש במסור חור בגודל 1.25 אינץ 'עם סוכה.
    3. אם יש לוחות פנימיים שחוסמים את מקור האור, קדח את גודל החור המתאים כדי לוודא שחרוט האור אינו חסום (איור 2A). לוחות עשויים בדרך כלל מפח מתכת דק, לכן השתמש במהירויות איטיות ובמקדחות מתכת כדי למנוע נזק (מומלץ מקדח קובלט).
  4. בניית מחזיק LED להצמדת תאורת המיקרו-פלטה LED לראש האינקובטור (איור 2C, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4, קובץ משלים 5, קובץ משלים 6, קובץ משלים 7, קובץ משלים 8).
    1. הרכיבו ארבע קוביות M3 על פיסת התושבת האנכית באמצעות ברגי M3.
    2. חבר את שני הסוגריים הצדדיים משמאל ומימין לקובייה של הסוגר האנכי. הרכיבו קובייה נוספת על החור שנותר בסוגריים הצדדיים.
    3. הרכיבו את פיסת התושבת האנכית למכלול תאורת מיקרו-צלחת LED (טבלת חומרים) באמצעות ברגי M6. הניחו את אטם עדשת ה-LED מעל עדשת מערכת ה-LED.
    4. הרכיבו את החלקים המורכבים לתושבת לוח האינקובטור, ולאחר מכן לסטנדים M3 בסוגריים האנכיים והצדדיים. מניחים את אטם האינקובטור מעל החור שנקדח על גבי האינקובטור.
    5. הניחו את תושבת פאנל האינקובטור על גבי אטם האינקובטור, וודאו שהאטם ופתחי הפאנלים מרוכזים עם חור האינקובטור. הרכיבו פאנל לראש האינקובטור באמצעות ברגים מס' 8. יש לוודא שהאטם אטום לאור.
  5. מניחים צלחת 6 בארות על המדף העליון של האינקובטור. קבעו אם קרן האור מכסה את הלוח באופן אחיד (איור 2A). השתמש בגיליון נייר כדי להציג באופן חזותי את כיסוי האור.
  6. אם הצלחת כולה אינה מכוסה על ידי הקורה, הגדל את המרחק בין LED לצלחת על ידי הזזת המדף כלפי מטה. עבור המערכת המתוארת כאן, ~ 14 אינץ 'בין LED למדף מספיק.
  7. השתמש במד אור כדי לקבוע את רמת הקרינה ואת האחידות המרחבית (טבלה של חומרים).
  8. כדי להימנע מחשיפה לא מכוונת לאור השמש ולאור החדר, השתמשו בהפשטת מזג האוויר כדי לוודא שדלת האינקובטור אטומה לאור (איור 2A).
  9. עוברים של דגי זברה מתפתחים בחוזקה בטמפרטורה של 28°C54. השתמש במדחום כרטיס זיכרון כדי להבטיח שתיבת האור מחזיקה 28 ° C.

2. יצירת mRNA להזרקה

הערה: pCS2+ הוא עמוד השדרה הווקטורי עבור מבנים bOpto-BMP38 ומבנים bOpto-Nodal39. וקטור זה עמיד בפני אמפיצילין. bOpto-BMP מורכב משלושה מבנים (איור 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): תחום קינאז פוטטיבי של קולטן BMPR1aa מסוג I (הידוע גם בשם Alk3) מאוחה ל-LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): תחום קינאז פוטטיבי של קולטן Acvr1l מסוג I (הידוע גם בשם Alk8) מאוחה ל-LOV; ו-BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): תחום קינאז פוטטיבי של קולטן BMPR2a מסוג II ותחום C-terminal הבא מאוחה ל-LOV. bOpto-Nodal מורכב משני מבנים (איור 1E): Acvr1ba-LOV: תחום קינאז פוטטיבי מסוג I קולטן Acvr1ba (הידוע גם בשם Acvr1b) מאוחה ל-LOV; Acvr2ba-LOV: תחום קינאז פוטטיבי של קולטן Acvr2ba מסוג II (הידוע גם בשם Acvr2b) התמזג עם LOV.

  1. כדי להפוך פלסמידים לליניאריים, יש לעכל בין 2-5 מיקרוגרם DNA פלסמיד באמצעות אנזים הגבלה NotI בטמפרטורה של 37°C למשך 1-3 שעות (Table of Materials).
    הערה: ניתן גם ליצור DNA ליניארי באמצעות פלסמיד כתבנית PCR.
  2. טיהור DNA באמצעות ערכת טיהור סטנדרטית מבוססת עמודות (Table of Materials).
  3. השתמש בערכת תמלול במבחנה SP6 כגון ערכת mMachine mMessage כדי לתמלל RNA מהתבנית הליניארית (Table of Materials). הגדר שתי תגובות בהתאם להמלצות היצרן כדי להבטיח תפוקה גבוהה יותר.
  4. טיהור RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA סטנדרטית מבוססת עמודות (רשימת חומרים). אפשר גם לטהר באמצעות משקעים.

3. הזרקת mRNA

  1. לפחות יום אחד לפני הזרקות, להכין כלי הזרקה צלחות מצופה אגרוז 6 בארות.
    1. הכינו 200 מ"ל של 1% אגרוז בעובר דג זברה בינוני וחממו במיקרוגל עד שהאגרוז התמוסס לחלוטין. כל מדיום עובר רגיל של דג זברה צריך להיות מקובל; עם זאת, אל תכלול מתילן כחול בתווך העוברי, שכן הוא יכול להשפיע על הדמיה במורד הזרם ביישומים אחרים.
    2. בזהירות יוצקים אגרוז מותך לתוך 100 מ"מ x 15 מ"מ כלי פטרי פלסטיק. ממלאים את הכלים באמצע הדרך.
    3. שוטפים תבנית צלחת הזרקה עם מדיום עוברי ומניחים בעדינות על אגרוז מותך, כדי לוודא שלא נלכדות בועות בין התבנית לאגרוז. השתמש בסרט כדי ליצור לשונית בגב התבנית למיקום ושליפה קלים.
    4. העובש צריך לצוף באגרוז מותך. אם התבנית שוקעת, הסר בזהירות מן agarose מותך ולחזור על שלב 3.1.3.
    5. לאחר שהאגרוז התמצק, השתמשו בלשונית כדי להסיר בעדינות את התבנית. זה יכול להיות מואץ על ידי הצבת צלחת ב 4 °C (75 °F).
    6. הכינו צלחות 6 בארות מצופות אגרוז אם עובדים עם עוברים דכוריוניים לניסויים אימונופלואורסצנטיים.
    7. השתמש פיפטה פלסטיק חד פעמי 10 מ"ל כדי להעביר מספיק agarose מותך כדי לכסות את החלק התחתון של כל באר של צלחת 6 באר.
    8. אחסנו צלחות הזרקה וצלחות 6 בארות בטמפרטורה של 4°C. ניתן להשתמש בהם מיד או לאחסן עד שהאגרוז מתייבש או מזוהם (בדרך כלל 2-3 שבועות).
    9. הכינו קצוות פיפטה מזכוכית בוערת אם אתם עובדים עם עוברים דכוריוניים לניסויים אימונופלואורסצנטיים.
    10. מכניסים את קצה פיפטת הזכוכית ללהבת מבער Bunsen ומסובבים ברציפות עד שהקצוות חלקים. עוברים דכוריוניים חייבים להתאים בנוחות דרך קצה הפיפטה. אין לאפשר לפתח להתכווץ מתחת לקוטר העובר.
    11. לרכוש או למשוך מחטי מיקרו-הזרקה (טבלה של חומרים). מומלץ שיהיו מחטים נוספות זמינות ביום ההזרקות למקרה שיהיה צורך בהחלפה.
  2. יום לפני ההזרקות, הקימו מגדלי דגי זברה על פי נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של המכון (SOPs). יש להפריד בין זכרים לנקבות.
    1. הפעל את וסת הטמפרטורה של תיבת האור כדי לשמור על 28 ° C. כדי להבטיח שטמפרטורת תיבת האור תישאר על 28°C, נטרו את הטמפרטורה באמצעות מדחום כרטיס זיכרון (Table of Materials).
    2. הכינו תערובות הזרקת mRNA. הזריקו כמויות שוות ערך של כל מבנה. יש לקבוע אמפירית איזו כמות להזריק.
    3. גדלי התמליל של bOpto-BMP הם כדלקמן:
      Acvr1l-LOV = 2007 נוקלאוטידים (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. כדי להזריק כמויות שוות ערך, הזריקו פי 1.01 יותר ממבנה Acvr1l מאשר BMPR1aa; הזריקו פי 1.72 יותר מבנה BMPR2a מאשר BMPR1aa.
    5. גדלי התמליל של bOpto-Nodal הם כדלקמן:
      Acvr1ba-LOV ו- Acvr2ba-LOV שניהם 1962 nt.
    6. כדי להזריק כמויות שוות-משקל, יש להזריק את אותה כמות של כל מבנה.
    7. הכינו תערובות הזרקה שוות ערך, המשלבות את כל ה-mRNA המכוונות למסלול אחד לתערובת הזרקה אחת. כלול נותב הזרקה אדום פנול אם תרצה. עבור הנתונים המוצגים באיור 4, נעשה שימוש ב-15 pg של כל מבנה bOpto-Nodal (Acvr1ba-LOV ו-Acvr2ba-LOV), ועבור bOpto-BMP 7.8 pg Acvr1l-LOV ו-BMPR1aa-LOV, ו-13.4 pg BMPR2a-LOV.
    8. יש לאחסן את תערובות ההזרקה בטמפרטורה של -20°C. לאחר קביעת הריכוז האופטימלי של תערובת ההזרקה, לעשות 5-10 μL aliquots ולאחסן ב -20 ° C או -80 ° C.
  3. יום ההזרקה
    1. אם אתם מבצעים בדיקת פנוטיפ (איור 3A), הזריקו דרך הכוריון ישירות למרכז התא בשלב של תא אחד בהתאם ל-SOP של המעבדה שלכם. הכוריון מגן על העוברים מפני גורמי עקה סביבתיים ושומר על העוברים הליזיים. זה מועיל במהלך הניקוד לכימות מדויק של עוברי ליזה (איור 4A,B).
    2. אם מבצעים בדיקת אימונופלואורסנציה (איור 3B), בסופו של דבר יהיה צורך לבצע דה-כוריונציה של עוברים לצורך הדמיה (איור 4C). לכן, יש להזריק ישירות למרכז התא של עוברים דכוריוניים בשלב החד-תאי (ראו Rogers et al.55 for dechorionating protocol). לחלופין, עוברים יכולים להיות dechorionated באופן ידני לאחר קיבוע, אבל זה יותר מסורבל מאשר dechorionating עם pronase.
    3. השתמש פיפטות זכוכית להבה לטיפול בעוברים dechorionated (שלב 3.1.10). יש להקפיד לא לחשוף עוברים מפורקים לאוויר או לפלסטיק, מה שיגרום לעוברים לשכב. טפלו בעדינות בעוברים שעברו דה-כוריוניזציה.
    4. הכינו מנה נוספת של עוברים שלא הוזרקו כפרוקסי להערכת התקדמות השלב (ראה שלב 4.3.5). ודא שהעוברים מיופה כוח הם מאותה קבוצה של עוברים ניסיוניים, כך שכל העוברים הופרו באותו זמן מאותם הורים. זה שימושי עבור בדיקת immunofluorescence שבו השלב רלוונטי אבל הוא מיותר עבור בדיקת פנוטיפ.
    5. השתמש בתנאים הבאים הן עבור הפנוטיפ והן עבור בדיקות immunofluorescence: 1) לא מוזרק, לא חשוף, 2) לא מוזרק, חשוף לאור, 3) מוזרק, לא חשוף, 4) מוזרק, חשוף לאור. בחר לפחות 30 עוברים בכל מצב. לבריאות מיטבית של העובר, אין לדגור על יותר מ-30 עוברים לבאר בצלחת בעלת 6 בארות.
    6. לאחר ההזרקה, יש להעביר את העוברים לצלחות פטרי מסומנות או לצלחות 6 בארות מצופות אגרוז (לעוברים דכוריוניים) ולדגור בטמפרטורה של 28°C. עוברים עדיין אינם רגישים לאור. יש להתייחס לעוברים מוזרקים כאילו הם רגישים לאור לאחר שעה וחצי לאחר ההפריה (hpf).

4. ניסוי חשיפה לאור

הערה: חשיפה לאור ~450 ננומטר עם קרינה של 45 ואט/מ"ר2 מפעילה בעוצמה את bOpto-BMP/Nodal ללא רעילות אור ברורה (למידע על מד אור, ראה טבלת חומרים). ניתן לכוונן את רמת האיתות המופעל באופן אופטוגני על ידי שינוי ערכי הקרינה38. עם זאת, יהיה צורך להעריך פוטוטוקסיות בקרינה גבוהה יותר.

  1. שלב תלוי זמן. בשלב של 4 עד 16 תאים, בסביבות 1.5 hpf, להסיר עוברים לא מופרים ולא בריאים. יש לחלק מחדש במידת הצורך כדי להבטיח מספר זהה של עוברים בכל באר (לא יותר מ-30).
    הערה: חשוב לבצע שלב זה סביב שלב 4 עד 16 תאים מכיוון שהעוברים יהפכו רגישים לאור כאשר ה- mRNA המוזרק מתורגם לחלבון. לא ראינו ראיות לכך שהעוברים רגישים לאור באופן משמעותי לפני 1.5 hpf. כדי למזער פוטואקטיבציה בשוגג בעת הערכת עוברים לאחר 1.5 hpf, השתמש באורות אדומים, או כסה מקורות אור - כולל שלבי מיקרוסקופ - בנייר מסנן ג'ל אדום החוסם אורכי גל כחולים המתעמעמלים LOV (רשימת חומרים).
    1. להעריך עוברים באופן עקבי כדי להבטיח חלוקה בלתי משוחדת בין תנאים וניסויים.
  2. עבור בדיקת הפנוטיפ, השתמש בפרוטוקול החשיפה לאור הבא של יום אחד החל מ- 1.5 HPF (איור 3A).
    1. עטפו את צלחת הבקרה הלא חשופה ברדיד אלומיניום. צלחת זו צריכה לכלול גם עוברים שאינם מוזרקים וגם עוברים מוזרקים. ודאו שהצלחת מכוסה לחלוטין והקפידו לא להכניס קרעים לנייר הכסף. הניחו את הצלחת הזו על המדף התחתון של קופסת האור בטמפרטורה של 28°C (איור 2A).
    2. הניחו את הצלחת החשופה על המדף העליון של קופסת האור בטמפרטורה של 28°C (איור 2A). ודא שהכיסוי נמצא על הצלחת כדי למנוע אידוי בינוני של העובר. הפעל את האור הכחול (קרינה של 45 W/m2 מפעילה איתות חזק).
    3. סגור את דלת תיבת האור כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לאור החדר. אם תרצה, כלול מדחום כרטיס זיכרון בתוך תיבת האור לפני סגירת הדלת. אין לפתוח את הדלת עד שהפנוטיפ יגיע ליום אחד לאחר ההפריה (dpf; ראה שלב 5.1).
  3. עבור בדיקת immunofluorescence, לחשוף עוברים לאור כחול במשך 20 דקות החל סביב 40% epiboly56 (~ 6 hpf) ולתקן מיד לאחר חשיפה לאור, יחד עם הבקרות שלא נחשפו (איור 3B). חשיפה של 20 דקות לאור כחול ב-40% אפיבולי מפעילה את האיתות.
    1. בסביבות 1.5 כ"ס, עוטפים בנפרד את הכלים החשופים והלא חשופים ברדיד אלומיניום. יש לוודא שהכלים מכוסים לחלוטין ולהיזהר שלא להכניס קרעים לנייר הכסף. השאירו את צלחת הפרוקסי לא עטופה. הניחו את הכלים העטופים ואת צלחת הפרוקסי הלא עטופה בקופסת אור של 28°C (איור 2A). אל תדליק עדיין את נורית ה-LED.
    2. אם בודקים יותר מכמות mRNA אחת, עבור המצב הלא חשוף, יש למיין עוברים המוזרקים בכמויות שונות לתוך לוחות 6 בארות מצופות אגרוז בודדים, אשר יסייעו למזער חשיפה לאור בשוגג במהלך הקיבוע הבא.
    3. סגור את דלת תיבת האור כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לאור החדר.
    4. יש לדלל את מלאי הפורמלדהיד ל-4% במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ולהעלות 1 מ"ל לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות תחתונות עגולות של 2 מ"ל המסומנים מראש, צינור אחד לכל מצב. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    5. בסביבות 5 hpf, להסיר את צלחת proxy המכילה עוברים שאינם מוזרקים ולהעריך את השלב ההתפתחותי באמצעות היקף ניתוח. שלב העוברים הפרוקסי צריך לשקף את שלב העוברים הרגישים לאור בכלים העטופים.
    6. הסירו גם את הכלים העטופים, כך שכל הכלים יחוו את אותה טמפרטורה. חזור על הפעולה עד שעוברי פרוקסי הגיעו ל -40% אפיבולי (~ 6 hpf). התקדמות האמבריוגנזה רגישה לטמפרטורה54; לכן, ככל שהכלים נמצאים זמן רב יותר מחוץ לאינקובטור, כך ייקח יותר זמן עד שהעוברים יגיעו ל-40% אפיבולי.
    7. לאחר שהעוברים מיוצגים הגיעו ל-40% אפיבולי, פתחו את העטיפה של הכלי החשוף והניחו אותו על המדף העליון של קופסת האור (איור 2A). השאירו את הכלים הלא חשופים עטופים והניחו על המדף התחתון. הפעל מיד את האור הכחול, סגור את הדלת והגדר טיימר למשך 20 דקות (קרינה של 45 W/m2 מפעילה איתות).
    8. כדי להתכונן לקיבוע, הימנעו ככל האפשר מאור בחדר (סגרו את תריסי החלונות, כבו את האורות העליונים, כבו מסכים וכו'). ודא שהצינורות המכילים פורמלדהיד מסומנים כראוי. מיד לפני הקיבוע, יש להסיר את הצינורות המכילים פורמלדהיד מ-4°C ולהניח ליד קופסת האור.
    9. שלב רגיש לזמן ולאור. היו מוכנים לנוע במהירות בתום 20 דקות החשיפה לאור. לאחר 20 דקות, פתחו את דלת קופסת האור והוציאו את הצלחת שלא נחשפה.
    10. השתמשו בקצה פיפטה מזכוכית בוערת כדי להעביר עוברים רגישים לאור במהירות אך בעדינות לתוך הצינור המתאים המוכן של 4% פורמלדהיד.
    11. מזער את זמן ההעברה (<45 שניות) של עוברים רגישים לאור כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לאור. ודא שאין בועות אוויר בפיפטה. חשיפה לאוויר תהרוס עוברים דכוריוניים.
    12. כדי להוציא עוברים לפורמלדהיד, יש לטבול את קצה פיפטת הזכוכית בפורמלדהיד ולאפשר לעוברים לשקוע בנוזל. מזערו את כמות תווך העובר המועברת לפורמלדהיד על ידי שמירה על העוברים בקצה הקצה.
    13. לאחר החזרת העוברים, החזירו את פיפטה לאותה באר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לעקור עוברים תקועים. זה מונע מעוברים ממצבים מרובים להגיע בטעות לצינור אחד.
    14. חזור מיד על שלבים 4.3.11-4.3.13 עבור עוברים לא חשופים ולא מוזרקים, ולאחר מכן העוברים החשופים (מוזרקים ולא מוזרקים).
    15. יש לאחסן עוברים קבועים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.

5. הערכת ניסוי

  1. ניקוד והדמיית פנוטיפ
    1. ב 1 dpf, באופן אידיאלי בין 24-32 hpf, להסיר עוברים מן תיבת האור כדי להעריך פנוטיפים באמצעות היקף ניתוח וליצור כותרת ניקוד. זוהי נקודת הסיום הניסיונית; פוטואקטיבציה בשוגג כבר אינה מהווה דאגה.
    2. הניקוד עוברים בעודם בכוריון בקלות. השתמש פיפטה או בדיקה כדי להזיז עוברים כדי לראות מזוויות מרובות.
      1. עוברים החווים איתות BMP עודף יעברו גחון בדרגות חומרה שונות כמתואר בפירוט ב- Kishimoto et al. 199746 (איור 4A, לוח שמאלי). לעוברים שחווים איתות נודאלי עודף יהיו מגוון של פגמים התפתחותיים הקשורים לעודף מזנדודרם (איור 4A, פאנל ימני)1,3,47,57,58,59,60. לעתים קרובות הם ישכבו על ידי 1 dpf.
    3. ציון כל עובר בכל התנאים (איור 4B). רכשו תמונת סקירה כללית של כל העוברים בכל באר. אם תרצו, בצעו דה-כוריונאט ודמיינו עוברים מייצגים בודדים במתילצלולוז (איור 4A).
  2. צביעה והדמיה אימונופלואורסצנטית
    1. לאחר דגירה על עוברים בפורמלדהיד 4% ב-4°C למשך הלילה, יש להסיר פורמלדהיד ולשטוף 3-5x עם 1x מלח חוצץ פוספט עם Tween20 (PBST). הסר PBST והוסף 100% מתנול.
    2. סגרו את הצינורות והפכו אותם בעדינות כדי לערבב שאריות PBST ומתנול. יש לשטוף פעמיים עם מתנול ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך שעתיים לפחות עד שנים.
    3. עבור pSmad1/5/9 (BMP) immunofluorescence protocol ראה Rogers et al.38. עבור pSmad2/3 (Nodal) immunofluorescence protocol ראה van Boxtel et al.17 and Rogers et al.47.
    4. תמונה של עוברים מוכתמים במערכת החיסון, באמצעות מיקרוסקופ המסוגל לבצע חתך אופטי (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או יריעת אור). יש להימנע מרוויה ולשמור על תנאי הדמיה זהים בין כל הדגימות המוכתמות באותו נוגדן.
    5. התמונה תוך 5 ימים מהשלמת הצביעה האימונופלואורסצנטית מכיוון שהפלואורסצנטיות עלולה לדהות עם הזמן.

תוצאות

המטרה של שני ניסויי הבקרה המתוארים כאן היא לקבוע אם bOpto-BMP/Nodal מפעילים את המסלולים שלהם בהתאמה בתגובה לחשיפה לאור כחול מבלי להשפיע על איתות בהיעדר אור, כצפוי. השתמש בפקדים אלה כדי לקבוע את זרימת העבודה הניסיונית המתאימה במעבדה שלך לפני החלת bOpto-BMP/Nodal על שאלות המחקר המעניינות אותך.

בדיקת הפנוטיפ יכולה להסתיים תוך יומיים בלבד, והיא מספקת אינדיקציה שימושית לפעילות איתות ופוטוטוקסיות (איור 3A). עוברים מוזרקים, חשופים לאור כחול צריכים פנוסקופיה עודף איתות BMP (ventralization46; איור 4A, פאנל שמאלי) או איתות נודאלי (פגמים התפתחותיים הקשורים למזנדודרם נוסף 1,3,47,57,58,59,60 (איור 4A, פאנל ימני)). אם מוזרקים, עוברים שנחשפו לאור הם אפנוטיפיים, בדקו את איכות ה-mRNA ושקלו להזריק יותר, ובדקו שוב את אסטרטגיית החשיפה לאור כדי להבטיח חשיפה קבועה לאור בהיר (~450 ננומטר אור עם קרינה של 45 W/m2 אמור להפעיל איתות חזק). לעומת זאת, עוברים מוזרקים ולא חשופים צריכים להיראות זהים לאחים שאינם מוזרקים. אם מוזרקים, עוברים שלא נחשפו מציגים פנוטיפים, מפחיתים את כמות ה-mRNA המוזרק ומעריכים מחדש את מערך הניסוי כדי להבטיח שעוברים שלא נחשפו מוגנים מפני חשיפה לאור. הנתונים המוצגים באיור 4B מראים תוצאות מניסויי פנוטיפ טיפוסיים עם כמויות mRNA מתאימות ותנאי חשיפה: פעילות איתות חזקה ניכרת בעוברים מוזרקים החשופים לאור, כאשר רק חלק קטן מהעוברים המוזרקים והלא חשופים מציגים פנוטיפים.

בדיקת הפנוטיפ מספקת גם הזדמנות להעריך פוטוטוקסיות. אם רעילות האור זניחה, עוברים שאינם מוזרקים וחשופים לאור צריכים להיראות פראיים, בדומה לעוברים שאינם מוזרקים ולא חשופים. אם לעוברים שאינם מוזרקים, חשופים לאור יש פגמים, אך לא עוברים שלא הוזרקו ולא נחשפו, שקול להפחית את קרינת האור. קרינה של 45 W/m2 מפעילה איתות חזק ללא פוטוטוקסיות ברורה. הנתונים המוצגים באיור 4B אינם מראים הבדלים מדאיגים בין עוברים שאינם מוזרקים, חשופים לאור ועוברים שאינם מוזרקים ולא חשופים, מה שמצביע על רעילות אור זניחה.

למרות שמבחני האימונופלואורסצנטיות דורשים יותר זמן ומאמץ (~ 1 שבוע) בהשוואה לבדיקת הפנוטיפ (יומיים), צביעה אימונופלואורסצנטית מספקת קריאה ישירה של פעילות מסלול האיתות ועשויה לחשוף שינויי איתות עדינים שעשויים שלא לבוא לידי ביטוי במורפולוגיה גסה. אימונופלואורסנציה חשובה במיוחד להערכת תגובות ל-bOpto-Nodal, מאחר שאיתות נודאלי עודף גורם לעתים קרובות לעוברים לשכב ב-1 dpf – דבר שיכול להיות בעל סיבות רבות – בניגוד לפנוטיפים הספציפיים של הגחון האופייניים לאיתות BMP עודף46 (איור 4A). עוברים מוזרקים וחשופים לאור כחול צריכים להציג עלייה אחידה בזרחן Smad1/5/9 או Smad2/3 בהשוואה לעוברים שלא הוזרקו ונחשפו לאור. אם הרמות אינן עולות, או רק עולות חלש, בדקו את איכות ה-mRNA ושקלו להזריק יותר, ובדקו שוב את אסטרטגיית החשיפה לאור. חשיפה של 20 דקות לאור כחול עם קרינה של 45 W/m2 סביב 40% epiboly אמורה להפעיל חזק את האיתות. אם צביעת pSmad אינה אחידה, נסו להזריק mRNA למרכז התא (ולא לחלמון), מה שעשוי לגרום לפיזור mRNA אחיד יותר.

עוברים מוזרקים ולא חשופים צריכים להיות בעלי רמות pSmad דומות לעוברים שאינם מוזרקים. באופן אנקדוטלי, ראינו זרחן Smad דולף יותר עם bOpto-Nodal מאשר bOpto-BMP. אם רמות pSmad מוגברות בעוברים מוזרקים ולא חשופים, הפחיתו את כמות ה-mRNA המוזרק. בנוסף, להעריך מחדש את מערך הניסוי כדי להבטיח 1) עוברים שלא נחשפו לאור, 2) חשיפה לאור במהלך הקיבוע היא מינימלית. במהלך שלב הקיבוע, קריטי לאפשר לא יותר מ 45 שניות לחלוף בין הסרה מקופסת האור לטבילה בפורמלין. בנוסף, במהלך שלב זה צמצם את החשיפה לאור החדר ולאור השמש על ידי סגירת תריסי חלונות, כיבוי מקורות אור לבנים, שימוש באור אדום או כיסוי מקורות אור לבנים בנייר מסנן ג'ל חוסם אור כחול (רשימת חומרים).

הנתונים באיור 4C מראים את התוצאות מניסויי צביעה אימונופלואורסצנטיים טיפוסיים עם כמויות mRNA מתאימות ותנאי חשיפה לאור: רמות pSmad דומות בעוברים שלא הוזרקו ולא נחשפו, בעוד שעוברים מוזרקים וחשופים לאור מציגים רמות גבוהות יותר של זרחן Smad.

figure-results-1
איור 1: אסטרטגיית הפעלת איתות bOpto-BMP ו-Nodal . (A) מסלול האיתות האנדוגני BMP מופעל על-ידי קשירת ליגנד BMP, מה שמוביל להיווצרות קומפלקס קולטנים מסוג I/II, זרחן של Smad1/5/9 וביטוי של גני מטרה מסוג BMP. קולטני הסוג I BMPR1aa ו- Acvr1l ידועים גם בשם Alk3 ו- Alk8, בהתאמה. BMPR2a הוא קולטן מסוג II. (B) bOpto-BMP בונה38. תחומי קינאז פוטטיביים מ- BMPR1aa ו- Acvr1l מאוחים ל- LOV; היתוך BMPR2a-LOV מכיל את תחום הקינאז המשוער ואת תחום הקולטן C-terminal (CTD). כל האיחויים ממוקדים בקרום עם מוטיב מיריסטואילציה (Myr). הדומיינים מופרדים על ידי מקשרים גליצין-סרין (GS). מבנים מתויגים ב- CTD עם תג אפיטופ HA. שילוב זה של שלושה מבנים נמצא כמפעיל באופן אופטימלי איתות BMP. (C) הפעלת איתות BMP בתיווך bOpto-BMP. כאשר נחשפים לאור כחול, תחומי LOV מתפוגגים, מה שנחשב כמעורר היווצרות מורכבת והפעלת איתות. (D) מסלול האיתות הנודאלי האנדוגני מופעל על ידי קשירת ליגנד נודאלי, מה שמוביל להיווצרות קומפלקס קולטנים מסוג I/II, זרחן של Smad2/3 וביטוי של גני מטרה נודליים. קולטן מסוג I Acvr1ba וקולטן מסוג II Acvr2ba ידועים גם בשם Acvr1b ו- Acvr2b, בהתאמה. (E) bOpto-Nodal מבנים39. דומיינים של קינאז פוטטיבי מ-Acvr1ba ו-Acvr2ba מאוחים ל-LOV. כל האיחויים ממוקדים בקרום עם מוטיב מיריסטואילציה (Myr). דומיינים מופרדים על ידי מקשרי GS. מבנים מתויגים ב- CTD עם תג אפיטופ HA. (F) הפעלת איתות Nodal בתיווך bOpto-Nodal. כאשר נחשפים לאור כחול, תחומי LOV מתפוגגים, מה שנחשב כמעורר היווצרות מורכבת והפעלת איתות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: קופסת אור מבוקרת טמפרטורה לניסויים אופטוגנטיים . (A) תאורת מיקרו-פלטת LED מותקנת בראש האינקובטור באמצעות מחזיק LED שנבנה בהתאמה אישית. עוברים של דגי זברה בצלחת בת 6 בארות על המדף הראשון נחשפים לאור דרך חור שנקדח בחלק העליון של האינקובטור. המדף התחתון מכיל קבוצה שנייה של עוברי ביקורת לא חשופים בצלחת 6 בארות עטופה ברדיד אלומיניום. דלת האינקובטור מרופדת בהפשטת מזג אוויר כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לאור החדר או לאור השמש. (ב) פירוט ההליך ליצירת חור באינקובטור באמצעות מקדח שלבים. במודל החממה הנהוג כאן יש פאנל פנימי שדרש קידוח חור שני, גדול יותר (Table of Materials). (C) פירוט מחזיק ה-LED המותאם אישית המיועד למערכת תאורה בשלושה אורכי גל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זרימת עבודה של ניסוי bOpto-BMP/Nodal. בדיקת פנוטיפ וצביעה אימונופלואורסצנטית pSmad לבדיקת פעילות bOpto-BMP/Nodal. עוברים מוזרקים עם mRNA בשלב התא האחד ומועברים לתיבת אור לא יאוחר מ 1.5 שעות לאחר ההפריה (hpf). (A) בדיקת פנוטייפ. עוברים מוזרקים ואחים שאינם מוזרקים גדלים בחושך או נחשפים לאור כחול אחיד החל מ- 1.5 HPF ועד יום אחד לאחר ההפריה (DPF). ניתן להעריך את פעילות האיתות האופטוגנטי על ידי ניקוד עוברים עבור פנוטיפים התואמים לפעילות מסלול עודפת. (B) צביעת pSmad immunofluorescence. עוברים מוזרקים ואחים שאינם מוזרקים גדלים בחושך עד 40% אפיבולי (~ 6 hpf). מחצית מהעוברים המוזרקים וחצי מהעוברים שאינם מוזרקים נחשפים לאור כחול אחיד למשך 20 דקות. לאחר החשיפה, כל העוברים קבועים ונתונים לכתמים אימונופלואורסצנטיים עבור pSmad. רמות גבוהות של pSmad1/5/9 או pSmad2/3 משקפות הפעלה אופטוגנטית של איתות BMP או Nodal, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הערכת תגובות איתות המופעלות באמצעות אור בעוברים של דגי זברה. לעוברים של דגי זברה הוזרקו בשלב התא האחד mRNA המקודד bOpto-BMP/Nodal. (A) העוברים גודלו בחושך או נחשפו לאור כחול אחיד החל משעה וחצי לאחר ההפריה (HPF). פנוטיפים הובקעו ביום אחד לאחר ההפריה (dpf). מוצגים פנוטיפים מייצגים. איתות BMP עודף מוביל לגחון (פאנל שמאלי), בעוד איתות נודאלי עודף גורם לפגמים התפתחותיים הקשורים למזנדודרם נוסף (פאנל ימני). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) כימות פנוטייפ. עוברים מוזרקים ואחים שלא הוזרקו גודלו בחושך החל מ-1.5 HPF (נורה שחורה). מחצית מהעוברים שהוזרקו ומחצית מהעוברים שלא הוזרקו נחשפו לאור כחול אחיד (נורה כחולה). (C) עוברים מוזרקים ואחים שלא הוזרקו גודלו בחושך החל מ-1.5 HPF (נורה שחורה). ב-40% אפיבולי (~6 hpf), מחצית מהעוברים שהוזרקו ומחצית מהעוברים שלא הוזרקו נחשפו לאור כחול אחיד (נורה כחולה). לאחר 20 דקות, כל העוברים תוקנו ועברו צביעה אימונופלואורסצנטית עבור Smad1/5/9 זרחני או Smad2/3. עוצמות pSmad גבוהות יותר מצביעות על איתות BMP/Nodal מוגבר, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הרכבה מלאה של קופסת אור. קובץ PDF תלת-ממדי המציג תצוגה תלת-ממדית של מכלול תיבת האור המלאה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תצוגת תיבת אור מפוצצת. קובץ PDF תלת-ממדי המציג תצוגה תלת-ממדית של מכלול קופסת האור שהתפוצצה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: אטם קל גדול. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור אטם האור הגדול עבור מחזיק ה- LED באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: אטם קל קטן. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור אטם האור הקטן עבור מחזיק ה- LED באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: בסיס פלטפורמה אקרילית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור בסיס פלטפורמה אקרילי מחזיק LED באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: פלטפורמה אקרילית אנכית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור מחזיק LED פלטפורמה אקרילית אנכית באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: תמיכה אקרילית משמאל. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) כדי לייצר את מחזיק ה- LED תמיכה אקרילית שמאלית באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 8: זכות תמיכה אקרילית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) כדי לייצר את מחזיק ה- LED תמיכה ימנית אקרילית באמצעות חותך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

הזרקת mRNA היא האסטרטגיה הנוכחית לספק bOpto-BMP/Nodal לעוברים של דגי זברה. שיטה זו יש כמה חסרונות. ראשית, הכמות המתאימה של mRNA משתנה בין מעבדות. הכמות המשמשת צריכה להספיק להפעלת איתות חזק עם חשיפה לאור, אך ללא הפעלה חשוכה בשוגג. זה רעיון טוב לבדוק כמה כמויות כדי למצוא רמות mRNA אופטימליות, ולאחר התבססות, ליצור aliquots של תערובת אב כדי לשחזר את אותה כמות של mRNA. שנית, פיזור לא אחיד של mRNA מוזרק עלול להוביל להפעלת איתות לא אחיד. הזרקה למרכז התא (לא לחלמון) נחשבת כמקדמת אפילו פיזור mRNA. לבסוף, מכיוון ש-mRNA מוזרק מתפרק עם הזמן, גישה זו עשויה שלא להתאים לניסויים בעוברים ישנים יותר. בעתיד, בעיות אלה יוכלו להיות מטופלות על ידי קווי דגי זברה טרנסגניים המבטאים בכל מקום bOpto-BMP/Nodal עם מקדם אימהי או תרופתי הניתן להשראת סמים. למרות שעבודה עם דגי זברה בוגרים רגישים לאור עשויה להיות אתגר בהקשר זה, דגי זברה 61,62 ודרוזופילה 22,34,35,63 טרנסגניים בעלי כלים אופטוגנטיים פותחו בהצלחה.

הימנעות מפוטואקטיבציה בשוגג היא אתגר כללי עם כלים אופטוגנטיים. לשם הפשטות, יש להתייחס לעוברים מוזרקים מעל 1.5 HPF כרגישים לאור. לעתים קרובות ניתן להימנע מחשיפה לא מכוונת לאור פשוט על ידי עטיפת צלחות או כלים ברדיד אלומיניום. עם זאת, עבור ניסויים הדורשים תצפית חזותית של עוברים חיים מעל 1.5 hpf, ניתן להשתמש במקורות אור אדום או לכסות מקורות אור לבן עם נייר מסנן ג'ל זול החוסם אורכי גל dimerizing LOV (טבלה של חומרים).

קופסת האור המתוארת כאן מיועדת ליישומים ספציפיים הדורשים שליטה מדויקת על רמות קרינת האור, הדינמיקה ואורכי הגל (איור 2). יתרונות נוספים של קופסת אור זו כוללים חשיפה אחידה לאור, חימום דגימה זניח בשוגג, מקום רב למספר לוחות בעלי 6 בארות, ומקורות אור בעלי תוחלת חיים ארוכה ומאופיינים היטב מבחינה ספקטרלית. עם זאת, אסטרטגיות חשיפה שונות לאור עשויות להיות עדיפות בהתאם ליישום המחקר. מעבדות רבות פיתחו מערכות חשיפה אחידות פשוטות וחסכוניות יותר לאור עם טביעות רגל קטנות יותר, כולל ציפוי אינקובטורים עם פסי LED, תליית לוחות LED מעל דגימות, או שילוב נורות LED במכסי צלחת תרבית 32,38,39,40,64,65,66. חשוב לציין, תיבת האור המשמשת בפרוטוקול זה אינה מאפשרת למשתמשים לווסת באופן עצמאי בארות בודדות (בניגוד ל- Bugaj et al.52) או לספק שליטה מרחבית על החשיפה לאור. הפעלה אופטוגנטית מקומית מרחבית הודגמה עם bOpto-BMP38 ו- bOpto-Nodal39 באמצעות לייזרים במערכות SPIM או קונפוקליות, בהתאמה, ומומשה גם עם אסטרטגיות אופטוגנטיות רבות אחרות במגוון מערכות מודל (נדון ברוג'רס ומולר12). גישות מסוימות אף השיגו רזולוציה מרחבית תת-תאית 29,30,31. למרות שיישום מערכות חשיפה לאור מקומיות מרחבית הוא מחוץ לתחום פרוטוקול זה, ניסויי הפעלה מרחבית עם bOpto-BMP/Nodal אפשריים תיאורטית עם ציוד מיוחד כגון מכשירי מיקרו-מראה דיגיטליים או גישות מיסוך. הקוראים מוזמנים לחקור את הספרות הנרחבת על קופסאות אור DIY לניסויים אופטוגנטיים לפני שהם מתחייבים לאסטרטגיית חשיפה לאור (ראו למשל, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash 53 ועוד at https://www.optobase.org/materials/).

אסטרטגיות אופטוגנטיות מולקולריות מציעות לעתים קרובות רמה גבוהה יותר של שליטה מרחבית-זמנית על תהליכים ביולוגיים בהשוואה לגישות היסטוריות כגון מוטנטים, ביטוי גנים חוץ רחמי, חלבונים רקומביננטיים ותרופות. קוראים המעוניינים ביתרונות של גישות אופטוגנטיות יכולים לחקור כלים אחרים שפורסמו בדגי זברה ובאורגניזמים אחרים. אלה כוללים כלים למניפולציה של מסלולי איתות נוספים 32,65,67,68, ויסות ביטוי גנים 61,64,66,69,70,71, שינוי לוקליזציה של חלבונים 31,72 והפעלת אפופטוזיס 62. כלים אלה ורבים אחרים מקוטלגים בנוחות ב-OptoBase, משאב אינטרנט לגישות אופטוגנטיקה מולקולרית28. עבור אלה שקיבלו השראה ליצור כלים אופטוגנטיים חדשניים, המשאב כולל גם תיאורים שימושיים של חלבונים מגיבים לאור ששימשו במגוון רחב של אסטרטגיות, כולל חלבונים מגיבים לאור המגיבים לאורכי גל ירוקים, אדומים ואינפרא אדום קרוב. אנו נרגשים עבור הקהילה המדעית לממש את מלוא הפוטנציאל של גישות אופטוגנטיות מולקולריות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מימון לפרוטוקול זה ניתן על ידי תוכנית NICHD Intramural ל- KWR (ZIA HD009002-01). אנו מודים לג'ף פארל ולמעבדתו על המשוב מאיר העיניים שלהם, לוויל אנדרסון על התמיכה הטכנית המצוינת, ליאן יאנוצ'י על בדיקת הפרוטוקול ומדידת הקרינה, ולמתקן דגי הזברה המשותף של NIH על עבודתם הקשה בשמירה על בריאות דגי הזברה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>בניית קופסת אור & פרוטוקול חשיפה לאור
#8 x 1 אינץ' בורג קידוח עצמי משושהMcMaster-Carr99663A2221.4.5
מד כוח ואנרגיה אופטי דיגיטליThorLabsPM100D1.7
4
אינקובטור (142 ליטר)Boekel Scientific1394001.3.1
תושבת לוח חממה (אקריליק שחור יצוק בעובי 1/4 אינץ')מותאם אישית חלק / פיימונטה פלסטיקIncubator_panel1.4.4
מקדח צעד חריץ ספירלי גדול HSSCO-ZSDB0001TA1.3.2
אטם חממה; 1/32 אינץ' עבה סיליקון שחורMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
תאורת מיקרופלייט LEDPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10 מ"מ קובייה Standoffניוארק Eletronics005.60.5331.4.1
M3 x 10 מ"מ 316SS בורג ראש שטוחMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10 מ"מ 316SS בורג ראש שטוחMcMaster-Carr91801A3051.4.3
מדחום לכרטיס זיכרוןFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
מיקרוסקופ ראש חיישן מד כוח שקופיות (150 mW)ThorLabsS170C1.7< br/> 4
נייר סינון ג'ל אדום #E106רוסקו / B& H צילום & אלקטרוניקה110084014805-E1064.2.1
סוגריים צדדיים (אקריליק שחור יצוק בעובי 1/4 אינץ')חלק מותאם אישית / פלסטיק פיימונטהSide_bracket1.4.2
תושבת אנכית (אקריליק שחור יצוק בעובי 1/4 אינץ')חלק מותאם אישית / פלסטיק פיימונטהVertical_bracket1.4.1
הפשטת מזג אוויר: קצף EPDM קל, 1/2 אינץ' wd 1/4 אינץ' tkMcMaster-Carr8694K121.8
<חזק>יוצר mRNA
EZNA MicroElute מחזור טהור ערכהאומגהD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
חממת מיקרו-דגימה (Hybex)SciGene1057-30-02
חממת מיקרו-דגימה 1.5 מ"ל בלוק צינור (Hybex)SciGene1057-34-02
Nanodrop ספקטרופוטומטר אחדתרמו מדעיND-ONE-W2.4
NotI-HF אנזים הגבלהניו אינגלנד ביולאבס (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene2076152
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
ערכת מיני RNeasy (250 rxns)Qiagen741062.3
<חזק>הזרקת mRNA
אגרוז (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
כוסות זכוכית 250 מ"לFisherbrandFB1002503.3.2
צלחות 6 בארות (מארז של 50)Falcon08 772 1B3.1.6
B-8A מפרק כדורNarishigeB-8A3.3
יחידת לחץ אחורי (רכיב אסדת מיקרו-הזרקה)מכשור מדעי יישומי (ASI)BPU3.3
מתג רגל (רכיב אסדת מיקרו-הזרקה)מכשור מדעי יישומי (ASI)מעמד מגנטי FWS3.3
GJ-1NarishigeGJ-13.3
נימי זכוכית (4 אינץ', OD 1 מ"מ, נימה)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
תחתיות צלחת פטרי מזכוכית (להסרת שריון)פיירקס08-748A3.3.2
פיפטות זכוכית (5 3/4 אינץ' עם קצה רחב)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
תבניות כלי הזרקהכלי מדע אדפטיבייםtu13.1.3
צלחת ברזל IPNarishigeIP3.3
M-152 מיקרומניפולטורNarishigeM-1523.3
ערכת מחזיק מיקרו פיפטה (רכיב אסדת מיקרו-הזרקה)מכשור מדעי יישומי (ASI)MIMPH-MPIP-Kit3.3
מיקרומטרMeiji Techno AmericaMA2853.3
MPPI-2 מזרק לחץ (רכיב אסדת מיקרו-הזרקה)מכשור מדעי יישומי (ASI)MPPI-33.3
מושך מחטיםWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
צלחות פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ, מארז של 500)Falcon08-757-100D3.1.2
פיפטור (10 מ"ל, ירוק)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
בקבוקי סחיטה (500 מ"ל)Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3
אטם עדשת LED ,

מקורות

  1. Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
  2. Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
  3. Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274(2018).
  4. Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
  5. Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107(2022).
  6. Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
  7. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  8. Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
  9. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  10. Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103(2022).
  11. Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
  12. Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
  13. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
  14. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 341-372 (2022).
  15. Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977(2019).
  16. Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
  17. van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
  18. Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
  19. Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
  20. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  21. Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990(2009).
  22. Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
  23. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
  24. Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
  25. Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205(2020).
  26. Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
  27. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
  28. Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
  29. Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
  30. Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
  31. Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
  32. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093(2019).
  33. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  34. Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258(2017).
  35. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
  36. Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
  37. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
  38. Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641(2020).
  39. Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
  40. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
  41. Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197(2022).
  42. Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
  43. Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
  44. Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M. Photoreactions of aureochrome-1. Biophysical Journal. 100 (11), 2801-2809 (2011).
  45. Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832(2018).
  46. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
  47. Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785(2017).
  48. Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042(2015).
  49. Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101(2009).
  50. Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
  51. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
  52. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  53. Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917(2022).
  54. Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  55. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266(2015).
  56. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  57. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  58. Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
  59. Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
  60. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  61. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  62. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640(2020).
  63. Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
  64. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  65. Patel, A. L., et al. Optimizing photoswitchable MEK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25756-25763 (2019).
  66. LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818(2021).
  67. Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
  68. Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
  69. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  70. Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
  71. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  72. Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BMPNodalSmad

מאמרים קשורים