הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי, אבחון ודירוג גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית

3.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65740

⸱

17 במאי 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

פיתחנו מתודולוגיה להערכה אם גידולים במערכת העצבים בעכברים מהונדסים גנטית משחזרים במדויק את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים. כאן, אנו מיישמים טכניקות היסטולוגיות אלה, קריטריונים פתולוגיים מוגדרים ומתודולוגיות תרבית על נוירופיברומות וגידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית הנובעים במודל העכבר P 0-GGFβ3.

תקציר

חולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) מפתחים בדרך כלל נוירופיברומות פרספקס (PNs) שלאחר מכן הופכות לגידולי מעטפת עצב היקפיים אגרסיביים ביותר (MPNST). הבנת התהליך שבו נוירופתיה היקפית הופכת ל-MPNST תתאפשר הודות לזמינותם של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) המשחזרים במדויק את התקדמות PN-MPNST שנצפתה בבני אדם עם NF1. למרבה הצער, דגמי GEM עם אבלציה Nf1 אינם משחזרים תהליך זה במלואו. זה הוביל אותנו לפתח עכברי P 0-GGFβ3, מודל GEM שבו ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann neuregulin-1 (NRG1) בתאי Schwann גורם להתפתחות של PNs המתקדמים להיות MPNST בתדירות גבוהה. עם זאת, כדי לקבוע אם גידולים והתקדמות ניאופלסטית בעכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את התהליכים שנצפו בחולי NF1, היינו צריכים להוכיח תחילה שהפתולוגיה של גידולי מעטפת העצבים ההיקפיים P0-GGFβ3 משחזרת את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים.

כאן, אנו מתארים את המתודולוגיות המיוחדות המשמשות לאבחון מדויק ולציון גידולים במערכת העצבים ההיקפית במודלים של GEM, באמצעות P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים כדוגמה. אנו מתארים את השיטות ההיסטולוגיות, האימונוהיסטוכימיות וההיסטוכימיות המשמשות לאבחון PNs ו- MPNSTs, כיצד להבחין בין גידולים אלה לבין סוגי גידולים אחרים המחקים את הפתולוגיה שלהם, וכיצד לדרג גידולים אלה. אנו דנים בהקמת תרביות מעבר מוקדמות מ- GEM MPNSTs, כיצד לאפיין תרבויות אלה באמצעות אימונוציטוכימיה, וכיצד לאמת את הגידול שלהן על ידי הקמת allografts. באופן קולקטיבי, טכניקות אלה מאפיינות את הפתולוגיה של PNs ו- MPNST המתעוררים במודלים של GEM ומשווים באופן ביקורתי את הפתולוגיה של גידולים מורינים אלה לעמיתיהם האנושיים.

מבוא

במהלך שלושת העשורים האחרונים, מעבדות רבות ניסו ליצור מודלים עכבריים של סרטן אנושי על ידי החדרת מוטציות הקשורות לסרטן אנושי לתוך הגנום של העכבר או על ידי ביטוי יתר של תוצר גנטי המתבטא יתר על המידה בסרטן אנושי. המודלים המתקבלים של עכבר מהונדס גנטית (GEM) יכולים לשמש למגוון מטרות, כגון קביעה כי השינוי הגנומי החדש שהוכנס יוזם גידול, זיהוי שינויים גנטיים או אפיגנטיים אחרים המתרחשים לאחר מכן התורמים להתקדמות הגידול, והגדרת מסלולי האיתות העיקריים המניעים את התחלת הגידול והתקדמותו. שלא כמו מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט, המסתמכים על שימוש בעכברים מדוכאי חיסון, למודלים של סרטן GEM יש מערכת חיסונית מתפקדת במלואה ולכן מודל מדויק יותר של תגובות לחומרים טיפוליים מועמדים. עם זאת, בעת שימוש במודלים של סרטן GEM למטרות כגון אלה, חיוני שהחוקרים יאשרו כי תצפיות שנעשו עם גידולי GEM רלוונטיים לעמיתיהם האנושיים. אימות זה צריך לכלול הערכה יסודית של הפתולוגיה של גידולי GEM וקביעה האם התכונות הפתולוגיות של גידולי GEM משחזרות את הפתולוגיה של סוג הגידול האנושי המתאים.

תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1) היא המחלה הגנטית הנפוצה ביותר המשפיעה על מערכת העצבים האנושית, המתרחשת בערך 1 מכל 3,000-3,500 לידות חי 1,2,3. אנשים הסובלים מ- NF1 מפתחים גידולים שפירים מרובים במעטפת העצבים ההיקפית הידועים בשם נוירופיברומות בעורם (נוירופיברומות עוריות) ובעצבים גדולים ובמקלעי עצבים (נוירופיברומות פרקסיפורם). בעוד שגם נוירופיברומות עוריות וגם פרסיפורמות מחמירות את איכות החיים של המטופל על ידי ייצור ליקוי פיזי, התנהגותי ו / או חברתי, נוירופיברומות פרספקס (PNs) מסוכנות במיוחד 4,5. הסיבה לכך היא כי PNs לעתים קרובות להפוך גידולים ממאירים מעטפת עצב היקפי (MPNST), שהם neoplasms תאי ציר אגרסיבי עם שיעור הישרדות נמוך במיוחד 1,2. במידה רבה, שיעור הישרדות נמוך זה נובע מכך שמשטרי הרדיו והכימותרפיה המשמשים כיום לטיפול ב- MPNST אינם יעילים. עם זאת, פיתוח טיפולים חדשים ויעילים יותר היה מאתגר. הסיבה לכך היא, למרות כמה נפוץ MPNST להתרחש בחולים NF1, הם עדיין neoplasms נדיר. כתוצאה מכך, קשה מאוד להשיג מספר גדול של גידולים אנושיים למחקר; זה גם מאתגר לגייס מספיק חולים עם MPNST לניסויים קליניים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרו מספר מודלים של GEM במטרה להשיג תובנות נוספות לגבי החריגות המניעות פתוגנזה נוירופיברומה והתקדמות PN-MPNST ולהקל על ניסויים פרה-קליניים עם סוכנים טיפוליים מועמדים.

לחולי NF1 יש מוטציות לא פעילות בעותק אחד של הגן NF1. נוירופיברומה פתוגנזה מופעלת כאשר מוטציה משביתה בגן NF1 הפונקציונלי הנותר מתרחשת בתא בשושלת תאי Schwann. עם זאת, באופן מפתיע, כאשר עכברים נוצרו עם מוטציות Nf1 שהשביתו את קו הנבט, הם לא פיתחו נוירופיברומות 6,7. ההדגמה העוקבת כי עכברים עם תאי Schwann Nf1-null ו- Nf1 haploinsufficiency בכל סוגי התאים האחרים (Krox20-Cre;Nf1flox/- עכברים) פיתחו נוירופיברומות פרספקס הציעו כי מינון מופחת של גן Nf1 בסוגי תאים נוספים נדרש עבור נוירופיברומהפתוגנזה 8. גם אז, נוירופיברומות פרספקס ב Krox20-Cre; עכברי Nf1flox/- לא התקדמו והפכו ל-MPNST ולכן חיקו רק חלקית את הביולוגיה של עמיתיהם האנושיים. פתוגנזה של MPNST אכן התרחשה כאשר מוטציות Nf1 היו שותפות עם מוטציות בגנים מדכאי גידול נוספים כגון Trp539 או Cdkn2a10, אך MPNST במודלים אלה של GEM התפתחו דה נובו או מניאופלזמות נוירופיברומטיות לא טיפוסיות בעלות פוטנציאל ביולוגי לא בטוח (ANNUBPs)11,12, ולא מנוירופיברומות שפירות שפירות קיימות (ראו13,14 לסקירות מצוינות של מודלים אלה, כמו גם מודלים אחרים המציגים מוטציות נוספות הקשורות לאובדן תפקוד הקשור ל- MPNST בגנים כגון Suz12 ו- Pten15).

מודלים אלה של עכברים היו יקרי ערך לביסוס התפקיד שגנים כגון NF1, TP53 ו- CDKN2A ממלאים בפתוגנזה של גידולים במערכת העצבים ההיקפית הקשורים ל- NF1 ובניסויים פרה-קליניים הבוחנים סוכנים טיפוליים מועמדים. עם זאת, עדיין יש לנו הבנה חלקית של התהליך שבו נוירופיברומות פרספקס מתקדמות להיות גידולים נוירופיברומטיים לא טיפוסיים של פוטנציאל ביולוגי לא בטוח (ANNUBPs16) ולאחר מכן MPNSTs. לאחרונה חלה התקדמות מסוימת בהבנת תהליך זה עם הדיווח האחרון כי עכברים עם מחיקות ב-Nf1 וב-Arf מפתחים ANNUBPs שמתקדמים והופכים ל-MPNSTs11. עם זאת, מודלים עכבריים מבוססי מוטציה Nf1 המשחזרים באופן מלא את תהליך התקדמות הפרספקס נוירופיברומה-MPNST שנראה בבני אדם עדיין אינם קיימים. בנוסף, לא ברור אם ישנם מספר מסלולים נפרדים המובילים לפיתוח MPNST. בהתחשב בכך, ייתכן כי GEMs שתוארו לעיל רק מודל של תת-קבוצה של מספר מסלולים שונים המובילים להתקדמות נוירופיברומה-MPNST ופתוגנזה MPNST. נקודה זו מודגשת על ידי העובדה כי MPNSTs להתרחש גם באופן ספורדי וכי כמה MPNST ספורדיים כנראה אין מוטציות NF1 17,18.

למרות שנקודה אחרונה זו אותגרה על ידי ההצעה האחרונה של Magollon-Lorenz et al. כי לפחות כמה MPNST ספורדיים חסרי מוטציות NF1 הם מלנומה או סוג אחר של סרקומה19, לאחרונה דיווחנו MPNST ספורדי וקו תאים נגזר מגידול זה (2XSB תאים) שהיה NF1 פראי סוג20. במהלך אפיון גידול האב וקו תאי 2XSB, שללנו באופן שיטתי אפשרויות אבחון חלופיות, כולל מלנומה וסוגי סרקומה רבים אחרים הנשקלים באופן שגרתי באבחנה המבדלת של גידול נדן עצב היקפי ממאיר ספורדי20. בנוסף, נציין כי Magollon-Lorenz et al. הכירו בכך שלא ניתן להכליל את ממצאיהם בשלושת קווי תאי MPNST הספורדיים שהם חקרו כדי להצביע על כך שכל הגידולים שזוהו כ- MPNST ספורדיים אינם MPNST.

כדי לבנות מודל GEM שבו נוירופיברומה ופתוגנזה MPNST לא היו תלויות בהכרח במוטציות ספציפיות של גנים מדכאי גידולים, יצרנו עכברים טרנסגניים שבהם ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann החזק neuregulin-1 (NRG1) הונע על ידי מקדם חלבון המיאלין הספציפי לתאי Schwann (P0) (עכברי P 0-GGFβ3)21. הראינו בעבר כי נוירופיברומות, MPNST וקווי תאים MPNST אנושיים מבטאים מספר איזופורמים של NRG1 יחד עם קולטן erbB טירוזין קינאזות (erbB2, erbB3 ו-erbB4) המתווכים איתות NRG1 וכי קולטני erbB אלה מופעלים באופן קונסטיטוטיבי22. הראינו גם שמעכבים פרמקולוגיים של קינאזות erbB מעכבים בעוצמה התפשטות MPNST22, הישרדות23 והגירה24. בהתאם לתצפיות שלנו בבני אדם, עכברי P 0-GGFβ3 מפתחים נוירופיברומות פרספקס25 שמתקדמות והופכות ל-MPNST בתדירות גבוהה21,25. הראינו כי P 0-GGFβ3 MPNSTs, כמו עמיתיהם האנושיים, מפתחים בדרך כלל מוטציות של Trp53 ו- Cdkn2a, כמו גם הפרעות גנומיות רבות אחרות שעשויות לתרום לגידולים25. ל-MPNST המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3 אין מוטציות Nf1 משביתות. עם זאת, באמצעות השלמה גנטית, הראינו כי NRG1 מקדם גידולים בעכברי P 0-GGFβ3 בעיקר באמצעות אותם מפלים איתות המשתנים על ידי אובדן Nf1 26; מסקנה זו מבוססת על קביעתנו כי החלפת ביטוי יתר של NRG1 בהפסד Nf1 בנוכחות Trp53 haploinsufficiency (P 0-GGFβ3;Trp53+/- עכברים) מייצר בעלי חיים שבהם MPNST מפתחים דה נובו, כפי שניתן לראות ב- cis-Nf1+/-; Trp53+/- עכברים27.

כדי להשיג מידע זה ומידע אחר המוכיח כי עכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את תהליכי הפתוגנזה של נוירופיברומה והתקדמות נוירופיברומה-MPNST שנצפו בבני אדם עם NF1, פיתחנו מתודולוגיות מיוחדות לעיבוד רקמות מבעלי חיים אלה, אבחון מדויק של הגידולים שלהם, דירוג MPNST המתעוררים בעכברים אלה, ביסוס ואפיון מעבר מוקדם P0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; Trp53+/- תרביות MPNST והשוואה ביקורתית של הפתולוגיה של P 0-GGFβ3 PNs ו- MPNST ו- P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs לזה של עמיתיהם האנושיים. רבות מהמתודולוגיות הללו ניתנות להכללה למודלים אחרים של GEM של ניאופלזיה של מערכת העצבים. בנוסף, כמה ממתודולוגיות אלה ישימות באופן רחב יותר למודלים של GEM שבהם גידולים מתעוררים באתרי איברים אחרים. כתוצאה מכך, כאן אנו מציגים תיאור מפורט של מתודולוגיות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובוצעו על ידי אנשי צוות מאומנים כראוי בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים של MUSC.

1. קביעת חדירת הגידול והישרדותו בעכברי P 0-GGFβ3 וזיהוי גידולים בבעלי חיים אלה לצורך אפיון נוסף

  1. ליצור את הקבוצה של עכברים כי יוערכו עבור tumorigenesis. מספר העכברים הנדרש תלוי בחדירה של פנוטיפ הגידול. כדי לפצות על הפסדים כאלה, התחל עם קבוצה כי הוא 10-15% גבוה יותר מאשר המספר הסופי הרצוי של בעלי חיים.
    הערה: קבענו אמפירית חדירת גידול בעכברי P 0-GGFβ3 בקבוצה ראשונית של 50 עכברים (שישה מהם אבדו מסיבות שאינן קשורות לנאופלזיה (למשל, לחימה))25.
  2. להעריך את בריאותם של בעלי חיים שלוש פעמים בשבוע ולתעד ציוני מצב גוף, כולל משקל, ושינויים התנהגותיים בכל בדיקה. להפסיק עכברים נושאי גידול או עכברים מתים (ראה הערה להלן) באמצעות המתת חסד פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם. גיל שיא במוות בימים. אם הגידולים נראים כלפי חוץ, רשמו את ממדי הגידול (אורך, רוחב וגובה).
    הערה: חיוני שבעלי חיים לא יורשו להתקדם מעבר לגודל הגידול המרבי המותר ו/או לנקודת הקצה ההומנית שאושרו על ידי IACUC.
  3. באמצעות גיל המוות, קבע עקומת הישרדות קפלן-מאייר כדי לקבוע את הגיל הממוצע במוות ואת טווח ההישרדות.
    הערה: P 0-GGFβ3 עכברים היו בגיל ממוצע למוות של 261.5 ימים, עם טווח של 74-533 ימים; ל-91% מהקבוצה שלנו היו נוירופיברומות מרובות ול-71% היו MPNST21.
  4. לקבוע אם גידולים גלויים באופן גס קיימים, ואם הם, לנתח אותם בתנאים סטריליים כדי לקבוע אם הגידול קשור לעצב היקפי ולאחר מכן הבלו את הגידול. ב-P 0-GGFβ3 וב-P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים, גידולים היקפיים במעטפת העצבים נמצאים לרוב בעצבים הטריגמינליים והסכיאטיים. גם אם גידולים גלויים לעין אינם נראים בקשר עם עצבים אלה, לתקן ולהטמיע עצבים אלה כמתואר להלן, כך שניתן יהיה לבדוק את נוכחותם של מיקרו-גידולים. מיקרו-גידולים מתרחשים בדרך כלל בתוך הגרעינים הקשורים לעצבים אלה.
  5. חתכו גידולים גלויים באופן גס לשלוש חתיכות (איור 1A). השתמש בסעיף 1 להיסטולוגיה (קטעי פרפין, אימונוהיסטוכימיה והיסטוכימיה). השתמש בסעיף 2 כדי לבסס תרבויות מעבר מוקדם. הקפאת הצמדה לחתיכה 3 (באמצעות חנקן נוזלי) לניסויים עתידיים אפשריים (למשל, אימונובלוטים, RNA ובידוד DNA).
  6. תקן חלק 1 ב 4% paraformaldehyde במי מלח חוצצים פוספט (PBS) לילה ב 4 oC. לתקן את שאר הגוף של החיה על ידי טבילה 4% paraformaldehyde לילה ב 4 ° C.

2. שיבוץ פרפין של גידולים גלויים לעין והכנת חלקים המוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין להערכה אבחנתית ראשונית

  1. שיבוץ פרפין של גידולים גלויים בצורה גסה
    1. לאחר קיבוע חתיכת גידול 1 לילה ב 4% paraformaldehyde, לשטוף את הרקמה על ידי הצבתו בנפח של PBS כי הוא לפחות פי 10 יותר מאשר נפח הרקמה במשך 15 דקות; יש להשתמש באותו נפח עבור כל השטיפות הבאות. יש לחזור על שתי שטיפות PBS נוספות בנות 15 דקות, תוך שימוש בנפח חדש של PBS עבור כל שטיפה.
    2. העברת חתיכת הגידול 1 עד 70% אתנול. להחזיק את הרקמה 70% אתנול במשך 24 שעות ב 4 ° C. אם תרצה, לאחסן את הרקמה לטווח ארוך בתנאים אלה.
      הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.7 ניתנים לטובת חוקרים שאין להם גישה למכונה מסחרית לעיבוד רקמות. אם לחוקר יש גישה למעבד רקמות, הרקמה תעובד באמצעות אתנולים וקסילנים מדורגים בהתאם לפרוטוקול המכשיר המתוכנת.
    3. מעבירים חתיכת גידול 1 עד 80% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הדגירה במשך 30 דקות נוספות בנפח טרי של 80% אתנול.
    4. העברת חתיכת הגידול 1 עד 95% אתנול במשך 75 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על הדגירה פעמיים נוספות, בכל פעם למשך 75 דקות נוספות בנפח טרי של 95% אתנול.
    5. מעבירים את חתיכת הגידול 1 עד 100% אתנול ודגרים במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הדגירה של 60 דקות פעמיים נוספות, בכל פעם באמצעות נפח טרי של 100% אתנול.
    6. מעבירים את פיסת הגידול 1 לממס על בסיס די-לימונן ודגרים במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את חתיכת הגידול 1 לנפח טרי של הממס על בסיס די-לימונן ודגרים למשך 30-60 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
    7. מעבירים את פיסת הגידול 1 לממס מבוסס פרפין 1:1/d-לימונן למשך שעה אחת ב-60 מעלותצלזיוס. יש להשליך את הממס על בסיס פרפין 1:1 ולהעביר את פיסת הגידול 1 ל-60 oC פרפין ולדגור במשך 20 דקות ב-60 oC. לחזור על הדגירה בנפח טרי של 60 oC פרפין פעם נוספת למשך 20 דקות. לדגור על חתיכת גידול 1 בפרפין לילה ב 60 oC.
    8. יוצקים שכבת בסיס של פרפין לתוך תבנית היסטולוגיה פלדה ולתת לו להתמצק. מעבירים את חתיכת הגידול 1 אל פני השטח של פרפין הבסיס ומיד לאחר המיקום, מכסים את הרקמה בפרפין 60 oC ומניחים את קלטת הרקמה על גבי ובקשר עם הפרפין המותך. מעבירים את התבנית לצד הקר של תחנת ההטבעה ונותנים לה להתמצק למשך 10-15 דקות.
    9. מוציאים את גוש הפרפין עם קלטת הרקמה המצורפת מהתבנית. השתמש בקסטת הרקמה המצורפת כדי להדק את הבלוק לתוך המיקרוטום במהלך החיתוך.
      הערה: כעת ניתן לאחסן את בלוק הפרפין ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
  2. הכן hematoxylin וחלקים מוכתמים eosin של גידולים גלויים ברוטו.
    1. חתכו 4-5 מיקרומטר מקטעים של רקמת הגידול באמצעות מיקרוטום והרכיבו אותם על שקופיות זכוכית טעונות חיובית.
    2. כדי לבצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), יש לבצע דה-פרפין של חלקי הרקמה על ידי דגירה של השקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לחזור על הדגירה בנפח חדש של ממס על בסיס די-לימונן למשך 10 דקות.
    3. מעבירים את המגלשות ל-100% אתנול ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את המגלשות לנפח חדש של 100% אתנול ודגרים עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. מעבירים את המגלשות לאתנול 95% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את המגלשות לנפח חדש של 95% אתנול ודגרים עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. מעבירים את המגלשות לאתנול 70% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מעבירים לאתנול 50% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. מעבירים את המגלשות למים מזוקקים ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. הכתימו את המגלשות על ידי טבילתן בהמטוקסילין למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 1-2 דקות. להבדיל על ידי טבילת שקופיות 2-5x ב 0.5% חומצה הידרוכלורית ב 70% אתנול. יש לשטוף באמבט מי ברז זורמים למשך 1-2 דקות. מניחים את המגלשות באתנול 95% עם 0.5% חומצה אצטית למשך 10 שניות.
    8. צבעו את המגלשות עם eosin-Y למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העבירו את המגלשות לאתנול 100% למשך 5 דקות. נקו את הדגימות בממס על בסיס די-לימונן למשך 5 דקות.
    9. ההרכבה מכסה את החלקות באמצעות אמצעי הרכבה מבוסס קסילן בזמן שהמגלשה עדיין רטובה עם ממס מבוסס D-לימונן. הניחו למדיום ההרכבה להתייצב למשך הלילה.
      הערה: אין להשתמש באמצעי הרכבה על בסיס מים.
  3. הכינו רקמות ללא גידולים גלויים לעין כדי לזהות נוירופיברומות פרספקס ומיקרו-MPNSTs. הטמיעו את הרקמות בפרפין, הכינו חלקים היסטולוגיים והכתימו חלקים אלה בהמטוקסילין ובאאוסין.
    1. הסירו את האיברים הפנימיים והטמיעו חלקים מייצגים של כל איבר בפרפין כדי להכין חלקים מוכתמים ב-H&E שייבדקו לעדות מיקרוסקופית לגידולים (איור 1B). הסירו את הראש, הגפיים הקדמיות, הגפיים האחוריות והזנב (איור 1C). כדי לבחון את חוט השדרה ושורשי העצבים באתרם כדי לאתר עדויות לגידולים בשורש העצב, יש לסלק את עמוד השדרה ואת הצלעות הקשורות אליו ואת הרקמה הרכה על ידי טבילה ב- 0.3 M EDTA / 4% paraformaldehye (pH 8.0) למשך 48-72 שעות ב- 4 oC; לאחר מכן, שטפו את הדגימות עם 1x PBS. בסוף ההסתיידות, ודא כי decalcification הושלם על ידי ניסיון לנקב את עמוד השדרה עם מחט. הסתיידות מוצלחת אם המחט חודרת בקלות לעצם מבלי להתכווץ.
    2. חתכו את עמוד השדרה המסויד ואת המבנים הקשורים אליו לגושים שיתאימו לקלטת רקמות. יש לייבש באמצעות אתנולים מדורגים ולאחר מכן באמצעות ממס מבוסס d-לימונן, כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.7. הטמיעו בפרפין והכינו מקטעים של 4-5 מיקרומטר כמתואר בשלבים 2.1.7-2.2.1. לבצע כתמי H&E כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.9; הניחו למדיום ההרכבה להתייצב למשך הלילה.

3. לזהות נוירופיברומות פרספקס פוטנציאליות ולבצע כתמים מיוחדים כדי לאשר אבחנות

הערה: אנו ממליצים בחום לכלול פתולוג אנושי או וטרינרי מנוסה בהערכת H&E וכתמים מיוחדים של חתכי גידול GEM.

  1. בחן את השקופיות המוכתמות ב- H&E שהוכנו כמתואר לעיל באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לזהות גידולים פוטנציאליים במעטפת העצבים ההיקפית. מכיוון שנוירופיברומות ו- MPNST מתעוררים בתוך עצבים היקפיים, חשוב לקבוע אם גידולים מיקרוסקופיים קשורים לעצב היקפי. זהה בלוקים עם גידולים פוטנציאליים במעטפת העצבים ההיקפית, כך שניתן יהיה לבצע אימונוכתמים וכתמים מיוחדים אחרים כדי לאשר או להפריך אבחונים.
  2. הבחין בין PNs פוטנציאליים לבין MPNST / גידולים אחרים ברמה גבוהה בהתבסס על תכונות היסטולוגיות שנצפו במהלך בדיקת שדה בהיר של חלקים מוכתמים H&E. נוירונים היקפיים אנושיים הם גידולים היפר-תאיים קלים המורכבים בעיקר מתאים עם גרעינים מוארכים, לעתים קרובות גליים. באזורים רבים, התאים ארוזים באופן רופף וניתן להפריד אותם על ידי חומר חוץ-תאי מיקסואיד; PNs בעכברי P 0-GGFβ3 הם בעלי מראה דומה. מיטוזים בדרך כלל אינם נוכחים; אם כן, והגידול הוא היפר-תאי בינוני עד גבוה, הגידול הוא MPNST או סוג אחר של ניאופלזמה ברמה גבוהה (ראה להלן).
  3. PNs מורכבים מתערובת של תאי Schwann ניאופלסטיים וסוגי תאים אחרים שאינם ניאופלסטיים כגון תאי פיטום. כדי לאשר את זהותה של נוירופתיה היקפית, בצע אימונוכתמים עבור סמני תאי Schwann S100β ו-Sox10 וסמן תא הפיטום CD117 (c-Kit) על מקטעים מבלוקים המכילים PNs פוטנציאליים שזוהו בבדיקת H&E (ראה סעיף 3.4 לאפשרויות צביעה חלופיות של סמן תאי פיטום). בצע Ki67 immunostains כדי לאשר שיעורי התפשטות נמוכים.
    הערה: טבלה 1 מפרטת את סמני האנטיגן המשמשים לזיהוי שגרתי של נוירופיברומות פרספקס GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), לאבחון MPNSTs, ולהערכה מלאה של סוגי תאים אחרים הקיימים בנוירופיברומות; אנו מכתימים אנטיגנים אחרונים אלה רק כאשר אנו מתארים לראשונה מודל GEM חדש. עיין בגליון הנתונים של יצרן הנוגדנים לקבלת התנאים המומלצים. שים לב אם עלון יצרן הנוגדנים ממליץ על שליפת אנטיגן; לא כל האנטיגנים דורשים שליפה כדי להיות ניתנים לזיהוי.
    1. הכינו 4-5 מקטעים מיקרומטר מגושי הפרפין שנבחרו והרכיבו אותם על שקופיות טעונות חיובית. ביטול פירוק מקטעים כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6.
    2. יש לשטוף חלקים עם PBS אחד במשך 3-5 דקות.
    3. אם יצרן הנוגדנים ממליץ על שליפת אנטיגן, הכינו מאגר ציטראט. ערבבו 9 מ"ל של תמיסת חומצת לימון (10.5 גרם חומצת לימון ב-500 מ"ל מים מזוקקים) ו-41 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט (14.7 גרם נתרן ציטראט ב-500 מ"ל מים מזוקקים).
    4. בצעו שליפת אנטיגן על ידי הנחת שקופיות במאגר ציטראט למשך 20 דקות בסיר לבישול אורז מחומם.
    5. העבר מחליק לתוך 3% מי חמצן / 1x PBS במשך 10 דקות כדי למנוע פעילות peroxidase ברקמה.
      הערה: הפוך תמיסה זו לרעננה בכל פעם ואל תשתמש בתמיסת המלאי של מי חמצן אם היא ישנה יותר מ 3-4 חודשים.
    6. יש לשטוף את המקטעים ב-PBS אחד.
    7. חסום מקטעים באמצעות מאגר חסימה (2% BSA, 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS) למשך שעה אחת. שטפו שקופיות לזמן קצר ב-1x PBS.
    8. הוסף נוגדן ראשוני לחלקי רקמות. הכינו נוגדנים ראשוניים במאגר חוסם מדולל. לדגור על שקופיות במשך 2 שעות ב 37 oC או לילה ב 4 oC.
    9. שטפו שקופיות ב-1x PBS למשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3x.
    10. לדגור על רקמה עם נוגדן משני biotinylated במשך 1-2 שעות.
    11. הכן תמיסת דיאמינובנזידין (DAB) המבוססת על פרוטוקול היצרן וטבול שקופיות בתמיסה למשך 2-10 דקות. שטפו מגלשות במים במשך 5 דקות.
    12. יש לנטרל כתמים על ידי טבילתם בהמטוקסילין למשך 10-15 דקות. יש לחשוף למים זורמים עד שהם צלולים. יש לטבול במהירות מגלשות באלכוהול ולשטוף את המגלשות במים.
    13. יש לייבש שקופיות באתנולים מדורגים על ידי טבילה מהירה של שקופיות, פי 4-5 לכל תמיסה, ב-70% אתנול, 95% אתנול ולאחר מכן 100% אתנול. דגרו על שקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 2 דקות. יש לדגור על שקופיות באצווה שנייה של ממס מבוסס די-לימונן למשך 2 דקות.
    14. הרכבה של שקופיות עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן.
    15. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield.
    16. עבור immunofluorescence, להשמיט שלבים 3.3.10-3.3.15. במקום זאת, דגרו על רקמה עם נוגדן משני ספציפי למין המדולל בחיץ חוסם למשך 1-2 שעות.
    17. שטפו שקופיות ב-PBS אחד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3 פעמים.
    18. הרכבה של שקופיות באמצעות PBS/גליצרול אחד.
    19. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. שיטה חלופית להכתמת תאי פיטום: צביעה כחולה טולוידין
    1. הכן תמיסת מלאי כחול toluidine על ידי המסת 1 גרם של toluidine כחול O ב 100 מ"ל של 70% אתנול.
    2. הכינו תמיסת נתרן כלורי 1% (NaCl) על ידי המסת 0.5 גרם NaCl ב-50 מ"ל מים מזוקקים. מערבבים עד להתמוססות. כוונן את רמת החומציות לכ-2.0-2.5 באמצעות HCl.
      הערה: תמיסת NaCl זו חייבת להיות טרייה בכל פעם שמופיעים כתמים.
    3. הכן פתרון עבודה כחול toluidine על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת מלאי כחול toluidine ל 45 מ"ל של תמיסת NaCl 1%. מערבבים היטב ומוודאים שה-pH הוא כ-2.3.
      הערה: pH גבוה מ-2.5 יגרום להכתמה עם פחות מטכרומזיה. הפוך פתרון זה טרי בכל פעם צביעה מבוצעת.
    4. נטרל פראפינים של 4-5 מיקרומטר חלקים המותקנים על שקופיות בעלות מטען חיובי כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6. יש לשטוף חלקים נטולי פרפין במים זורמים למשך 2 דקות.
    5. מקטעי צביעה בפתרון עבודה כחול טולוידין למשך 2-3 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים למשך 2 דקות.
    6. יש לייבש חלקים על ידי טבילה של פי 10 באתנול 95%. יש לטבול שקופיות באתנול 100% 10x. טובלים שקופיות באתנול טרי 100% 10 פעמים נוספות.
    7. דגרו על שקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 2 דקות. יש לדגור על שקופיות באצווה שנייה של ממס מבוסס די-לימונן למשך 2 דקות.
    8. ההרכבה מכסה באמצעות אמצעי הרכבה מבוסס קסילן בזמן שהמגלשה עדיין רטובה עם ממס מבוסס D-לימונן.
      הערה: אין להשתמש באמצעי הרכבה על בסיס מים.
    9. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield. זהה תאי פיטום על ידי נוכחות של גרגירים סגולים כהים בציטופלסמה שלהם. סוגי תאים אחרים מוכתמים בכחול בהיר.

4. כתמים מיוחדים לאבחון MPNST ושלילת אבחנות חלופיות

  1. המראה ההיסטולוגי של MPNSTs אנושיים משתנה מאוד ומספר סוגי גידולים שונים הם בעלי מראה דומה לזה של MPNSTs28. מכיוון ש- MPNST נגזרים משושלת תאי Schwann, קבע אם הגידול נובע לעצב היקפי או בתוך PN שפיר קיים על ידי בדיקה גסה או בדיקה מיקרוסקופית בהירה של חלקים מוכתמים H&E. למרות MPNST נמצאים לעתים לא בקשר עם עצב היקפי או PN (בדרך כלל בגלל הפרדה בשוגג מן העצב במהלך דיסקציה, הרס של PN קיים מראש באמצעות צמיחת יתר MPNST, או כי הנגע הוא גרורתי), לחפש את הקשר של הגידול עם עצב או PN כמו האבחנה היא פחות סביר אם הגידול אינו קשור לעצב או PN.
  2. הכינו מקטעים של 4-5 מיקרומטר מגושי פרפין המכילים MPNST פוטנציאליים והרכיבו אותם על שקופיות טעונות חיובית כמתואר בשלב 2.2.1. ביטול פירוק מקטעים כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6.
  3. בצע אימונוהיסטוכימיה עם לוח הנוגדנים המצוין בטבלה 2 כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.15.
  4. בדוק את immunostains על ידי מיקרוסקופ brightfield. מכיוון ש-MPNST מדגימים התמיינות שוואנית, חפשו תגובתיות חיסונית אחידה או מטושטשת עבור S100β, nestin ו-Sox10. אם הגידולים אינם חיוביים לשלושת הסמנים הללו, עיין בטבלה 2 כדי לקבוע את האבחנה.
    הערה: MPNST של בני אדם ועכבר יכולים להדגים בידול שונה. לדוגמה, כמה MPNST אנושיים להדגים התמיינות rhabdomyoblastic מוקד (וריאנטים אלה ידועים כגידולי טריטון ממאירים); למרות שגידולים אלה יכתימו את הסמנים השווניים, הם מבטאים גם סמני שרירים כגון דסמין, MyoD1 ומיוגנין. תגובתיות חיסונית לסמנים אחרונים אלה לא צריכה להניא חוקרים מאבחון הגידול כ- MPNST. למרות שמודלים עכבריים מרובים המבטאים באופן מותנה את גן ההיתוך SS18-SSX נקבעו כדי למדל פתוגנזה של סרקומה סינוביאלית29, למיטב ידיעתנו, מודלים של סרקומה סינוביאלית המייצרים באופן ספונטני את תעתיק ההיתוך המקביל אינם ידועים. כתוצאה מכך, איננו מחפשים תעתיקי היתוך SS18-SSX בגידולי GEM ומסתמכים במקום זאת על פרופילים אימונוהיסטוכימיים.

5. דירוג של MPNSTs

  1. קבע אם נמק גידולי, סימן היכר של MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי, קיים. עבור MPNST דרגה IV, חפש היפר-תאיות בולטת, פעילות מיטוטית מהירה (≥4 מיטוזה לכל 10 שדות בהספק גבוה (40x), ואטיפיה ציטולוגית.
    1. אם אין נמק, להעריך את הגידול כדי לקבוע אם hypercellularity, פעילות מיטוטית, ואטיפיה ציטולוגית קיימים. אם כל התכונות הללו קיימות בהיעדר נמק, דרג את הגידול כ- MPNST דרגה III של ארגון הבריאות העולמי.
    2. גידולים בדרגה II של ארגון הבריאות העולמי מאופיינים בתאיות מוגברת, אך במידה פחותה מ- MPNST בדרגה III ו- IV של ארגון הבריאות העולמי. גרעיני תאי הגידול ב- MPNST דרגה II של ארגון הבריאות העולמי מראים גודל מוגבר (יותר מפי 3 מגודל גרעיני תאי הגידול בנוירופיברומות) והיפרכרומזיה. פעילות מיטוטית מוגברת (<4 מיטוזה לכל 10 שדות בהספק גבוה) קשורה, אך אינה דרישה לגידולים בדרגה II של ארגון הבריאות העולמי.
      הערה: מכיוון שגידולים בדרגה גבוהה יותר בדרך כלל מתקדמים מכיתות נמוכות יותר, אזורים בדרגה נמוכה וגבוהה עשויים להיות נוכחים באותו MPNST. בנסיבות אלה, ציון הגידול נקבע על ידי האזור בדרגה הגבוהה ביותר הקיימת.
      הערה: קיימת מחלוקת בין פתולוגים אנושיים האם מערכת הדירוג של ארגון הבריאות העולמי שתוארה לעיל מנבאת את תוצאות המטופלים, וחלק מהפתולוגים הללו מעדיפים במקום זאת פשוט לסווג MPNST כציון נמוך או ציון גבוה. תחת תוכנית זו, MPNST ברמה גבוהה יש אטיפיה ציטולוגית בולטת, פעילות מיטוטית מהירה (>5 מיטוזה לכל 10 שדות כוח גבוה), והיפר-תאיות ניכרת עם או בלי נמק. MPNST בדרגה נמוכה חסר נמק אך מראה פעילות מיטוטית, אטיפיה ציטולוגית ותאיות שהיא ביניים בין MPNST בדרגה גבוהה לבין ניאופלזמה נוירופיברומטית לא טיפוסית עם פוטנציאל ביולוגי לא ידוע (ANNUBP). אנו מעדיפים את המערכת שתוארה לעיל מכיוון שההבחנה בין ANNUBP לבין MPNST ברמה נמוכה יכולה להיות מאתגרת עבור חוקרים שאין להם ניסיון רב עם גופים אלה.

6. הכנת תרביות של מעבר מוקדם P 0-GGFβ3 MPNST תאים

  1. תרבית של תאי גידול P 0-GGFβ3 בתרבית מוקדמת מחתיכת גידול טרייה 2 (שלב 1.5, איור 1A). לשמור על תנאים סטריליים מנקודה זו ואילך.
    1. נתקו את הגידול על ידי חיתוכו לחתיכות קטנות (2-4 מ"מ) וטחינה ב-DMEM10 (התווך החיוני המינימלי של דולבקו) המכיל 10% נסיוב עגל עוברי, 2 μmol/L פורסקולין ו-10 nmol/L neuregulin 1β (NRG1β) בצלחות תרבית רקמה של 100 מ"מ.
    2. אפשר לתאים לצמוח מתוך שברי הרקמה הטחונים ב 37 oC ב 5% CO2 עד לוחות נפגשים. החליפו מדיה כל 3-4 ימים.
    3. לפצל את תרבית התא. הסר את המדיה מצלחת 100 מ"מ ולשטוף תאים עם PBS; יש להסיר ולהשליך רקמות טחונות. הסר PBS והוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לקדם ניתוק תאים, הקש בעדינות על הצלחת ובדוק ניתוק באמצעות מיקרוסקופ אור; יש להרחיב את הדגירה של טריפסין לפי הצורך.
    4. נטרול טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM10. מעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה ולתאי כדוריות ב 500 × גרם למשך 5 דקות. הסר את המדיה והוסף 5 מ"ל של DMEM10 טרי לכדור.
    5. פזרו את מתלה התא לשתיים עד ארבע צלחות 100 מ"מ המכילות DMEM10. אין לפצל את התאים ליותר מחמישה מעברים (שלבים 6.1.3 ו-6.1.4) ולשמור אותם ב-DMEM ללא פורסקולין ו-NRG1β. זכור להקפיא תאים במעבר 2 לשימוש עתידי.

7. אימות זהותם של תאי MPNST במעבר מוקדם על ידי אימונוציטוכימיה

  1. מניחים סטרילי 18 מ"מ #1.5 זכוכית עגולה מכסה בבארות של 6-באר צלחת תרבית רקמות סטרילית.
    1. הכניסו תמיסת פולי-L-ליזין/למינין לבארות בנפח מספיק כדי לכסות את הכיסוי. אטמו את הצלחת בניילון נצמד כדי למזער אידוי. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הכיסויים 3x עם PBS סטרילי.
      הערה: ניסינו להרכיב תאי MPNST במעבר מוקדם על כיסויים לא מצופים ומצאנו שהתאים אינם נצמדים היטב בהיעדר ציפוי פולי-ל-ליזין/למינין.
    2. לוחית 10,000 תאים על הכיסוי על ידי הוספה עדינה של 2 מ"ל של תרחיף התא במצע גדילה לכל באר המכילה את הכיסוי. לדגור על הצלחות למשך הלילה ב 37 ° C עם 5% CO2 באינקובטור תרבית רקמות.
    3. למחרת בבוקר, שטפו את הכיסויים במשך 2X5 דקות עם PBS.
    4. תקן תאים עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 18 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שטפו את הכיסויים 3 x 5 דקות עם PBS. אם תרצה, אטם את הצלחת באמצעות סרט פלסטיק ואחסן אותה ב 4 ° C בשלב זה.
    6. הפוך טרי 50 mM NH4Cl ב PBS. יש להרוות אלדהידים על ידי דגירה על הכיסויים ב-50 mM NH4Cl ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. חדרו את התאים על ידי דגירה של כיסויים ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לכבס את החלקות למשך 3X5 דקות עם PBS.
    8. חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של כיסויים בחיץ חוסם (1x PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר, 0.2% חלב יבש ללא שומן ו-0.3% Triton X-100) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את המאגר החוסם והוסף נוגדנים ראשוניים המזהים את סמני MPNST הנמצאים בגידול האב (בדרך כלל S100β, Nestin ו- Sox10) מדוללים לדילול האופטימלי שנקבע מראש במאגר החוסמים. עוטפים את הצלחת בסרט פלסטיק ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה בתא לח.
    10. יש לשטוף 3 x 5 דקות עם PBS כדי להסיר נוגדן ראשוני לא קשור. מוסיפים נוגדן משני מסומן פלואורסצנטית מדולל בחיץ חוסם ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש להגן מפני אור.
    11. שטפו 3 x 5 דקות עם PBS. יש לדגור על החלקות ב-1-5 מיקרוגרם של צבע Hoechst למשך 10 דקות. להמשיך להגן מפני אור.
    12. יש לכבס את החלקות עם PBS למשך 5 דקות. הרכבה של שקופיות באמצעות 1:1 1x PBS/גליצרול. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. Allograft של תאי גידול במעבר מוקדם כדי להדגים גידוליות

  1. לגדל תאי P 0-GGFβ3 MPNST במעבר מוקדם במפגש DMEM10 עד 80%. יש לשטוף תאים פעם אחת בטמפרטורת החדר בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס. טפל בתאים במשך 30 שניות עד דקה אחת עם תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטית כדי להסיר אותם מהמצע. הוסף 5 מ"ל של DMEM10 לכל 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים.
    הערה: דיסוציאציה תאית עשויה להימשך זמן רב יותר, עד 10-20 דקות. עיין בפרוטוקול היצרן.
    הערה: אין לגדל תאים למפגש מכיוון שהדבר יפחית את יעילות השתל.
    1. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. סובב תאים למטה ב 5 × גרם במשך 5 דקות והשהה אותם מחדש בריכוז של 1-2 × 106 תאים לכל 100 μL של DMEM10. שמור תאים על קרח עד מוכן להזרקה.
    2. מרדימים עכברי NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) בתא האינדוקציה של וופורייזר איזופלורן. מניחים את החיה על בטנה ומעקרים את אתר ההזרקה עם 70% אתנול. יש לאפשר לאתר להתייבש באוויר לפני ההזרקה. לפני ההזרקה, יש לאפשר לתאים להגיע לטמפרטורת החדר.
    3. להזריק 1-2 x 106 תאים תת עורית באגף ימין. הניחו את העכבר לבדו בכלוב ללא מצעים ואפשרו לו להתאושש. ודא כי רק חלק מהכלוב נמצא על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. פעולה זו מספקת אזור שהעכבר יכול לעבור אליו אם הוא מתחמם יתר על המידה.
      הערה: אנו משתילים לפחות שלושה עכברים עם כל תרבית מעבר מוקדם, מכיוון שחלק מהשתלים עשויים שלא לקחת.
    4. לאפשר השתל לגדול במשך 15-60 ימים; להעריך את בריאות בעלי החיים 3 פעמים בשבוע ולתעד ציונים של מצב הגוף, כולל משקל, ושינויים התנהגותיים בכל בדיקה. להפסיק עכברים שהגיעו לגודל השתל המרבי המותר או עכברים מתים באמצעות המתת חסד פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם. גיל שיא במוות בימים. כאשר גידולים הופכים גלויים חיצונית, רשום את ממדי הגידול (אורך, רוחב וגובה).
      הערה: מניסיוננו, תרביות MPNST מוקדמות שונות משתילות ביעילות משתנה ונבדלות בזמן הדרוש לצמיחת השתל. אין לאפשר לבעלי חיים להתקדם מעבר לגודל הגידול המרבי המותר על ידי IACUC ו/או לנקודת הקצה ההומנית.
  2. קצרו את הגידול, תקנו אותו בפרפורמלדהיד 4%, הטמיעו אותו בפרפין ובצעו כתמי H&E כמתואר בסעיפים 2.1-2.2.9 כדי לוודא שהאלוגרפט הוא גידול ולא רקמה תגובתית. במידת הצורך, immunostain השתל עבור הסמנים שהיו נוכחים הגידול ההורה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מדגים דוגמאות של גידולים ברורים לחלוטין המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3. גידולים שניתן לזהות בקלות בעין בלתי עשויים להיראות כגושים המפרידים בין אזורי גוף, כפי שמוצג באיור 2A (חץ). כאשר קובעים אם הניאופלזמה היא פוטנציאל לגידול נדן עצב היקפי, חיוני לקבוע כי הגידול קשור לעצב היקפי. במקרה זה, סריקת MRI (איור 2B) מראה שהגידול קשור לעצב הסיאטי (ראש החץ); קשר זה אושר לאחר המתת העכבר וניתוח הגידול. יש לציין כי גודל גדול אינו מע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות ההיסטולוגיות והביוכימיות המוצגות כאן מספקות מסגרת לאבחון ואפיון מודלים של GEM של פתוגנזה נוירופיברומה ו- MPNST. במהלך השנים, מצאנו מתודולוגיות אלה להיות שימושי למדי להערכת הפתולוגיה של גידולים עצביים היקפיים הנובעים מודלים GEM 21,25,26. עם זאת, בעוד הפרוטוקולים המתוארים כאן שימושיים לקביעת מידת הדיוק של גידולים במודלים של GEM לשחזר את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים, יש כמה מגבלות לאסטרטגיות אלה שיש להעריך. ראשית, עכברי P 0...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS048353 ו- R01 NS109655 ל- S.L.C.; R01 NS109655-03S1 ל- D.P.J.), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804 ל- S.L.C.) ומשרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086 ו- W81XWH-12-1-0164 ל- S.L.C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 מ"מ לוחות תרבית רקמותקורנינג פלקון353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- לוחות בארקורנינג קוסטאר3516
חומצה אצטיתפישר סיינטיפיקA38-212
Alexa Fluor 488 משני (נגד עכברים עיזים)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 משני (נגד עכברים עיזים)InvitrogenA21043 או A11004
Alexa Fluor 568 משני (נגד ארנב עיזים)InvitrogenA11036
אמוניום כלוריד (NH<תת>4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Scientific23225
אלבומיןסרום בקרפישר סיינטיפיקBP1600-100
קלדסמוןABCAM E89, ab32330
CD117סמל תא117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
מגרד תאיםSarstedt83.183
חשפנית תאיםקורנינג25-056-CI
מעגל כיסויפישר סיינטיפיק12-545-100
Citrisolve היברידי (ממס מבוסס d-לימונן)Decon Laboratories5989-27-5
מבקר חומצהפישר סיינטיפיקA104-500
ציטוקרטיןABCAM C-11, ab7753
דסמיןאג'ילנט דקו שיבוט D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
אתנול (200 הוכחה)Decon Laboratories2716
סרום עגל עובריOmega ScientificFB-01
מזלגסיגמא-אולדריץ'F6886
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G6279
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)קורנינג21-022-CV
האריס המטוקסיליןפישרברנד245-677
המציטומטרברייטליין-האוזר סיינטיפיק1490
חומצה הידרוכלוריתפישר ScientificA144-212
מי חמצןפישר סיינטיפיק327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (פרוקסידאז) ערכת פולימר,מעבדות וקטורMP-2400
ערכת פולימר ImmPRESS HRP (פרוקסידאז),מעבדות וקטורMP-7401
חממהתרמו סיינטיפיקHeracell 240i CO2 אינקובטור
איזופלורןפיראמלNDC 66794-017-25
איזופרופנולפישר סיינטיפיקA415
Ki-67איתות תאים 12202
למיניןתרמו פישר 23017015
מדעי חנקן
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
מיקרוטום
נסטיןMillipore אנושי: MAD5236 (10C2), אנושי: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaתוצרתS.L.C. (זמין גם כ-396-HB-050/CF מ-R& D Systems)
נוירופיברומיןסנטה קרוז ביוטכנולוגיה sc-67
הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ עכברימעבדת ג'קסון5557
חלב יבש ללא שומןWalmartמותג
P0-GGFβ 3 עכבריםבבית
שעוות פרפיןLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (מדיום הרכבה קסילן)Fisher ScientificSP15-100
מד pHמטלר טולדדושבע אקסלנס, 8603
פוספט חוצץ מלח (Dulbecco's)קורנינג20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
פולי-L-ליזין הידרוברומידסיגמא-אולדריץ'P5899-5MG
מכונת איזופלורנס ניידתVetEquip מערכות
PVA-DABCO (מדיום הרכבה מימי)Millipore Sigma10981100ML
סיר אורזאשור המילטון
S100BAgilent Dako Z0311  (עכשיו GA504)
SMAVentana מערכות רפואיות שיבוט 1A4
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS640
נתרן ציטראט (דיהידרט)פישר סיינטיפיקBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
היסטולוגיה פלדה
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
TCF4/TCFL2 איתות סלולרי (CH48H11) #2569
קלטת
טולואידין כחולACROS Organics348600050
טריטון X-100פישר סיינטיפיקBP151-500
טריזולאינוויטרוגן15596026
טריפסיןקורנינג25-051-31
עכבר על עכבר נגד ארנב סוסים נוזליערך נהדרהרדמה באינהלציהתבנית רקמות

מקורות

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620(2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834(2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096(2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588(2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

נוירופיברומות פלקסיפורמיותעכברים מהונדסים גנטיתנוירופיברומטוזיס מסוג 1דירוג גידוליםאימונוהיסטוכימיהאנליזה היסטולוגיתסממני תאי שוואןתרביות מעבר מוקדמותאלוגרפטים של גידולים
זיהוי, אבחון ודירוג גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.