זיהוי, אבחון ודירוג גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית

Summary

פיתחנו מתודולוגיה להערכה אם גידולים במערכת העצבים בעכברים מהונדסים גנטית משחזרים במדויק את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים. כאן, אנו מיישמים טכניקות היסטולוגיות אלה, קריטריונים פתולוגיים מוגדרים ומתודולוגיות תרבית על נוירופיברומות וגידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית הנובעים במודל העכבר P 0-GGFβ3.

Abstract

חולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) מפתחים בדרך כלל נוירופיברומות פרספקס (PNs) שלאחר מכן הופכות לגידולי מעטפת עצב היקפיים אגרסיביים ביותר (MPNST). הבנת התהליך שבו נוירופתיה היקפית הופכת ל-MPNST תתאפשר הודות לזמינותם של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) המשחזרים במדויק את התקדמות PN-MPNST שנצפתה בבני אדם עם NF1. למרבה הצער, דגמי GEM עם אבלציה Nf1 אינם משחזרים תהליך זה במלואו. זה הוביל אותנו לפתח עכברי P 0-GGFβ3, מודל GEM שבו ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann neuregulin-1 (NRG1) בתאי Schwann גורם להתפתחות של PNs המתקדמים להיות MPNST בתדירות גבוהה. עם זאת, כדי לקבוע אם גידולים והתקדמות ניאופלסטית בעכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את התהליכים שנצפו בחולי NF1, היינו צריכים להוכיח תחילה שהפתולוגיה של גידולי מעטפת העצבים ההיקפיים P_0-GGFβ3 משחזרת את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים.

כאן, אנו מתארים את המתודולוגיות המיוחדות המשמשות לאבחון מדויק ולציון גידולים במערכת העצבים ההיקפית במודלים של GEM, באמצעות P 0-GGFβ3 ו- P_0-GGFβ3; Trp53^+/- עכברים כדוגמה. אנו מתארים את השיטות ההיסטולוגיות, האימונוהיסטוכימיות וההיסטוכימיות המשמשות לאבחון PNs ו- MPNSTs, כיצד להבחין בין גידולים אלה לבין סוגי גידולים אחרים המחקים את הפתולוגיה שלהם, וכיצד לדרג גידולים אלה. אנו דנים בהקמת תרביות מעבר מוקדמות מ- GEM MPNSTs, כיצד לאפיין תרבויות אלה באמצעות אימונוציטוכימיה, וכיצד לאמת את הגידול שלהן על ידי הקמת allografts. באופן קולקטיבי, טכניקות אלה מאפיינות את הפתולוגיה של PNs ו- MPNST המתעוררים במודלים של GEM ומשווים באופן ביקורתי את הפתולוגיה של גידולים מורינים אלה לעמיתיהם האנושיים.

Introduction

במהלך שלושת העשורים האחרונים, מעבדות רבות ניסו ליצור מודלים עכבריים של סרטן אנושי על ידי החדרת מוטציות הקשורות לסרטן אנושי לתוך הגנום של העכבר או על ידי ביטוי יתר של תוצר גנטי המתבטא יתר על המידה בסרטן אנושי. המודלים המתקבלים של עכבר מהונדס גנטית (GEM) יכולים לשמש למגוון מטרות, כגון קביעה כי השינוי הגנומי החדש שהוכנס יוזם גידול, זיהוי שינויים גנטיים או אפיגנטיים אחרים המתרחשים לאחר מכן התורמים להתקדמות הגידול, והגדרת מסלולי האיתות העיקריים המניעים את התחלת הגידול והתקדמותו. שלא כמו מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט, המסתמכים על שימוש בעכברים מדוכאי חיסון, למודלים של סרטן GEM יש מערכת חיסונית מתפקדת במלואה ולכן מודל מדויק יותר של תגובות לחומרים טיפוליים מועמדים. עם זאת, בעת שימוש במודלים של סרטן GEM למטרות כגון אלה, חיוני שהחוקרים יאשרו כי תצפיות שנעשו עם גידולי GEM רלוונטיים לעמיתיהם האנושיים. אימות זה צריך לכלול הערכה יסודית של הפתולוגיה של גידולי GEM וקביעה האם התכונות הפתולוגיות של גידולי GEM משחזרות את הפתולוגיה של סוג הגידול האנושי המתאים.

תסמונת רגישות הגידול נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1) היא המחלה הגנטית הנפוצה ביותר המשפיעה על מערכת העצבים האנושית, המתרחשת בערך 1 מכל 3,000-3,500 לידות חי ^1,2,3. אנשים הסובלים מ- NF1 מפתחים גידולים שפירים מרובים במעטפת העצבים ההיקפית הידועים בשם נוירופיברומות בעורם (נוירופיברומות עוריות) ובעצבים גדולים ובמקלעי עצבים (נוירופיברומות פרקסיפורם). בעוד שגם נוירופיברומות עוריות וגם פרסיפורמות מחמירות את איכות החיים של המטופל על ידי ייצור ליקוי פיזי, התנהגותי ו / או חברתי, נוירופיברומות פרספקס (PNs) מסוכנות במיוחד ^4,5. הסיבה לכך היא כי PNs לעתים קרובות להפוך גידולים ממאירים מעטפת עצב היקפי (MPNST), שהם neoplasms תאי ציר אגרסיבי עם שיעור הישרדות נמוך במיוחד ^1,2. במידה רבה, שיעור הישרדות נמוך זה נובע מכך שמשטרי הרדיו והכימותרפיה המשמשים כיום לטיפול ב- MPNST אינם יעילים. עם זאת, פיתוח טיפולים חדשים ויעילים יותר היה מאתגר. הסיבה לכך היא, למרות כמה נפוץ MPNST להתרחש בחולים NF1, הם עדיין neoplasms נדיר. כתוצאה מכך, קשה מאוד להשיג מספר גדול של גידולים אנושיים למחקר; זה גם מאתגר לגייס מספיק חולים עם MPNST לניסויים קליניים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרו מספר מודלים של GEM במטרה להשיג תובנות נוספות לגבי החריגות המניעות פתוגנזה נוירופיברומה והתקדמות PN-MPNST ולהקל על ניסויים פרה-קליניים עם סוכנים טיפוליים מועמדים.

לחולי NF1 יש מוטציות לא פעילות בעותק אחד של הגן NF1. נוירופיברומה פתוגנזה מופעלת כאשר מוטציה משביתה בגן NF1 הפונקציונלי הנותר מתרחשת בתא בשושלת תאי Schwann. עם זאת, באופן מפתיע, כאשר עכברים נוצרו עם מוטציות Nf1 שהשביתו את קו הנבט, הם לא פיתחו נוירופיברומות ^6,7. ההדגמה העוקבת כי עכברים עם תאי Schwann Nf1-null ו- Nf1 haploinsufficiency בכל סוגי התאים האחרים (Krox20-Cre;Nf1^flox/- עכברים) פיתחו נוירופיברומות פרספקס הציעו כי מינון מופחת של גן Nf1 בסוגי תאים נוספים נדרש עבור נוירופיברומה^{פתוגנזה 8}. גם אז, נוירופיברומות פרספקס ב Krox20-Cre; עכברי Nf1^flox/- לא התקדמו והפכו ל-MPNST ולכן חיקו רק חלקית את הביולוגיה של עמיתיהם האנושיים. פתוגנזה של MPNST אכן התרחשה כאשר מוטציות Nf1 היו שותפות עם מוטציות בגנים מדכאי גידול נוספים כגון Trp53⁹ או Cdkn2a¹⁰, אך MPNST במודלים אלה של GEM התפתחו דה נובו או מניאופלזמות נוירופיברומטיות לא טיפוסיות בעלות פוטנציאל ביולוגי לא בטוח (ANNUBPs)^11,12, ולא מנוירופיברומות שפירות שפירות קיימות (ראו^13,14 לסקירות מצוינות של מודלים אלה, כמו גם מודלים אחרים המציגים מוטציות נוספות הקשורות לאובדן תפקוד הקשור ל- MPNST בגנים כגון Suz12 ו- Pten¹⁵).

מודלים אלה של עכברים היו יקרי ערך לביסוס התפקיד שגנים כגון NF1, TP53 ו- CDKN2A ממלאים בפתוגנזה של גידולים במערכת העצבים ההיקפית הקשורים ל- NF1 ובניסויים פרה-קליניים הבוחנים סוכנים טיפוליים מועמדים. עם זאת, עדיין יש לנו הבנה חלקית של התהליך שבו נוירופיברומות פרספקס מתקדמות להיות גידולים נוירופיברומטיים לא טיפוסיים של פוטנציאל ביולוגי לא בטוח (ANNUBPs¹⁶) ולאחר מכן MPNSTs. לאחרונה חלה התקדמות מסוימת בהבנת תהליך זה עם הדיווח האחרון כי עכברים עם מחיקות ב-Nf1 וב-Arf מפתחים ANNUBPs שמתקדמים והופכים ל-MPNSTs¹¹. עם זאת, מודלים עכבריים מבוססי מוטציה Nf1 המשחזרים באופן מלא את תהליך התקדמות הפרספקס נוירופיברומה-MPNST שנראה בבני אדם עדיין אינם קיימים. בנוסף, לא ברור אם ישנם מספר מסלולים נפרדים המובילים לפיתוח MPNST. בהתחשב בכך, ייתכן כי GEMs שתוארו לעיל רק מודל של תת-קבוצה של מספר מסלולים שונים המובילים להתקדמות נוירופיברומה-MPNST ופתוגנזה MPNST. נקודה זו מודגשת על ידי העובדה כי MPNSTs להתרחש גם באופן ספורדי וכי כמה MPNST ספורדיים כנראה אין מוטציות NF1 ^17,18.

למרות שנקודה אחרונה זו אותגרה על ידי ההצעה האחרונה של Magollon-Lorenz et al. כי לפחות כמה MPNST ספורדיים חסרי מוטציות NF1 הם מלנומה או סוג אחר של סרקומה¹⁹, לאחרונה דיווחנו MPNST ספורדי וקו תאים נגזר מגידול זה (2XSB תאים) שהיה NF1 פראי סוג²⁰. במהלך אפיון גידול האב וקו תאי 2XSB, שללנו באופן שיטתי אפשרויות אבחון חלופיות, כולל מלנומה וסוגי סרקומה רבים אחרים הנשקלים באופן שגרתי באבחנה המבדלת של גידול נדן עצב היקפי ממאיר ספורדי²⁰. בנוסף, נציין כי Magollon-Lorenz et al. הכירו בכך שלא ניתן להכליל את ממצאיהם בשלושת קווי תאי MPNST הספורדיים שהם חקרו כדי להצביע על כך שכל הגידולים שזוהו כ- MPNST ספורדיים אינם MPNST.

כדי לבנות מודל GEM שבו נוירופיברומה ופתוגנזה MPNST לא היו תלויות בהכרח במוטציות ספציפיות של גנים מדכאי גידולים, יצרנו עכברים טרנסגניים שבהם ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann החזק neuregulin-1 (NRG1) הונע על ידי מקדם חלבון המיאלין הספציפי לתאי Schwann (P₀) (עכברי P 0-GGFβ3)²¹. הראינו בעבר כי נוירופיברומות, MPNST וקווי תאים MPNST אנושיים מבטאים מספר איזופורמים של NRG1 יחד עם קולטן erbB טירוזין קינאזות (erbB2, erbB3 ו-erbB4) המתווכים איתות NRG1 וכי קולטני erbB אלה מופעלים באופן קונסטיטוטיבי²². הראינו גם שמעכבים פרמקולוגיים של קינאזות erbB מעכבים בעוצמה התפשטות MPNST²², הישרדות²³ והגירה²⁴. בהתאם לתצפיות שלנו בבני אדם, עכברי P 0-GGFβ3 מפתחים נוירופיברומות פרספקס²⁵ שמתקדמות והופכות ל-MPNST בתדירות גבוהה^21,25. הראינו כי P 0-GGFβ3 MPNSTs, כמו עמיתיהם האנושיים, מפתחים בדרך כלל מוטציות של Trp53 ו- Cdkn2a, כמו גם הפרעות גנומיות רבות אחרות שעשויות לתרום לגידולים²⁵. ל-MPNST המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3 אין מוטציות Nf1 משביתות. עם זאת, באמצעות השלמה גנטית, הראינו כי NRG1 מקדם גידולים בעכברי P 0-GGFβ3 בעיקר באמצעות אותם מפלים איתות המשתנים על ידי אובדן Nf1 ²⁶; מסקנה זו מבוססת על קביעתנו כי החלפת ביטוי יתר של NRG1 בהפסד Nf1 בנוכחות Trp53 haploinsufficiency (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- עכברים) מייצר בעלי חיים שבהם MPNST מפתחים דה נובו, כפי שניתן לראות ב- cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- עכברים²⁷.

כדי להשיג מידע זה ומידע אחר המוכיח כי עכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את תהליכי הפתוגנזה של נוירופיברומה והתקדמות נוירופיברומה-MPNST שנצפו בבני אדם עם NF1, פיתחנו מתודולוגיות מיוחדות לעיבוד רקמות מבעלי חיים אלה, אבחון מדויק של הגידולים שלהם, דירוג MPNST המתעוררים בעכברים אלה, ביסוס ואפיון מעבר מוקדם P_0-GGFβ3 ו- P_0-GGFβ3; Trp53^+/- תרביות MPNST והשוואה ביקורתית של הפתולוגיה של P 0-GGFβ3 PNs ו- MPNST ו- P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNSTs לזה של עמיתיהם האנושיים. רבות מהמתודולוגיות הללו ניתנות להכללה למודלים אחרים של GEM של ניאופלזיה של מערכת העצבים. בנוסף, כמה ממתודולוגיות אלה ישימות באופן רחב יותר למודלים של GEM שבהם גידולים מתעוררים באתרי איברים אחרים. כתוצאה מכך, כאן אנו מציגים תיאור מפורט של מתודולוגיות אלה.

Protocol

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובוצעו על ידי אנשי צוות מאומנים כראוי בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים של MUSC.

1. קביעת חדירת הגידול והישרדותו בעכברי P 0-GGFβ3 וזיהוי גידולים בבעלי חיים אלה לצורך אפיון נוסף

1. ליצור את הקבוצה של עכברים כי יוערכו עבור tumorigenesis. מספר העכברים הנדרש תלוי בחדירה של פנוטיפ הגידול. כדי לפצות על הפסדים כאלה, התחל עם קבוצה כי הוא 10-15% גבוה יותר מאשר המספר הסופי הרצוי של בעלי חיים.
   הערה: קבענו אמפירית חדירת גידול בעכברי P 0-GGFβ3 בקבוצה ראשונית של 50 עכברים (שישה מהם אבדו מסיבות שאינן קשורות לנאופלזיה (למשל, לחימה)⁾²⁵.
2. להעריך את בריאותם של בעלי חיים שלוש פעמים בשבוע ולתעד ציוני מצב גוף, כולל משקל, ושינויים התנהגותיים בכל בדיקה. להפסיק עכברים נושאי גידול או עכברים מתים (ראה הערה להלן) באמצעות המתת חסד פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם. גיל שיא במוות בימים. אם הגידולים נראים כלפי חוץ, רשמו את ממדי הגידול (אורך, רוחב וגובה).
   הערה: חיוני שבעלי חיים לא יורשו להתקדם מעבר לגודל הגידול המרבי המותר ו/או לנקודת הקצה ההומנית שאושרו על ידי IACUC.
3. באמצעות גיל המוות, קבע עקומת הישרדות קפלן-מאייר כדי לקבוע את הגיל הממוצע במוות ואת טווח ההישרדות.
   הערה: P 0-GGFβ3 עכברים היו בגיל ממוצע למוות של 261.5 ימים, עם טווח של 74-533 ימים; ל-91% מהקבוצה שלנו היו נוירופיברומות מרובות ול-71% היו MPNST²¹.
4. לקבוע אם גידולים גלויים באופן גס קיימים, ואם הם, לנתח אותם בתנאים סטריליים כדי לקבוע אם הגידול קשור לעצב היקפי ולאחר מכן הבלו את הגידול. ב-P 0-GGFβ3 וב-P_0-GGFβ3; Trp53^+/- עכברים, גידולים היקפיים במעטפת העצבים נמצאים לרוב בעצבים הטריגמינליים והסכיאטיים. גם אם גידולים גלויים לעין אינם נראים בקשר עם עצבים אלה, לתקן ולהטמיע עצבים אלה כמתואר להלן, כך שניתן יהיה לבדוק את נוכחותם של מיקרו-גידולים. מיקרו-גידולים מתרחשים בדרך כלל בתוך הגרעינים הקשורים לעצבים אלה.
5. חתכו גידולים גלויים באופן גס לשלוש חתיכות (איור 1A). השתמש בסעיף 1 להיסטולוגיה (קטעי פרפין, אימונוהיסטוכימיה והיסטוכימיה). השתמש בסעיף 2 כדי לבסס תרבויות מעבר מוקדם. הקפאת הצמדה לחתיכה 3 (באמצעות חנקן נוזלי) לניסויים עתידיים אפשריים (למשל, אימונובלוטים, RNA ובידוד DNA).
6. תקן חלק 1 ב 4% paraformaldehyde במי מלח חוצצים פוספט (PBS) לילה ב 4 ^oC. לתקן את שאר הגוף של החיה על ידי טבילה 4% paraformaldehyde לילה ב 4 ° C.

2. שיבוץ פרפין של גידולים גלויים לעין והכנת חלקים המוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין להערכה אבחנתית ראשונית

1. שיבוץ פרפין של גידולים גלויים בצורה גסה
   1. לאחר קיבוע חתיכת גידול 1 לילה ב 4% paraformaldehyde, לשטוף את הרקמה על ידי הצבתו בנפח של PBS כי הוא לפחות פי 10 יותר מאשר נפח הרקמה במשך 15 דקות; יש להשתמש באותו נפח עבור כל השטיפות הבאות. יש לחזור על שתי שטיפות PBS נוספות בנות 15 דקות, תוך שימוש בנפח חדש של PBS עבור כל שטיפה.
   2. העברת חתיכת הגידול 1 עד 70% אתנול. להחזיק את הרקמה 70% אתנול במשך 24 שעות ב 4 ° C. אם תרצה, לאחסן את הרקמה לטווח ארוך בתנאים אלה.
      הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.7 ניתנים לטובת חוקרים שאין להם גישה למכונה מסחרית לעיבוד רקמות. אם לחוקר יש גישה למעבד רקמות, הרקמה תעובד באמצעות אתנולים וקסילנים מדורגים בהתאם לפרוטוקול המכשיר המתוכנת.
   3. מעבירים חתיכת גידול 1 עד 80% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הדגירה במשך 30 דקות נוספות בנפח טרי של 80% אתנול.
   4. העברת חתיכת הגידול 1 עד 95% אתנול במשך 75 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על הדגירה פעמיים נוספות, בכל פעם למשך 75 דקות נוספות בנפח טרי של 95% אתנול.
   5. מעבירים את חתיכת הגידול 1 עד 100% אתנול ודגרים במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הדגירה של 60 דקות פעמיים נוספות, בכל פעם באמצעות נפח טרי של 100% אתנול.
   6. מעבירים את פיסת הגידול 1 לממס על בסיס די-לימונן ודגרים במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את חתיכת הגידול 1 לנפח טרי של הממס על בסיס די-לימונן ודגרים למשך 30-60 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
   7. מעבירים את פיסת הגידול 1 לממס מבוסס פרפין 1:1/d-לימונן למשך שעה אחת ב-60 ^מעלותצלזיוס. יש להשליך את הממס על בסיס פרפין 1:1 ולהעביר את פיסת הגידול 1 ל-60 ^oC פרפין ולדגור במשך 20 דקות ב-60 ^oC. לחזור על הדגירה בנפח טרי של 60 ^oC פרפין פעם נוספת למשך 20 דקות. לדגור על חתיכת גידול 1 בפרפין לילה ב 60 ^oC.
   8. יוצקים שכבת בסיס של פרפין לתוך תבנית היסטולוגיה פלדה ולתת לו להתמצק. מעבירים את חתיכת הגידול 1 אל פני השטח של פרפין הבסיס ומיד לאחר המיקום, מכסים את הרקמה בפרפין 60 ^oC ומניחים את קלטת הרקמה על גבי ובקשר עם הפרפין המותך. מעבירים את התבנית לצד הקר של תחנת ההטבעה ונותנים לה להתמצק למשך 10-15 דקות.
   9. מוציאים את גוש הפרפין עם קלטת הרקמה המצורפת מהתבנית. השתמש בקסטת הרקמה המצורפת כדי להדק את הבלוק לתוך המיקרוטום במהלך החיתוך.
      הערה: כעת ניתן לאחסן את בלוק הפרפין ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
2. הכן hematoxylin וחלקים מוכתמים eosin של גידולים גלויים ברוטו.
   1. חתכו 4-5 מיקרומטר מקטעים של רקמת הגידול באמצעות מיקרוטום והרכיבו אותם על שקופיות זכוכית טעונות חיובית.
   2. כדי לבצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), יש לבצע דה-פרפין של חלקי הרקמה על ידי דגירה של השקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לחזור על הדגירה בנפח חדש של ממס על בסיס די-לימונן למשך 10 דקות.
   3. מעבירים את המגלשות ל-100% אתנול ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את המגלשות לנפח חדש של 100% אתנול ודגרים עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מעבירים את המגלשות לאתנול 95% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את המגלשות לנפח חדש של 95% אתנול ודגרים עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. מעבירים את המגלשות לאתנול 70% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מעבירים לאתנול 50% ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. מעבירים את המגלשות למים מזוקקים ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. הכתימו את המגלשות על ידי טבילתן בהמטוקסילין למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 1-2 דקות. להבדיל על ידי טבילת שקופיות 2-5x ב 0.5% חומצה הידרוכלורית ב 70% אתנול. יש לשטוף באמבט מי ברז זורמים למשך 1-2 דקות. מניחים את המגלשות באתנול 95% עם 0.5% חומצה אצטית למשך 10 שניות.
   8. צבעו את המגלשות עם eosin-Y למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העבירו את המגלשות לאתנול 100% למשך 5 דקות. נקו את הדגימות בממס על בסיס די-לימונן למשך 5 דקות.
   9. ההרכבה מכסה את החלקות באמצעות אמצעי הרכבה מבוסס קסילן בזמן שהמגלשה עדיין רטובה עם ממס מבוסס D-לימונן. הניחו למדיום ההרכבה להתייצב למשך הלילה.
      הערה: אין להשתמש באמצעי הרכבה על בסיס מים.
3. הכינו רקמות ללא גידולים גלויים לעין כדי לזהות נוירופיברומות פרספקס ומיקרו-MPNSTs. הטמיעו את הרקמות בפרפין, הכינו חלקים היסטולוגיים והכתימו חלקים אלה בהמטוקסילין ובאאוסין.
   1. הסירו את האיברים הפנימיים והטמיעו חלקים מייצגים של כל איבר בפרפין כדי להכין חלקים מוכתמים ב-H&E שייבדקו לעדות מיקרוסקופית לגידולים (איור 1B). הסירו את הראש, הגפיים הקדמיות, הגפיים האחוריות והזנב (איור 1C). כדי לבחון את חוט השדרה ושורשי העצבים באתרם כדי לאתר עדויות לגידולים בשורש העצב, יש לסלק את עמוד השדרה ואת הצלעות הקשורות אליו ואת הרקמה הרכה על ידי טבילה ב- 0.3 M EDTA / 4% paraformaldehye (pH 8.0) למשך 48-72 שעות ב- 4 ^oC; לאחר מכן, שטפו את הדגימות עם 1x PBS. בסוף ההסתיידות, ודא כי decalcification הושלם על ידי ניסיון לנקב את עמוד השדרה עם מחט. הסתיידות מוצלחת אם המחט חודרת בקלות לעצם מבלי להתכווץ.
   2. חתכו את עמוד השדרה המסויד ואת המבנים הקשורים אליו לגושים שיתאימו לקלטת רקמות. יש לייבש באמצעות אתנולים מדורגים ולאחר מכן באמצעות ממס מבוסס d-לימונן, כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.7. הטמיעו בפרפין והכינו מקטעים של 4-5 מיקרומטר כמתואר בשלבים 2.1.7-2.2.1. לבצע כתמי H&E כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.9; הניחו למדיום ההרכבה להתייצב למשך הלילה.

3. לזהות נוירופיברומות פרספקס פוטנציאליות ולבצע כתמים מיוחדים כדי לאשר אבחנות

הערה: אנו ממליצים בחום לכלול פתולוג אנושי או וטרינרי מנוסה בהערכת H&E וכתמים מיוחדים של חתכי גידול GEM.

1. בחן את השקופיות המוכתמות ב- H&E שהוכנו כמתואר לעיל באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לזהות גידולים פוטנציאליים במעטפת העצבים ההיקפית. מכיוון שנוירופיברומות ו- MPNST מתעוררים בתוך עצבים היקפיים, חשוב לקבוע אם גידולים מיקרוסקופיים קשורים לעצב היקפי. זהה בלוקים עם גידולים פוטנציאליים במעטפת העצבים ההיקפית, כך שניתן יהיה לבצע אימונוכתמים וכתמים מיוחדים אחרים כדי לאשר או להפריך אבחונים.
2. הבחין בין PNs פוטנציאליים לבין MPNST / גידולים אחרים ברמה גבוהה בהתבסס על תכונות היסטולוגיות שנצפו במהלך בדיקת שדה בהיר של חלקים מוכתמים H&E. נוירונים היקפיים אנושיים הם גידולים היפר-תאיים קלים המורכבים בעיקר מתאים עם גרעינים מוארכים, לעתים קרובות גליים. באזורים רבים, התאים ארוזים באופן רופף וניתן להפריד אותם על ידי חומר חוץ-תאי מיקסואיד; PNs בעכברי P 0-GGFβ3 הם בעלי מראה דומה. מיטוזים בדרך כלל אינם נוכחים; אם כן, והגידול הוא היפר-תאי בינוני עד גבוה, הגידול הוא MPNST או סוג אחר של ניאופלזמה ברמה גבוהה (ראה להלן).
3. PNs מורכבים מתערובת של תאי Schwann ניאופלסטיים וסוגי תאים אחרים שאינם ניאופלסטיים כגון תאי פיטום. כדי לאשר את זהותה של נוירופתיה היקפית, בצע אימונוכתמים עבור סמני תאי Schwann S100β ו-Sox10 וסמן תא הפיטום CD117 (c-Kit) על מקטעים מבלוקים המכילים PNs פוטנציאליים שזוהו בבדיקת H&E (ראה סעיף 3.4 לאפשרויות צביעה חלופיות של סמן תאי פיטום). בצע Ki67 immunostains כדי לאשר שיעורי התפשטות נמוכים.
   הערה: טבלה 1 מפרטת את סמני האנטיגן המשמשים לזיהוי שגרתי של נוירופיברומות פרספקס GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), לאבחון MPNSTs, ולהערכה מלאה של סוגי תאים אחרים הקיימים בנוירופיברומות; אנו מכתימים אנטיגנים אחרונים אלה רק כאשר אנו מתארים לראשונה מודל GEM חדש. עיין בגליון הנתונים של יצרן הנוגדנים לקבלת התנאים המומלצים. שים לב אם עלון יצרן הנוגדנים ממליץ על שליפת אנטיגן; לא כל האנטיגנים דורשים שליפה כדי להיות ניתנים לזיהוי.
   1. הכינו 4-5 מקטעים מיקרומטר מגושי הפרפין שנבחרו והרכיבו אותם על שקופיות טעונות חיובית. ביטול פירוק מקטעים כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6.
   2. יש לשטוף חלקים עם PBS אחד במשך 3-5 דקות.
   3. אם יצרן הנוגדנים ממליץ על שליפת אנטיגן, הכינו מאגר ציטראט. ערבבו 9 מ"ל של תמיסת חומצת לימון (10.5 גרם חומצת לימון ב-500 מ"ל מים מזוקקים) ו-41 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט (14.7 גרם נתרן ציטראט ב-500 מ"ל מים מזוקקים).
   4. בצעו שליפת אנטיגן על ידי הנחת שקופיות במאגר ציטראט למשך 20 דקות בסיר לבישול אורז מחומם.
   5. העבר מחליק לתוך 3% מי חמצן / 1x PBS במשך 10 דקות כדי למנוע פעילות peroxidase ברקמה.
      הערה: הפוך תמיסה זו לרעננה בכל פעם ואל תשתמש בתמיסת המלאי של מי חמצן אם היא ישנה יותר מ 3-4 חודשים.
   6. יש לשטוף את המקטעים ב-PBS אחד.
   7. חסום מקטעים באמצעות מאגר חסימה (2% BSA, 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS) למשך שעה אחת. שטפו שקופיות לזמן קצר ב-1x PBS.
   8. הוסף נוגדן ראשוני לחלקי רקמות. הכינו נוגדנים ראשוניים במאגר חוסם מדולל. לדגור על שקופיות במשך 2 שעות ב 37 ^oC או לילה ב 4 ^oC.
   9. שטפו שקופיות ב-1x PBS למשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3x.
   10. לדגור על רקמה עם נוגדן משני biotinylated במשך 1-2 שעות.
   11. הכן תמיסת דיאמינובנזידין (DAB) המבוססת על פרוטוקול היצרן וטבול שקופיות בתמיסה למשך 2-10 דקות. שטפו מגלשות במים במשך 5 דקות.
   12. יש לנטרל כתמים על ידי טבילתם בהמטוקסילין למשך 10-15 דקות. יש לחשוף למים זורמים עד שהם צלולים. יש לטבול במהירות מגלשות באלכוהול ולשטוף את המגלשות במים.
   13. יש לייבש שקופיות באתנולים מדורגים על ידי טבילה מהירה של שקופיות, פי 4-5 לכל תמיסה, ב-70% אתנול, 95% אתנול ולאחר מכן 100% אתנול. דגרו על שקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 2 דקות. יש לדגור על שקופיות באצווה שנייה של ממס מבוסס די-לימונן למשך 2 דקות.
   14. הרכבה של שקופיות עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן.
   15. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield.
   16. עבור immunofluorescence, להשמיט שלבים 3.3.10-3.3.15. במקום זאת, דגרו על רקמה עם נוגדן משני ספציפי למין המדולל בחיץ חוסם למשך 1-2 שעות.
   17. שטפו שקופיות ב-PBS אחד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3 פעמים.
   18. הרכבה של שקופיות באמצעות PBS/גליצרול אחד.
   19. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. שיטה חלופית להכתמת תאי פיטום: צביעה כחולה טולוידין
   1. הכן תמיסת מלאי כחול toluidine על ידי המסת 1 גרם של toluidine כחול O ב 100 מ"ל של 70% אתנול.
   2. הכינו תמיסת נתרן כלורי 1% (NaCl) על ידי המסת 0.5 גרם NaCl ב-50 מ"ל מים מזוקקים. מערבבים עד להתמוססות. כוונן את רמת החומציות לכ-2.0-2.5 באמצעות HCl.
      הערה: תמיסת NaCl זו חייבת להיות טרייה בכל פעם שמופיעים כתמים.
   3. הכן פתרון עבודה כחול toluidine על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת מלאי כחול toluidine ל 45 מ"ל של תמיסת NaCl 1%. מערבבים היטב ומוודאים שה-pH הוא כ-2.3.
      הערה: pH גבוה מ-2.5 יגרום להכתמה עם פחות מטכרומזיה. הפוך פתרון זה טרי בכל פעם צביעה מבוצעת.
   4. נטרל פראפינים של 4-5 מיקרומטר חלקים המותקנים על שקופיות בעלות מטען חיובי כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6. יש לשטוף חלקים נטולי פרפין במים זורמים למשך 2 דקות.
   5. מקטעי צביעה בפתרון עבודה כחול טולוידין למשך 2-3 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים למשך 2 דקות.
   6. יש לייבש חלקים על ידי טבילה של פי 10 באתנול 95%. יש לטבול שקופיות באתנול 100% 10x. טובלים שקופיות באתנול טרי 100% 10 פעמים נוספות.
   7. דגרו על שקופיות בממס על בסיס די-לימונן למשך 2 דקות. יש לדגור על שקופיות באצווה שנייה של ממס מבוסס די-לימונן למשך 2 דקות.
   8. ההרכבה מכסה באמצעות אמצעי הרכבה מבוסס קסילן בזמן שהמגלשה עדיין רטובה עם ממס מבוסס D-לימונן.
      הערה: אין להשתמש באמצעי הרכבה על בסיס מים.
   9. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield. זהה תאי פיטום על ידי נוכחות של גרגירים סגולים כהים בציטופלסמה שלהם. סוגי תאים אחרים מוכתמים בכחול בהיר.

4. כתמים מיוחדים לאבחון MPNST ושלילת אבחנות חלופיות

1. המראה ההיסטולוגי של MPNSTs אנושיים משתנה מאוד ומספר סוגי גידולים שונים הם בעלי מראה דומה לזה של MPNSTs²⁸. מכיוון ש- MPNST נגזרים משושלת תאי Schwann, קבע אם הגידול נובע לעצב היקפי או בתוך PN שפיר קיים על ידי בדיקה גסה או בדיקה מיקרוסקופית בהירה של חלקים מוכתמים H&E. למרות MPNST נמצאים לעתים לא בקשר עם עצב היקפי או PN (בדרך כלל בגלל הפרדה בשוגג מן העצב במהלך דיסקציה, הרס של PN קיים מראש באמצעות צמיחת יתר MPNST, או כי הנגע הוא גרורתי), לחפש את הקשר של הגידול עם עצב או PN כמו האבחנה היא פחות סביר אם הגידול אינו קשור לעצב או PN.
2. הכינו מקטעים של 4-5 מיקרומטר מגושי פרפין המכילים MPNST פוטנציאליים והרכיבו אותם על שקופיות טעונות חיובית כמתואר בשלב 2.2.1. ביטול פירוק מקטעים כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.6.
3. בצע אימונוהיסטוכימיה עם לוח הנוגדנים המצוין בטבלה 2 כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.15.
4. בדוק את immunostains על ידי מיקרוסקופ brightfield. מכיוון ש-MPNST מדגימים התמיינות שוואנית, חפשו תגובתיות חיסונית אחידה או מטושטשת עבור S100β, nestin ו-Sox10. אם הגידולים אינם חיוביים לשלושת הסמנים הללו, עיין בטבלה 2 כדי לקבוע את האבחנה.
   הערה: MPNST של בני אדם ועכבר יכולים להדגים בידול שונה. לדוגמה, כמה MPNST אנושיים להדגים התמיינות rhabdomyoblastic מוקד (וריאנטים אלה ידועים כגידולי טריטון ממאירים); למרות שגידולים אלה יכתימו את הסמנים השווניים, הם מבטאים גם סמני שרירים כגון דסמין, MyoD1 ומיוגנין. תגובתיות חיסונית לסמנים אחרונים אלה לא צריכה להניא חוקרים מאבחון הגידול כ- MPNST. למרות שמודלים עכבריים מרובים המבטאים באופן מותנה את גן ההיתוך SS18-SSX נקבעו כדי למדל פתוגנזה של סרקומה סינוביאלית²⁹, למיטב ידיעתנו, מודלים של סרקומה סינוביאלית המייצרים באופן ספונטני את תעתיק ההיתוך המקביל אינם ידועים. כתוצאה מכך, איננו מחפשים תעתיקי היתוך SS18-SSX בגידולי GEM ומסתמכים במקום זאת על פרופילים אימונוהיסטוכימיים.

5. דירוג של MPNSTs

1. קבע אם נמק גידולי, סימן היכר של MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי, קיים. עבור MPNST דרגה IV, חפש היפר-תאיות בולטת, פעילות מיטוטית מהירה (≥4 מיטוזה לכל 10 שדות בהספק גבוה (40x), ואטיפיה ציטולוגית.
   1. אם אין נמק, להעריך את הגידול כדי לקבוע אם hypercellularity, פעילות מיטוטית, ואטיפיה ציטולוגית קיימים. אם כל התכונות הללו קיימות בהיעדר נמק, דרג את הגידול כ- MPNST דרגה III של ארגון הבריאות העולמי.
   2. גידולים בדרגה II של ארגון הבריאות העולמי מאופיינים בתאיות מוגברת, אך במידה פחותה מ- MPNST בדרגה III ו- IV של ארגון הבריאות העולמי. גרעיני תאי הגידול ב- MPNST דרגה II של ארגון הבריאות העולמי מראים גודל מוגבר (יותר מפי 3 מגודל גרעיני תאי הגידול בנוירופיברומות) והיפרכרומזיה. פעילות מיטוטית מוגברת (<4 מיטוזה לכל 10 שדות בהספק גבוה) קשורה, אך אינה דרישה לגידולים בדרגה II של ארגון הבריאות העולמי.
      הערה: מכיוון שגידולים בדרגה גבוהה יותר בדרך כלל מתקדמים מכיתות נמוכות יותר, אזורים בדרגה נמוכה וגבוהה עשויים להיות נוכחים באותו MPNST. בנסיבות אלה, ציון הגידול נקבע על ידי האזור בדרגה הגבוהה ביותר הקיימת.
      הערה: קיימת מחלוקת בין פתולוגים אנושיים האם מערכת הדירוג של ארגון הבריאות העולמי שתוארה לעיל מנבאת את תוצאות המטופלים, וחלק מהפתולוגים הללו מעדיפים במקום זאת פשוט לסווג MPNST כציון נמוך או ציון גבוה. תחת תוכנית זו, MPNST ברמה גבוהה יש אטיפיה ציטולוגית בולטת, פעילות מיטוטית מהירה (>5 מיטוזה לכל 10 שדות כוח גבוה), והיפר-תאיות ניכרת עם או בלי נמק. MPNST בדרגה נמוכה חסר נמק אך מראה פעילות מיטוטית, אטיפיה ציטולוגית ותאיות שהיא ביניים בין MPNST בדרגה גבוהה לבין ניאופלזמה נוירופיברומטית לא טיפוסית עם פוטנציאל ביולוגי לא ידוע (ANNUBP). אנו מעדיפים את המערכת שתוארה לעיל מכיוון שההבחנה בין ANNUBP לבין MPNST ברמה נמוכה יכולה להיות מאתגרת עבור חוקרים שאין להם ניסיון רב עם גופים אלה.

6. הכנת תרביות של מעבר מוקדם P 0-GGFβ3 MPNST תאים

1. תרבית של תאי גידול P 0-GGFβ3 בתרבית מוקדמת מחתיכת גידול טרייה 2 (שלב 1.5, איור 1A). לשמור על תנאים סטריליים מנקודה זו ואילך.
   1. נתקו את הגידול על ידי חיתוכו לחתיכות קטנות (2-4 מ"מ) וטחינה ב-DMEM10 (התווך החיוני המינימלי של דולבקו) המכיל 10% נסיוב עגל עוברי, 2 μmol/L פורסקולין ו-10 nmol/L neuregulin 1β (NRG1β) בצלחות תרבית רקמה של 100 מ"מ.
   2. אפשר לתאים לצמוח מתוך שברי הרקמה הטחונים ב 37 ^oC ב 5% CO₂ עד לוחות נפגשים. החליפו מדיה כל 3-4 ימים.
   3. לפצל את תרבית התא. הסר את המדיה מצלחת 100 מ"מ ולשטוף תאים עם PBS; יש להסיר ולהשליך רקמות טחונות. הסר PBS והוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לקדם ניתוק תאים, הקש בעדינות על הצלחת ובדוק ניתוק באמצעות מיקרוסקופ אור; יש להרחיב את הדגירה של טריפסין לפי הצורך.
   4. נטרול טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM10. מעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה ולתאי כדוריות ב 500 × גרם למשך 5 דקות. הסר את המדיה והוסף 5 מ"ל של DMEM10 טרי לכדור.
   5. פזרו את מתלה התא לשתיים עד ארבע צלחות 100 מ"מ המכילות DMEM10. אין לפצל את התאים ליותר מחמישה מעברים (שלבים 6.1.3 ו-6.1.4) ולשמור אותם ב-DMEM ללא פורסקולין ו-NRG1β. זכור להקפיא תאים במעבר 2 לשימוש עתידי.

7. אימות זהותם של תאי MPNST במעבר מוקדם על ידי אימונוציטוכימיה

1. מניחים סטרילי 18 מ"מ #1.5 זכוכית עגולה מכסה בבארות של 6-באר צלחת תרבית רקמות סטרילית.
   1. הכניסו תמיסת פולי-L-ליזין/למינין לבארות בנפח מספיק כדי לכסות את הכיסוי. אטמו את הצלחת בניילון נצמד כדי למזער אידוי. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הכיסויים 3x עם PBS סטרילי.
      הערה: ניסינו להרכיב תאי MPNST במעבר מוקדם על כיסויים לא מצופים ומצאנו שהתאים אינם נצמדים היטב בהיעדר ציפוי פולי-ל-ליזין/למינין.
   2. לוחית 10,000 תאים על הכיסוי על ידי הוספה עדינה של 2 מ"ל של תרחיף התא במצע גדילה לכל באר המכילה את הכיסוי. לדגור על הצלחות למשך הלילה ב 37 ° C עם 5% CO₂ באינקובטור תרבית רקמות.
   3. למחרת בבוקר, שטפו את הכיסויים במשך 2X5 דקות עם PBS.
   4. תקן תאים עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 18 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. שטפו את הכיסויים 3 x 5 דקות עם PBS. אם תרצה, אטם את הצלחת באמצעות סרט פלסטיק ואחסן אותה ב 4 ° C בשלב זה.
   6. הפוך טרי 50 mM NH₄Cl ב PBS. יש להרוות אלדהידים על ידי דגירה על הכיסויים ב-50 mM NH₄Cl ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. חדרו את התאים על ידי דגירה של כיסויים ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לכבס את החלקות למשך 3X5 דקות עם PBS.
   8. חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של כיסויים בחיץ חוסם (1x PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר, 0.2% חלב יבש ללא שומן ו-0.3% Triton X-100) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   9. הסר את המאגר החוסם והוסף נוגדנים ראשוניים המזהים את סמני MPNST הנמצאים בגידול האב (בדרך כלל S100β, Nestin ו- Sox10) מדוללים לדילול האופטימלי שנקבע מראש במאגר החוסמים. עוטפים את הצלחת בסרט פלסטיק ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה בתא לח.
   10. יש לשטוף 3 x 5 דקות עם PBS כדי להסיר נוגדן ראשוני לא קשור. מוסיפים נוגדן משני מסומן פלואורסצנטית מדולל בחיץ חוסם ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש להגן מפני אור.
   11. שטפו 3 x 5 דקות עם PBS. יש לדגור על החלקות ב-1-5 מיקרוגרם של צבע Hoechst למשך 10 דקות. להמשיך להגן מפני אור.
   12. יש לכבס את החלקות עם PBS למשך 5 דקות. הרכבה של שקופיות באמצעות 1:1 1x PBS/גליצרול. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. Allograft של תאי גידול במעבר מוקדם כדי להדגים גידוליות

1. לגדל תאי P 0-GGFβ3 MPNST במעבר מוקדם במפגש DMEM10 עד 80%. יש לשטוף תאים פעם אחת בטמפרטורת החדר בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס. טפל בתאים במשך 30 שניות עד דקה אחת עם תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטית כדי להסיר אותם מהמצע. הוסף 5 מ"ל של DMEM10 לכל 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים.
   הערה: דיסוציאציה תאית עשויה להימשך זמן רב יותר, עד 10-20 דקות. עיין בפרוטוקול היצרן.
   הערה: אין לגדל תאים למפגש מכיוון שהדבר יפחית את יעילות השתל.
   1. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. סובב תאים למטה ב 5 × גרם במשך 5 דקות והשהה אותם מחדש בריכוז של 1-2 × 10⁶ תאים לכל 100 μL של DMEM10. שמור תאים על קרח עד מוכן להזרקה.
   2. מרדימים עכברי NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) בתא האינדוקציה של וופורייזר איזופלורן. מניחים את החיה על בטנה ומעקרים את אתר ההזרקה עם 70% אתנול. יש לאפשר לאתר להתייבש באוויר לפני ההזרקה. לפני ההזרקה, יש לאפשר לתאים להגיע לטמפרטורת החדר.
   3. להזריק 1-2 x 10⁶ תאים תת עורית באגף ימין. הניחו את העכבר לבדו בכלוב ללא מצעים ואפשרו לו להתאושש. ודא כי רק חלק מהכלוב נמצא על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. פעולה זו מספקת אזור שהעכבר יכול לעבור אליו אם הוא מתחמם יתר על המידה.
      הערה: אנו משתילים לפחות שלושה עכברים עם כל תרבית מעבר מוקדם, מכיוון שחלק מהשתלים עשויים שלא לקחת.
   4. לאפשר השתל לגדול במשך 15-60 ימים; להעריך את בריאות בעלי החיים 3 פעמים בשבוע ולתעד ציונים של מצב הגוף, כולל משקל, ושינויים התנהגותיים בכל בדיקה. להפסיק עכברים שהגיעו לגודל השתל המרבי המותר או עכברים מתים באמצעות המתת חסד פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם. גיל שיא במוות בימים. כאשר גידולים הופכים גלויים חיצונית, רשום את ממדי הגידול (אורך, רוחב וגובה).
      הערה: מניסיוננו, תרביות MPNST מוקדמות שונות משתילות ביעילות משתנה ונבדלות בזמן הדרוש לצמיחת השתל. אין לאפשר לבעלי חיים להתקדם מעבר לגודל הגידול המרבי המותר על ידי IACUC ו/או לנקודת הקצה ההומנית.
2. קצרו את הגידול, תקנו אותו בפרפורמלדהיד 4%, הטמיעו אותו בפרפין ובצעו כתמי H&E כמתואר בסעיפים 2.1-2.2.9 כדי לוודא שהאלוגרפט הוא גידול ולא רקמה תגובתית. במידת הצורך, immunostain השתל עבור הסמנים שהיו נוכחים הגידול ההורה.

Results

איור 2 מדגים דוגמאות של גידולים ברורים לחלוטין המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3. גידולים שניתן לזהות בקלות בעין בלתי עשויים להיראות כגושים המפרידים בין אזורי גוף, כפי שמוצג באיור 2A (חץ). כאשר קובעים אם הניאופלזמה היא פוטנציאל לגידול נדן עצב היקפי, חיוני לקבוע כי הגידול קשור לעצב היקפי. במקרה זה, סריקת MRI (איור 2B) מראה שהגידול קשור לעצב הסיאטי (ראש החץ); קשר זה אושר לאחר המתת העכבר וניתוח הגידול. יש לציין כי גודל גדול אינו מעיד בהכרח על כך שהגידול ממאיר. במקרה זה, בדיקה היסטולוגית של הגידול (איור 2C) הראתה שמדובר בנוירופיברומה. לרוב, עם זאת, גידולים ברורים לחלוטין אינם מזוהים עד ביצוע necropsy של העכבר. איור 2D מדגים MPNST גדול ובשרני שהופיע בתוך המקלעת הברכיאלית של החיה הזו.

איור 3 מדגים דוגמאות מייצגות של MPNST ונוירופיברומות מעכברי P 0-GGFβ3 שהוכנו בהתאם לנהלים המתוארים בסעיף 1 של הפרוטוקול. איור 3A-J מדגים עשר דוגמאות של MPNST עצמאיים ממושבת העכבר P_0-GGFβ3 שלנו. שים לב שהמראה ההיסטולוגי של MPNST יכול להיות משתנה מאוד, אפילו בין MPNST הנובעים באופן עצמאי באותה חיה. שונות היסטולוגית זו ממחישה מדוע אנו מאשרים באופן שגרתי את האבחנה של P 0-GGFβ3 MPNST עם כתמים אימונוהיסטוכימיים. נציין גם כי סוגי גידולים אחרים, שככל הנראה אינם קשורים, מתרחשים באופן ספורדי בתדירות נמוכה בכמה זני עכברים מולדים (למשל, נתקלנו מספר פעמים בלימפומות בעכברי P 0-GGFβ3 הנושאים את הטרנסגן על רקע C57BL/6J), מה שמדגיש עוד יותר את חשיבות השימוש באימונוהיסטוכימיה כדי לאשר אבחנות גידול. למרות השונות במראה ההיסטולוגי שלהם, כל עשרת הגידולים המתוארים באיור 3A-J היו תגובתיים חיסונית עבור S100β ונסטין ושליליים עבור סמנים של סוגי גידולים אחרים. איור 3K מדגים תמונה מייצגת של עמוד חוליה שהסתייד כראוי ורקמות קשורות. שימו לב שחוט השדרה, שורשי העצבים, גוף החוליות ושרירי השלד שומרים כולם על מערכת יחסים אנטומית תקינה זה עם זה. איור 3L הוא תמונה בעלת עוצמה גבוהה יותר של גוף החוליה וחוט השדרה שמעליו. מכיוון שרקמה זו מסוידת כראוי, העצם נחתכה בקלות ללא גריסה או קיפול, ומח העצם ניתן לזיהוי בקלות בחללי המח. אם הרקמה לא הייתה מסוידת כראוי, היא הייתה נתפסת על להב המיקרוטום ונקרעת מהקטע, תוך גרימת נזק משמעותי לרקמות סמוכות (חוט השדרה, שורשי עצבי עמוד השדרה ושרירי השלד. איור 3M מציג תמונה מייצגת של נוירופיברומה המופיעה בתוך שורש עצב גבי בעכבר P 0-GGFβ3. שימו לב שהגידול הזה פחות תאי מה-MPNST שמוצג באיור 3A-J. האבחנה העיקרית עבור נוירופיברומות היא שהן מורכבות מתערובת מורכבת של תאי שוואן ניאופלסטיים ותאי פיטום שאינם ניאופלסטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים ואלמנטים דמויי פרי-עצביים החודרים לעצב ומפיצים אקסונים זה מזה.

איור 4 מדגים דוגמאות לכתמים השימושיים ביותר לזיהוי ראשוני של נוירופיברומה פרספורמית ולהבחנה בין נוירופיברומה פרסיפורמת לבין MPNST. איור 4A מדגים תגובתיות חיסונית של S100β בנוירופיברומה פרסיפורמת P 0-GGFβ3. שימו לב שתגובתיות חיסונית של S100β ניכרת רק בתת-אוכלוסייה של תאים, מה שעולה בקנה אחד עם העובדה שנוירופיברומות מורכבות מתערובת של תאי Schwann ניאופלסטיים ואלמנטים אחרים שאינם ניאופלסטיים (פיברובלסטים, תאי פיטום, מקרופאגים, תאים דמויי פרי-עצביים, אוכלוסיית תאים אימונוריאקטיבית CD34 מוגדרת היטב וכלי דם). לרוע המזל, צביעת S100β מטושטשת אינה מבחינה בין נוירופיברומות פרספקס ו-MPNST מכיוון שצביעה של S100β יכולה להיות מטושטשת ב-MPNST (צביעת H&E שימושית למטרה זו; עם זאת, מאחר ש-MPNST הם בדרך כלל יותר תאיים מאשר נוירופיברומות פרספקס [ראו איור 3]). תאי Schwann ניאופלסטיים הם גם אימונוריאקטיביים עבור קן חוט הביניים כפי שהודגם ב-P 0-GGFβ3 MPNST שהוצג באיור 4B. תאי Schwann ניאופלסטיים גם מדגימים לעתים קרובות תגובתיות חיסונית גרעינית עבור גורם השעתוק Sox10, כפי שמוצג ב-MPNST באיור 4C. תכונות שימושיות להבחנה בין נוירופיברומות plexiform ו- MPNST הן נוכחות של תאי פיטום ותגובתיות חיסונית בולטת עבור סמן התפשטות Ki67. איור 4D מדגים כתם Unna שבוצע על נוירופיברומה פרספקס P 0-GGFβ3 כדי להדגיש את נוכחותם של תאי פיטום, שניתן לזהות בקלות על-ידי הצביעה הסגולה המטכרומטית הבולטת של הגרגירים הציטופלזמיים שלהם. תאי פיטום אינם קיימים ב- MPNST. לעומת זאת, תגובתיות חיסונית של Ki67 כמעט ולא קיימת בנוירופיברומות פרספקס כפי שניתן לראות בגידול P 0-GGFβ3 שמוצג באיור 4E. תיוג גרעיני Ki67 קיים בדרך כלל בחלק גבוה מאוד של תאי גידול, כפי שניתן לראות ב-MPNST המיקרוסקופי המופיע בגנגליון הטריגמינלי של עכבר P 0-GGFβ3 (איור 4F).

איור 5 מדגים דוגמאות של כתמים שאנו מבצעים כדי לאפיין באופן מלא את ההרכב התאי של נוירופיברומות במודל GEM שפותח לאחרונה. למרות שהכתמים המוצגים באיור זה התקבלו בנוירופיברומות עוריות אנושיות, הם זהים במראם למה שראינו בגידולי GEM. תגובתיות חיסונית עבור CD117 (c-Kit) קיימת בתאי פיטום בתוך נוירופיברומות, ולכן יש לה התפלגות דומה מאוד למה שנראה עם כתמי Unna (ראו איור 3A). מקרופאגים נמצאים גם הם מפוזרים ברחבי נוירופיברומות, כפי שניתן לראות בסמן הפאן-מקרופאגים Iba1 (ראו איור 5D); זה כולל תת-קבוצות של מקרופאגים שהם תגובתיים חיסונית עבור CD163 ו-CD86 (ראו איור 5B ואיור 5C, בהתאמה). חלק קטן מהאלמנט השווני בנוירופיברומות מדגים גם תגובתיות חיסונית גרעינית עבור Sox10. פיברובלסטים יכולים להיות מודגשים על ידי תגובתיות החיסון שלהם עבור TCF4. באיור 5G, CD31 מסמן את האלמנטים של כלי הדם בתוך הנוירופיברומה, ואילו CD34, שהודגם באיור 5H, מסמן אוכלוסייה דנדריטית מסתורית של תאים שהוצע כי הם תת-אוכלוסייה של מקרופאגים³⁰ של רקמות תושבות או אוכלוסייה חדשה של תאי מעטפת עצב שאינם תאי Schwann או פיברובלסטים³¹.

איור 6 נכלל כדי לאפשר השוואה של נוירופיברומות פרספקס ו-MPNST אנושיים לגידולים שנצפו בעכברי P 0-GGFβ3 וכדי לספק דוגמאות מייצגות של כמה מסוגי הגידולים האנושיים שניתן לבלבל בינם לבין MPNST. איור 6A מדגים נוירופיברומה פרספקסית שהופיעה במקלעת הברכיאלית של מטופל NF1, ואילו איור 6B מציג את MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שהופיע בתוך אותה נוירופיברומה פרסידיפורמית. איור 6B מראה כמה מהמאפיינים האופייניים של MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי, כולל היפר-תאיות ניכרת ואטיפיה תאית, פעילות מיטוטית נמרצת ונמק גידולי. לשם השוואה, איור 6C מראה MPNST דרגה II של ארגון הבריאות העולמי שיש לו אטיפיה תאית משמעותית, אבל הוא פחות היפר-תאי מאשר MPNST דרגה IV, ואף על פי שמיטוזה קיימת, הוא מדגים פחות פעילות מיטוטית. איור 6D מדגים פיברוסרקומה עם תבנית "עצם הרינג" אופיינית של שזירת נדן של תאי גידול. עם זאת, דפוס זה אינו מבחין בהכרח בין פיברוסרקומות לבין MPNSTs, מכיוון שלחלק מה- MPNST יהיה דפוס דומה. יתר על כן, תצוגת העוצמה הגבוהה יותר שמוצגת באיור 6E מראה מורפולוגיה תאית דומה לזו שנצפתה ב-MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שהוצגה באיור 6B. איור 6F מדגים ליומיוסרקומה. שלא כמו רוב MPNST, leiomyosarcomas הם immunoreactive עבור סמני שריר כגון שריר חלק, אקטין ו desmin. עם זאת, תגובתיות חיסונית של אקטין שריר חלק יכולה להשתנות מגידול לגידול, כאשר חלק מהגידולים מפגינים תגובתיות חיסונית אחידה אינטנסיבית (איור 6G) ואחרים מראים תגובתיות חיסונית שמראה שונות תאית בתוך הגידול (איור 6H). תגובתיות חיסונית של Desmin יכולה להיות גם מטושטשת בליומיוסרקומות (איור 6I). מלנומות משתנות מאוד במורפולוגיה, כאשר חלק מהגידולים מורכבים מתאים מצולעים (איור 6J) ואחרים מורכבים מתאים בעלי ציר שיכולים לחקות את המורפולוגיה של תאי MPNST. ניתן להבדיל בין מלנומות לבין MPNST על-ידי תגובתיות חיסונית עבור סמנים מלנוזומיים כגון MART1 (איור 6K). אולם מלנומות, כמו MPNST, חיוביות לעתים קרובות עבור S100β ו-Sox10 (איור 6L).

איור 7 מדגים את המאפיינים הפתולוגיים של MPNST בדרגה II, III ו-IV של ארגון הבריאות העולמי שבודדו מעכברי P0-GGFβ3. איור 8 מציג תמונות מייצגות של תאי P 0-GGFβ3 MPNST במעבר מוקדם בהספק נמוך (איור 7A) ובעוצמה גבוהה (איור 7B). הגידול של התאים האלה מודגם הן על-ידי יכולתם ליצור מושבות כאשר הם תלויים באגר רך (איור 7C) והן על-ידי יצירת שתלים כאשר הם מושתלים תת-עורית בעכברים מדוכאי חיסון (איור 7D).

איור 1: זרימת עבודה המשמשת לעיבוד גידולים ורקמות אחרות מעכברי P 0-GGFβ3. (A) גידולים גלויים באופן גס נקצרים ומפולחים לשלושה חלקים עבור 1) קיבוע ב-4% פרפורמלדהיד ואחריו אימונוהיסטוכימיה והיסטוכימיה, 2) ביסוס תרבית תאי גידול במעבר מוקדם ו/או אנליזות גנומיות, ו-3) הקפאת בזק באמצעות חנקן נוזלי לבידוד חלבון, DNA או RNA. (B) לאחר כריתת הגידול, גוף העכבר מקובע בפרפורמלדהיד 4% והאיברים הפנימיים מוסרים. איברים אלה נדגמים לבדיקה היסטולוגית המבוצעת לזיהוי ראיות מיקרוסקופיות לניאופלזמה ותהליכים פתולוגיים אחרים. (C) לאחר הסרת איברים פנימיים, הגפיים (ראש, גפיים, זנב) ועור מוסרים מהפגר. עמוד השדרה, הצלעות הסמוכות ושרירי השלד הסמוכים עוברים הסתיידות באמצעות 0.3 M EDTA/4% paraformaldehyde (pH 8.0). לאחר מכן הרקמות המפורקות משובצות בפרפין וחלקים מהרקמות מוכנים לבדיקה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות מייצגות של נוירופיברומות ו-MPNST ברורים בעכברי P 0-GGFβ3. (A) עכבר P 0-GGFβ3 עם גידול גדול בולט בגסות בצד ימין (חץ). (B) סריקת MRI של עכבר זה מראה שהגידול מחובר לעצב הסיאטי (ראש החץ) ושהוא גדל דרך הפאשיה העליונה כדי להתרחב בתוך התת-עורית (חץ, מסת גידול בתפזורת). (C) בדיקה מיקרוסקופית של גידול זה מראה כי למרות גודלו הגדול, הגידול הוא נוירופיברומה. (D) MPNST בשרני גדול שהופיע במקלעת הברכיאלית של עכבר P 0-GGFβ3. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C). קיצורים: MPNSTs = גידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית; MRI = הדמיית תהודה מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות מייצגות של MPNST, עמוד השדרה המסויד ונוירופיברומות שהוכנו כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול. (א-י) P 0-GGFβ3 MPNST שנכרת ומוכתם ב-H&E מראים שונות היסטולוגית. כל התמונות נוצרות באופן עצמאי MPNST. למרות שונות היסטולוגית זו, גידולים אלה הראו תיוג מתאים לסמני MPNST המצוינים בטבלה 1. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (K) תמונה מייצגת של חתך רוחב מוכתם H&E של עמוד השדרה המסויד. בתמונה זו ניתן לדמיין בקלות את המבנים הבאים: חוט השדרה; עצם חוליות; גרעיני השורש הגבי על שורש עצב עמוד השדרה הגבי; ושריר השלד הפרא-חולייתי. הגדלה 4x. (L) תמונה בעוצמה גבוהה יותר של חוט השדרה והחוליה המוצגת ב-K מדגימה את המראה הנכון של העצם לאחר הסתיידות במתודולוגיה זו. הגדלה 10x. (M) תמונה מייצגת של נוירופיברומה של שורש עצב גבי בעכבר P 0-GGFβ3. הגדלה פי 40. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MPNSTs = גידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: כתם אבחוני המשמש לזיהוי ראשוני של נוירופיברומות פרספקס וההבחנה ביניהן לבין MPNSTs. (A) כתמים חיסוניים עבור S100β בנוירופיברומה פלקסיפורמת P 0-GGFβ3. שים לב כי צביעה חומה אינטנסיבית עבור אנטיגן זה קיימת רק בתת-קבוצה של תאים בגידול זה, בהתאם לעובדה כי נוירופיברומות מורכבות מתאי Schwann ניאופלסטיים וסוגים רבים אחרים של תאים שאינם ניאופלסטיים. (B) תמונת אימונופלואורסנציה של P 0-GGFβ3 MPNST מוכתמת עבור קן חוט הביניים (אדום) ומוכתמת נגדית בביסבנזימיד (כחול, כתם גרעיני). (C) MPNST מוכתם עבור גורם התמלול Sox10. תגובתיות חיסונית אינטנסיבית (חום) ניכרת בגרעינים של תת-קבוצה של תאי גידול. (D) תצוגה בעוצמה גבוהה של נוירופיברומה פרסידיפורמית P 0-GGFβ3 לאחר כתם אונה. כתם זה מייצר צביעה מטכרומטית (סגולה) של הגרגירים בתאי פיטום. ניתן להבדיל בין נוירופיברומות פרספקס לבין MPNST מכיוון שהאחרונים חסרים תאי פיטום. (ה,ו) Ki67 אימונוהיסטוכימיה ב-(E) נוירופיברומה פרסידיפורמית P 0-GGFβ3 ו-(F) P_0-GGFβ3 MPNST. שני החלקים הוכתמו בהמטוקסילין (צביעה גרעינית כחולה), כאשר תגובתיות חיסונית Ki67 ניכרת ככתמים גרעיניים חומים בכתמי אימונופרוקסידאז אלה. שימו לב כי לא ניכר צביעה גרעינית חומה בנוירופיברומה הפרספורמית, בעוד שרוב גרעיני תאי הגידול חיוביים ב- MPNST. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: MPNST = גידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות מייצגות של כתמים חיסוניים המשמשים לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאים המרכיבים נוירופיברומות. תמונות אימונופלואורסצנטיות אלה מנוירופיברומה עורית אנושית הוכתמו עבור (A) CD117 (c-Kit; סמן של תאי פיטום), (B) CD163 (מקרופאגים M2), (C) CD86 (מקרופאגים M1), (D) Iba1 (סמן פאן-מקרופאגים), (E) Sox10 (סמן תא Schwann), (F) TCF4 (סמן פיברובלסט), (G) CD31 (סמן כלי דם) ו-(HCD34 (מסמן תת-אוכלוסייה מובחנת ולא מובנת של תאים בנוירופיברומות). הגדלה 60x, פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונות מייצגות של נוירופיברומות פרקסיפורם, MPNST וכמה סוגי גידולים אנושיים אחרים שנחשבים באבחנה המבדלת של MPNST. (A) נוירופיברומה פרסידיפורמית המופיעה במקלעת הברכיאלית של חולה NF1, ומראה את התא התחתון הכולל ואת המראה השפיר של ניאופלזמה זו. למרות שלא ניתן לדמיין זאת בקלות בחלקים מוכתמים ב- H&E, קיימת תערובת מורכבת של סוגי תאים. מיטוזים לא נראים. הגדלה: 40x. (B) MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שעלה מהנוירופיברומה הפרספקס המתוארת ב-A. שימו לב לרמה הרבה יותר גבוהה של סלולריות. החץ מציין דמות מיטוטית, והכוכבית מציינת אזור של נמק הגידול בחלק הימני העליון של שדה מיקרוסקופי זה. הגדלה: 40x. (C) A WHO דרגה II MPNST. גידול זה הוא בעל דרגת תאים נמוכה יותר מאשר MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי המתואר ב - B. עם זאת, יש יותר אטיפיה גרעינית והיפרכרומזיה ממה שניתן לראות בנוירופיברומה הפרספקס המתוארת ב- A. החץ מציין את אחת הדמויות המיטוטיות המזדמנות שנתקלו בהן בניאופלזמה זו. הגדלה: 63x. (D) תצוגה בעוצמה נמוכה של פיברוסרקומה מסוג מבוגר הממחישה את דפוס "עצם הרינג" (הנדן השזור של תאי גידול) שנראה בדרך כלל בסוג גידול זה. למרבה הצער, ארכיטקטורת עצם הרינג נתקלת גם בכמה MPNST אנושיים ולכן לא ניתן להשתמש בה כדי להבחין בין פיברוסרקומות ו- MPNST. הגדלה: פי 20. (E) מבט בעוצמה גבוהה יותר על הפיברוסרקומה המודגם ב-D. שימו לב לדמיון בין המורפולוגיה התאית בפיברוסרקומה זו לבין המורפולוגיה התאית הניכרת ב- MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי המוצג ב - B. הגדלה: 40x. (F) תמונה בעוצמה גבוהה של ליומיוסרקומה, המדגימה מורפולוגיה תאית שנמצאת בטווח השונות שנצפתה ב-MPNST. הגדלה: 40x. (G) כתמים חיסוניים לאקטין שריר חלק בליומיוסרקומה המודגם ב-F. שימו לב שתאי הגידול מראים תגובתיות חיסונית אחידה ואינטנסיבית לאנטיגן זה. הגדלה: 40x. (H) כתמים חיסוניים לאקטין שריר חלק בליומיוסרקומה אחרת. בגידול זה, קיימת שונות גדולה יותר במידת התגובה החיסונית, כאשר חלק מהתאים מכתימים בעוצמה רבה יותר מאחרים. אין זה נדיר שתגובתיות חיסונית עבור אותו אנטיגן תהיה נוכחת באופן אחיד בגידול אחד ותהיה נוכחת רק בתת-קבוצה של תאי גידול בניאופלזמה שונה. הגדלה: 40x. (I) Immunostain עבור desmin ב leiomyosarcoma שלישי. בגידול זה, רק תת-קבוצה של תאי גידול היא אימונוריאקטיבית אינטנסיבית לאנטיגן זה. (J) מלנומה גרורתית. מלנומות ידועות לשמצה בכך שיש להן מורפולוגיה משתנה מאוד שיכולה לנוע בין קובואידי לציר; גידולים עם המורפולוגיה האחרונה נוטים ביותר להתבלבל עם MPNST, במיוחד בהתחשב בכך שגם מלנומה וגם MPNST יכולים להדגים תגובתיות חיסונית של S100β ו- Sox10. הגדלה: 40x. (K) תגובתיות חיסונית לסמן המלנומה MART1 בגידול המתואר ב-J. הגדלה: 40x. (L) תגובתיות חיסונית גרעינית לגורם השעתוק Sox10 במלנומה המוצגת ב-J. הגדלה: 40x, מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: MPNST = גידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: תמונות מייצגות של MPNST דרגה II-IV P 0-GGFβ3 של ארגון הבריאות העולמי. (A) פוטומיקרוגרפים בעוצמה נמוכה ו-(B) בעוצמה גבוהה של MPNST דרגה II של ארגון הבריאות העולמי. שימו לב שהצלולריות נמוכה יותר מה-MPNST בדרגה III של ארגון הבריאות העולמי המודגם בלוח C ושגרעיני תאי הגידול ב-D היפרכרומטיים יותר (כהים יותר) מאלה שנראים בלוח B. (C) פוטומיקרוגרפים בעוצמה נמוכה ו-(D) בהספק גבוה של MPNST דרגה III של ארגון הבריאות העולמי. גידול זה הדגים נתונים מיטוטיים של >4 לכל 10 שדות בעוצמה גבוהה, עם תאים שהיו צפופים יותר וגרעינים היפרכרומטיים יותר, לא טיפוסיים. (E) תצוגות בעוצמה נמוכה ו-(F) בעוצמה גבוהה של MPNST דרגה IV של ארגון הבריאות העולמי. שימו לב למוקד הנמק בחלק המרכזי התחתון של לוח F. הספק נמוך = 20x. הספק גבוה = 40x, פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תמונות מייצגות של תאי MPNST P 0-GGFβ3 במעבר מוקדם והגידול שלהם כפי שהודגם על-ידי גידול באגר רך ויכולתם לגדול כאלושתלים. (A) תמונות ניגודיות פאזה בהספק נמוך ו-(B) בהספק גבוה של תאי P_0-GGFβ3 MPNST במעבר מוקדם. (C) P 0-GGFβ3 MPNST תאים שגדלו באגר רך ומוכתמים בשחור סודני; המושבות ניכרות כפונקטה שחורה באגר. (D) תמונה המוכתמת בהמטוקסילין ובאאוזין של גידול שנוצר לאחר שתאי P 0-GGFβ3 MPNST הושתלו תת-עורית בעכבר מדוכא חיסון כמתואר בפרוטוקול. (E) התפשטות של תאי P 0-GGFβ3 MPNST בעלי מעבר מוקדם במשך תקופה של 5 ימים כפי שנקבע על ידי ציטומטר תמונה של Celigo. הספק נמוך = 10x, הספק גבוה = 40x; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר עבור כל הפאנלים לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם	שימוש	תגובתיות מינים/מחלקה
CD117	מדולל מראש	ארנב חד שבטי
CD163	1:200	עכבר monoclonl
CD31	1:50	ארנב רב שבטי
CD34	1:2000	ארנב חד שבטי
CD86	1:1000	ארנב חד שבטי
ציטוקרטין	1 מיקרוגרם/מ"ל	עכבר חד-שבטי
דסמין	1:50	עכבר חד-שבטי
איבה1	1:500	ארנב רב-שבטי
קי-67	1:50	ארנב חד שבטי
מארט1	1 מיקרוגרם/מ"ל	עכבר חד-שבטי
נסטין	1:1,000	עכבר חד-שבטי
PMEL	1:100	Rabbot חד שבטי
S100B	1:200	ארנב רב שבטי
SMA	1:100	עכבר חד-שבטי
סוקס10	1:10	עכבר חד-שבטי
TCF4/TCFL2	1:100	ארנב חד שבטי

טבלה 1: נוגדנים המשמשים לאבחון של נוירופיברומה פרספורמית וגידולים ממאירים של מעטפת עצב היקפית. נוגדנים המשמשים לזיהוי שגרתי של נוירופיברומות פרספקס GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), אבחון MPNST והערכה מלאה של סוגי תאים אחרים הקיימים בנוירופיברומות. קיצור: MPNST = גידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית.

		S100β	נסטין	סוקס10	מארט1	PMEL	דסמין	אקטין שריר חלק	ציטוקרטין	SS18-SSX פיוז'ן
MPNST		50-90%, בדרך כלל מוקד	חיובי1	~30%	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי
פיברוסרקומה		שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי
ליומיוסרקומה		נדיר	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	50-100%	חיובי	~40%	שלילי
סרקומה אפיתלואידית		שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	חיובי	שלילי
מלנומה		חיובי	חיובי	85%	חיובי	חיובי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי
סרקומה סינוביאלית מונופאזית		~30%	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	שלילי	חיובי	חיובי

טבלה 2: סמנים המשמשים לביסוס זהות הגידול בבני אדם. סמנים אימונוהיסטוכימיים והיסטוכימיים אלה, יחד עם הערכה של מורפולוגיה מיקרוסקופית של גידולים, משמשים להבדיל MPNST מניאופלזמות אחרות המחקות אותם. האבחנה המבדלת הנחשבת בדרך כלל עבור MPNST אנושי כוללת פיברוסרקומה מסוג מבוגרים, סרקומה אפיתלואידית, ליומיוסרקומה, סרקומה סינוביאלית מונופאזית ומלנומה. לפיברוסרקומות מסוג מבוגרים יש תבנית עצם הרינג מיקרוסקופית וכתם לוימנטין, אך לא S100β. Leiomyosarcomas, אבל לא MPNSTs, הם immunoreactive עבור desmin; לליומיוסרקומות יש גם גרעינים עם מורפולוגיה קהה במיוחד. סרקומות אפיתלואידיות, אך לא MPNSTs, הן תגובתיות חיסוניות עבור ציטוקרטין. מלנומות, כמו MPNST, עשויות להיות חיוביות ל-S100β, אך הן גם תגובתיות חיסונית עבור MART-1 ו-PMEL. קיצור: MPNST = גידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית. ¹שילוב של S100β ונסטין ניבוי גבוה של MPNST.

Discussion

השיטות ההיסטולוגיות והביוכימיות המוצגות כאן מספקות מסגרת לאבחון ואפיון מודלים של GEM של פתוגנזה נוירופיברומה ו- MPNST. במהלך השנים, מצאנו מתודולוגיות אלה להיות שימושי למדי להערכת הפתולוגיה של גידולים עצביים היקפיים הנובעים מודלים GEM 21,25,26. עם זאת, בעוד הפרוטוקולים המתוארים כאן שימושיים לקביעת מידת הדיוק של גידולים במודלים של GEM לשחזר את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים, יש כמה מגבלות לאסטרטגיות אלה שיש להעריך. ראשית, עכברי P 0-GGFβ3 מראים חדירה כמעט מלאה של פנוטיפ הגידול שלהם, מה שמקל יחסית על השגת מספר גדול של עכברים עם נוירופיברומות ו- MPNSTs 21,25,26 שניתן להשתמש בהם למחקרים גנומיים ומסכי shRNA בקנה מידה גנומי. החדירה הגבוהה של הפנוטיפ במודל זה גם הופכת עכברי P 0-GGFβ3 לשימושיים למדי לניסויים פרה-קליניים. יש להכיר, עם זאת, כי זה לא יהיה המקרה עבור כל המודלים של סרטן GEM. זו הסיבה שהדגשנו את החשיבות של קביעת שיעור בעלי החיים שניתן לחזות שיפתחו גידולים. כאשר עובדים עם מודל של בעלי חיים שפחות נפוץ לפתח גידולים, מצאנו יתרון בשימוש בשיטות הדמיה כגון הדמיית תהודה מגנטית או טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים כדי לזהות בוודאות בעלי חיים הנושאים גידולים שניתן להכניס לניסויים פרה-קליניים או למחקרים אחרים. עם זאת, גישה זו עלולה להיות חסכונית אם נדרשות סריקות חוזרות ונשנות. זו גם הסיבה שהדגשנו את החשיבות של קביעת זמן ההישרדות הממוצע של מודל GEM²⁶ - הבנה מתי ניתן לצפות לבעל חיים לפתח גידול מפחיתה את מספר הסריקות הנדרשות לזיהוי בעלי חיים עם הפנוטיפ הרצוי והעלויות הנלוות.

חשוב גם להכיר בכך שגידול גדול בעכבר הוא עדיין למעשה כמות קטנה למדי של רקמה. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים על תהליך שבו רקמת הגידול מחולקת לשלישים, כאשר חלקים מוקדשים להיסטולוגיה/אימונוהיסטוכימיה, הקמת תרביות תאי מעבר מוקדם, ובידוד של ביומולקולות (חלבונים, RNA, DNA) מעניינות. עם זאת, גודל הגידול ישתנה ואם הגידול הוא די קטן, זה יכול למנוע שיש מספיק רקמה כדי לחלק בצורה זו. במקרה כזה, על החוקר לקבוע האם אבחון הגידול או שימוש אחר ברקמת הגידול מקבל עדיפות³². בנסיבות אלה, ההטיה שלנו היא שאנו חייבים לקבל אבחנה נכונה כדי להבין עם מה אנו עובדים לפני שאנו יוצאים לניסויים אחרים. מצאנו כי אבחנות גידול בדרך כלל ניתן לקבוע בקלות באמצעות פחות משליש של neoplasm. כאשר מדובר בגידולים קטנים, בדרך כלל נסיר שבר קטן מרקמת הגידול, נעטוף אותו ברקמת היסטולוגיה ונניח אותו בקלטת רקמה כדי להבטיח שהרקמה לא תאבד במהלך העיבוד. החיסרון של גישה זו הוא שהיא עלולה לגרום לחוקר לערער את הניאופלזמה אם רוצים בדירוג של ארגון הבריאות העולמי; הסיבה לכך היא שאזורים בדרגה נמוכה וגבוהה יותר מתקיימים בדרך כלל יחד בסרטן, ואם נלקחת דגימה קטנה מאוד, הציון המתקבל יהיה תלוי מהיכן נלקחה דגימת הגידול.

הפרוטוקולים שאנו מתארים לקביעת זהות הגידול במעטפת העצבים ההיקפית מסתמכים במידה רבה על אימונוהיסטוכימיה. בעוד שישנן גישות חלופיות מדי פעם שניתן להשתמש בהן עבור סוגי תאים מסוימים (למשל, ביצוע כתמי Unna לזיהוי תאי פיטום), זה לא נכון באופן אחיד עבור רוב סוגי התאים הקיימים בנוירופיברומות ו- MPNST. כתוצאה מכך, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לקבוע כי ההליכים האימונוהיסטוכימיים שישמשו עברו אופטימיזציה נכונה. מניסיוננו, מספר בעיות יכולות לפגוע באימונוהיסטוכימיה אבחנתית. חשוב ביותר שהחוקר יבצע סדרה מדללת עם נוגדן ראשוני שלא השתמשו בו בעבר; בנוסף, סדרה דילול צריך להתבצע בעת שימוש אצווה חדשה של נוגדן כי כבר אופטימיזציה בעבר³³. יש להקפיד גם על מנת להבטיח כי אצוות טריות של ריאגנטים נמצאים בהישג יד. מניסיוננו, כאשר הם מזדקנים, מי חמצן ו-DAB נוטים במיוחד לא לתפקד כראוי, מה שעלול להוביל את החוקר להחליט באופן לא הולם שהכתמים שלהם שליליים.

הפרופילים האימונוהיסטוכימיים שאנו מתארים עבור נוירופיברומות פרספקסיות, MPNSTs, והסוגים השונים של גידולים הנחשבים באבחנה המבדלת של MPNST הם אלה שנתקלנו בהם בדרך כלל 21,25,26,34. עם זאת, מכיוון שהבחנה מסתעפת אינה נדירה ב- MPNST ובממאירויות אחרות אלה, החוקר עשוי להיתקל בפרופילי כתמים השונים במקצת ממה שתיארנו כאן. ניואנסים אלה הם הסיבה שאנו ממליצים בחום כי הצוות המאפיין מודל GEM חדש של גידולים יכלול פתולוג אנושי או וטרינרי מנוסה. בפרוטוקול זה, יישמנו את דירוג ארגון הבריאות העולמי על GEM ועל MPNST אנושיים. אנו מעדיפים שיטת דירוג זו מכיוון שקריטריוני הדירוג מוגדרים היטב יחסית וקל להשוות אותם בין MPNST אנושיים ועכבר ^2,28. נציין, עם זאת, כי קריטריוני הדירוג של ארגון הבריאות העולמי אינם מקובלים באופן אחיד על ידי פתולוגים. הסיבה לכך היא שלא ברור ששלושת הציונים של ארגון הבריאות העולמי המיושמים על MPNST מנבאים תוצאות קליניות בחולים. בגלל זה, פתולוגים רבים מעדיפים לסווג MPNST פשוט כמו ממאירויות בדרגה נמוכה או גבוהה. בגישה זו, כ-85% ממקרי MPNST נחשבים לממאירים בדרגה גבוהה המאופיינים בפעילות מיטוטית מהירה, אטיפיה תאית מסומנת והיפרכרומזיה שעלולה להיות מלווה בנמק גידולי. MPNST בדרגה נמוכה מראה פחות צלולריות, היפרכרומזיה ופעילות מיטוטית.

מצאנו כי allografting מוקדם מעבר תאי MPNST הוא אמצעי פשוט לאמת את הגידול של תרביות אלה. עם זאת, כמה בעיות יש לשקול כאשר התאים אינם להקים allograft³². מניסיוננו, בעוד שהרוב המכריע של תאי MPNST במעבר מוקדם יקימו אלוגרפט, נתקלנו מדי פעם בתרביות מעבר מוקדמות שאינן יוצרות. למרות כישלון זה, מערך הכלאות גנומי השוואתי (aCGH) וריצוף אקסומי שלם הראו כי לתרביות המעבר המוקדמות הללו היו הפרעות גנומיות מרובות התואמות את היותן תאי גידול^25,26. מצאנו גם תרביות מעבר מוקדם שאינן בריאות, בדרך כלל משום שהתרבויות הורשו להתמזג לפני שקצרו אותן לכריתה. תאים שניזוקו מטיפול גס (למשל, מודגרים זמן רב מדי עם תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים שעולה ויורדת מספר רב מדי של פעמים) גם הם מתפקדים פחות טוב כאשר הם מושתלים. נציין גם כי הזמנים שציינו להקמת השתל הם הערכה המבוססת על ניסיוננו. לעיתים, נתקלנו בתרבויות מעבר מוקדמות שיצליחו לבסס אלושתלים אך ייקח להן זמן רב יותר לעשות זאת.

הגישות המתוארות לעיל מספקות אמצעי מקיף לאפיון היבטים מרכזיים של מודל GEM שפותח לאחרונה של ניאופלזיה של מערכת העצבים ההיקפית ואבחון נכון של נוירופיברומות ו- MPNST שבעלי חיים אלה מפתחים. השיטות שאנו מתארים לביסוס תרביות MPNST במעבר מוקדם ושימוש בתרבויות אלה לאלוטרפטינג מספקות גם ראיות ברורות לגידולים של גידולים שזוהו במודלים של GEM. נדגיש כי איננו מבצעים את הבחירה של שיבוטים בודדים בעת הקמת תרבויות מעבר מוקדמות. למרות שאנו מכירים בכך שברירה מסוימת היא בלתי נמנעת בעת מיקום תאי גידול בתרביות, ממצאים ראשוניים אלה מצביעים על כך שהמוטציות שזוהו בתרביות GEM MPNST במעבר מוקדם נותרו דומות מאוד לאלה הקיימות בגידול ההורה. עם זאת, באמצעות aCGH, מצאנו גם כי המשך נשיאת תרביות המעבר המוקדמות הללו למעברים ארוכים יותר גורם לשינויים גנומיים שמתחילים לסטות ממה שנראה במעברים המוקדמים יותר של תאים סרטניים אלה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 מ"מ לוחות תרבית רקמות	קורנינג פלקון	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- לוחות באר	קורנינג קוסטאר	3516
חומצה אצטית	פישר סיינטיפיק	A38-212
Alexa Fluor 488 משני (נגד עכברים עיזים)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 משני (נגד עכברים עיזים)	Invitrogen	A21043 או A11004
Alexa Fluor 568 משני (נגד ארנב עיזים)	Invitrogen	A11036
אמוניום כלוריד (NH<תת>4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA ערכת בדיקת חלבון	Thermo Scientific	23225
אלבומין	סרום בקרפישר סיינטיפיק	BP1600-100
קלדסמון	ABCAM	E89, ab32330
CD117	סמל תא	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
מגרד תאים	Sarstedt	83.183
חשפנית תאים	קורנינג	25-056-CI
מעגל כיסוי	פישר סיינטיפיק	12-545-100
Citrisolve היברידי (ממס מבוסס d-לימונן)	Decon Laboratories	5989-27-5
מבקר חומצה	פישר סיינטיפיק	A104-500
ציטוקרטין	ABCAM	C-11, ab7753
דסמין	אג'ילנט דקו	שיבוט D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
אתנול (200 הוכחה)	Decon Laboratories	2716
סרום עגל עוברי	Omega Scientific	FB-01
מזלג	סיגמא-אולדריץ'	F6886
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G6279
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	קורנינג	21-022-CV
האריס המטוקסילין	פישרברנד	245-677
המציטומטר	ברייטליין-האוזר סיינטיפיק	1490
חומצה הידרוכלורית	פישר Scientific	A144-212
מי חמצן	פישר סיינטיפיק	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (פרוקסידאז) ערכת פולימר,	מעבדות וקטור	MP-2400
ערכת פולימר ImmPRESS HRP (פרוקסידאז),	מעבדות וקטור	MP-7401
חממה	תרמו סיינטיפיק	Heracell 240i CO2 אינקובטור
איזופלורן	פיראמל	NDC 66794-017-25
איזופרופנול	פישר סיינטיפיק	A415
Ki-67	איתות תאים	12202
למינין	תרמו פישר 23017015
מדעי חנקן
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
מיקרוטום
נסטין	Millipore	אנושי: MAD5236 (10C2), אנושי: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	תוצרת	S.L.C. (זמין גם כ-396-HB-050/CF מ-R& D Systems)
נוירופיברומין	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc-67
הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ עכברי	מעבדת ג'קסון	5557
חלב יבש ללא שומן	Walmart	מותג
P0-GGFβ 3 עכברים	בבית
שעוות פרפין	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (מדיום הרכבה קסילן)	Fisher Scientific	SP15-100
מד pH	מטלר טולדדו	שבע אקסלנס, 8603
פוספט חוצץ מלח (Dulbecco's)	קורנינג	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
פולי-L-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P5899-5MG
מכונת איזופלורנס ניידת	VetEquip מערכות
PVA-DABCO (מדיום הרכבה מימי)	Millipore Sigma	10981100ML
סיר אורז	אשור המילטון
S100B	Agilent Dako	Z0311  (עכשיו GA504)
SMA	Ventana מערכות רפואיות	שיבוט 1A4
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	S640
נתרן ציטראט (דיהידרט)	פישר סיינטיפיק	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
			היסטולוגיה פלדה
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק	12-550-15
TCF4/TCFL2	איתות סלולרי	(CH48H11) #2569
קלטת
טולואידין כחול	ACROS Organics	348600050
טריטון X-100	פישר סיינטיפיק	BP151-500
טריזול	אינוויטרוגן	15596026
טריפסין	קורנינג	25-051-31