הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65750

⸱

22 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

תקציר

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.

סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג'ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.

סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.

מבוא

שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות1. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)1. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx2. פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות3, פעילות גופנית 4,5 ומחלה6.

לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים7. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה8. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.

זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות9 הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ"ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד9. Christensen et al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ"מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן "אוגמו" סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני9. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx 6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות שריר אנושיות נלקחו מהווסטוס לטרליס מ n = 3 (2 גברים, 1 נקבה), בגילאי 70-74 שנים בתנאים סטריליים באמצעות הרדמה מקומית (Xylocaine) ומחט ברגסטרום שונה עבור יניקה ידנית11,12. הדגימות היו תת-קבוצה של מחקר קודם שאושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ויקטוריה (HRETH11/221) ונערך בהתאם להצהרת הלסינקי13. המשתתפים נתנו הסכמה כתובה ומודעת להשתתף במחקר זה. פרטים מלאים על כל החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים בטבלת החומרים. בנוסף, רשימה של אסטרטגיות לפתרון בעיות המטפלות בבעיות פרוטוקול נפוצות מסופקת בטבלה 1.

1. ייבוש בהקפאה

  1. בזמן שאתם שומרים את דגימות השריר שעברו ביופסיה קפואות על קרח יבש, שוקלים ומטפלים בצינורית קפואה ריקה על המאזניים.
  2. לשקול במהירות מינימום של 10 מ"ג של רקמה קפואה במשקל רטוב. רשום את המשקל למקום עשרוני אחד.
  3. הפקידו את הרקמה בצינור המיקרוצנטריפוגה המקורר מראש שיש לו 3-4 חורים שנוקבו לתוך המכסה והכניסו אותו לכוס קטנה עם 2-3 כדורי קרח יבש.
  4. פעל בהתאם להוראות ההפעלה של יצרן מייבש ההקפאה.
  5. ודאו שכל השסתומים במייבש ההקפאה סגורים והפעילו את מייבש ההקפאה.
  6. השתמשו בלוח הבקרה כדי לבדוק שנקודת הגדרת הוואקום תוכנתה לתנאי ייבוש אופטימליים בהקפאה עבור רקמה אנושית, 0.12 מיליבר (mBar) (איור 2).
  7. לחץ ידנית על מייבש ההקפאה והמתן עד שהתא יתקרר ל -40 מעלותצלזיוס.
  8. לאחר שהתא הגיע לטמפרטורה זו, הסירו את המכסה, ולאחר מכן את תא הזכוכית, והניחו את הכד (עם דגימת שריר) על במת המתכת.
  9. החלף את תא הזכוכית והמכסה. סגרו את שסתום שחרור הוואקום על המכסה והמתינו עד שנורית סולם הוואקום תהפוך לירוקה כדי לוודא שהמייבש אטום בוואקום.
  10. יבשו בהקפאה את דגימות השריר למשך 48 שעות. לאחר השלמת הייבוש בהקפאה, כבו את משאבת הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום ופתחו את שסתום שחרור הוואקום במכסה.
  11. הסירו את מכסה התא ואספו את הדגימה המיובשת בהקפאה. שקלו את הרקמה ורשמו את המשקל למקום עשרוני אחד.
  12. חישוב אחוז אובדן המשקל; ~ ירידה של 75% במשקל מצביעה על כך שהרקמה יובשה בהצלחה בהקפאה (בעבודה זו, ממוצע ± SD, 76 ± 9%, n = 11 דגימות שריר).
  13. לחץ על AUTO כדי לכבות את משאבת הוואקום והמקפיא. אפשרו ליחידה להגיע לטמפרטורת הסביבה.
  14. נקו את סלילי הקירור בהתאם להוראות היצרן ונקזו נוזלים שהצטברו מהקולט.
    הערה: איסוף הסיבים יכול להתחיל באופן מיידי. כאשר הרקמה אינה משמשת לבידוד סיבים, יש לשמור את הדגימה המיובשת בהקפאה בטמפרטורה של -80°C במיכל אטום עם חרוזי מייבש.  אזהרה: קרח יבש הוא מסוכן (דרגה 9); עיין ב- MSDS לקבלת טיפול בטוח מומלץ.

2. איסוף סיבים

  1. הכנת אוסף סיבים
    1. יש לסמן לפחות 50 צינורות מיקרופוגה (סיבים 1 עד 50) ופיפטה 10 μL של חיץ דנטורינג לכל צינור.
    2. הכינו את אזור האיסוף עם שני זוגות של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות, רקמה נטולת מוך, מנורת ספסל, סטריאומיקרוסקופ (עם הבמה השחורה למעלה), מערבולת וצנטריפוגת ספסל.
    3. הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה על מכסה צלחת פטרי. הניחו את המכסה על במת המיקרוסקופ המנתח.
    4. צפה בסרטון של דיסקציה של סיב יחיד. תרגלו את הפרוטוקול המלא מאיסוף סיבים ועד לזיהוי סוג סיב יחיד לפחות פעמיים לפני תחילת המחקר.
    5. לפני איסוף הסיבים, יש לחשב את הנפח הכולל הדרוש לדגימת סוג סיבים מכל ביופסיה באופן הבא. לדוגמה, אם הנפח ההתחלתי של 1 סיב = 10 μL והנפח שנותר לאחר MyDoBID הוא (1 סיב × 10 μL) - 1 μL המשמש להכתמת נקודות = 9 μL (נפח דגימה), חשב את נפח הדגימה הכולל הנדרש על ידי הכפלת נפח הדגימה (μL) במספר הכולל של כתמים מערביים שיופעלו והכפל סכום זה כדי לקחת בחשבון יתירות: (9 μL × 4 כתמים מערביים) × 2 = 72 μL. חשב את מספר הסיבים הדרושים לכל דגימה מוקלדת על ידי חלוקת נפח הדגימה הסופי הנדרש (μL) בנפח הדגימה לכל דגימה ספציפית לסוג סיבים (לדוגמה, 72 μL ÷ 9 μL = 8 סיבים לכל דגימה ספציפית לסוג הסיב). כדי להשיג זאת, לאסוף סך של 50 סיבים.
      הערה: נפח הדגימה הנדרש הוא ריכוז החלבון המינימלי הנדרש להפעלת MyDoBID ו- Western Blotting אם כמות החלבון המוטענת שווה לסיב ~3 מ"מ (~ 12 מיקרוגרם משקל רטוב) עבור כל דגימה (ראה קובץ משלים 1 לפרטים). עם זאת, נפח זה אינו לוקח בחשבון אם ג'לים חוזרים נדרשים עבור חלבון נתון.  זהירות: המלקחיים חדים; טפל בהם בזהירות כדי למנוע את הסיכון של ניקוב העור.
  2. בידוד סיב יחיד
    1. על פיסת נייר קטנה בגודל 5 ס"מ x 1 ס"מ, השתמש בסרגל כדי לצייר קו של 1 ס"מ. סמן כל 1 מ"מ בקו זה.
    2. הכניסו אותו מתחת למכסה צלחת הפטרי כמדריך להערכת אורך הסיבים שנאספו.
    3. הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה מתחת לסטריאומיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (x 7.5). השתמשו בזוג אחד של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות כדי להחזיק את השריר המיובש בהקפאה במקומו ועם השני התחילו להפריד צרורות קטנים של סיבים (כפי שניתן לראות בסרטון).
    4. בודדו צרור סיבים אחד והמשיכו להפריד זה מזה עד שמקטעי סיבים בודדים מבודדים מהצרור.
    5. אספו לפחות 50 סיבים באורך ~1 מ"מ לפחות.
    6. העבירו את הסיב לחלל ריק על צלחת הפטרי. בדוק מקטעים בעלי סיב יחיד בהגדלה גבוהה יותר (x 50). ודאו שמדובר בסיב בודד על ידי הפרדה נוספת של הסיב בקצהו. אם הסיב נשבר במקום להיפרד, זהו סיב יחיד.
  3. דנטורציה של סיבים
    1. בעזרת מלקחיים, אספו בעדינות את הסיב והניחו אותו ישירות לתוך חיץ הדנטורינג המקורק (אל תתנו למלקחיים להיתקל בחיץ).
    2. בדוק את המלקחיים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהסיב הוסר בהצלחה. סגור את הצינור והקש בחוזקה על תחתית הצינור על הספסל שלוש פעמים כדי להבטיח שהסיב יזוז לתוך החיץ.
    3. נקו את המלקחיים באמצעות רקמה נטולת סיבים לפני שתעברו לסיב הבא. חזור על תהליך זה עד שכל הסיבים נאספים.
    4. מערבלים את דגימות הסיבים וצנטריפוגה קצרה במשך 5 שניות ב 2,500 × גרם כדי למשוך את הדגימה לתחתית הצינור.
      הערה: משך הצנטריפוגה (5 שניות) מתוזמן מההתחלה (0 × גרם) עד שהמהירות מגיעה ל~2,500 × גרם.
    5. השאירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי. יש להקפיא ולאחר מכן להפשיר את הדגימות לפני השימוש.

3. כתם נקודה

  1. הכנת הממברנה והפעלתה
    1. מדדו, תייגו וחתכו לגודל קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) אחד (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) כדי להתאים ל-50 דגימות (~10.5 ס"מ x 5.5 ס"מ).
    2. סמן את הגבול השמאלי מבחינה מספרית מלמעלה למטה (1 עד 10) ואת הגבול העליון בסדר אלפביתי משמאל לימין (A עד E) במרווחים של 1 ס"מ זה מזה.
    3. הכן ארבעה גיליונות נייר סינון במידות של 12.5 ס"מ x 7.5 ס"מ.
    4. ערמו שני גיליונות יחד ליצירת ערימה. השרו מראש את ערימת נייר הסינון במאגר העברה אחד.
    5. מניחים את הממברנה במיכל. יוצקים 95% אתנול על הממברנה, עם נפח מספיק כדי לטבול לחלוטין את הממברנה (10-15 מ"ל). התסיסו על הנדנדה במשך דקה.
    6. אספו את האתנול, טבלו את הממברנה במאגר העברה 1x (~ 15 מ"ל), ונדנדו במשך 2 דקות נוספות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר הן באתנול והן בחיץ העברה לניסויים עתידיים של הכתמת נקודות עד להיווצרות שיקוע (שינוי לאחר שישה שימושים).
    7. הנח את ערימת נייר המסנן הספוג במאגר העברה על משטח שטוח הניתן להזזה, כגון מכסה גדול, ושטח באמצעות הרולר. מקם את קרום PVDF על הערימה באמצעות משחרר ג'ל או פינצטה.
    8. הניחו גיליון בודד של נייר סינון יבש על גבי הממברנה והעבירו את הגלגלת מעל נייר הסינון כדי לספוג את עודפי החיץ על פני הממברנה. הסר את נייר הסינון העליון מבלי לשפשף את הממברנה.
      אזהרה: מתנול (דרגה 3, תת-סיכון 6.1) ואתנול (דרגה 3) מסוכנים. עיין בגליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS) לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
  2. ספיגת דגימה לממברנה
    1. הפשירו את דגימות הסיבים, בצעו צנטריפוגה קצרה (5 שניות) בטמפרטורת החדר כמו בשלב 2.3.4 וערבבו היטב את הדגימה.
    2. מבלי לגעת בקרום עם קצה הפיפטה, יש להפקיד באיטיות טיפה ~1 μL של כל דגימה על הממברנה באזור המיועד. מידות השטח המיועד לדגימת סיבים הן ~ 1 ס"מ x 1 ס"מ. המטרה היא לאתר את הדגימה במרכז אזור זה.
    3. הניחו לטיפות הדגימה להיספג דרך הממברנה למשך 15 דקות לפחות. ודא שלא נשאר חיץ דגימה והוא נספג לחלוטין.
    4. בעזרת פינצטה מפלסטיק, הרימו בזהירות את הממברנה מערימת נייר הפילטר הלח, הניחו אותה על גיליון יבש אחד של נייר פילטר, וייבשו את הממברנה למשך 5 דקות לפחות.
    5. ברגע שכתמי הדגימה הופכים לבנים לחלוטין, הפעל מחדש את הממברנה.
  3. הפעלה מחדש של הממברנה וחסימה
    1. הפעל מחדש את הממברנה על-ידי חזרה על שלבים 3.1.5 ו- 3.1.6.
    2. הניחו את הממברנה במאגר השטיפה ושטפו במשך 5 דקות עם נדנדה. יש להשליך את מאגר הכביסה.
    3. דוגרים על הממברנה בחיץ חוסם למשך 30 דקות תוך כדי נדנוד.
    4. שטפו את הממברנה 3 פעמים עם חיץ שטיפה עד שהמאגר כבר לא מעונן.
    5. השאירו את הממברנה בשטיפה הסופית על הנדנדה.

4. תיוג חיסוני

  1. איתור MHCIIa
    1. יש לדלל את הנוגדן הראשוני MHCIIa ב-1 ל-200 ב-10 מ"ל של מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA).
    2. יש להשליך את חיץ השטיפה מהממברנה ולאחר מכן לשפוך את נוגדן MHCIIa המדולל על הממברנה.
    3. הניחו את המיכל (עם הממברנה ב-MHCIIa) על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב-4°C למשך הלילה.
    4. יש לאסוף את נוגדן MHCIIa ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C. שטפו את הממברנה עם חיץ חוסם למשך 2 דקות על הנדנדה.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכל הנוגדנים הראשוניים עד פי חמישה כל עוד המאגר נשאר ברור.
    5. לשטוף פעמיים נוספות; 5 דקות בכל פעם; שלוש שטיפות בסך הכל.
    6. לדלל עכבר אימונוגלובולין G חזרת פרוקסידז (IgG-HRP) נוגדן משני ב 1 ל 20,000 ב 10 מ"ל של חיץ חוסם ולהוסיף לממברנה.
    7. השליכו את חיץ השטיפה ודגרו על הממברנה בעכבר IgG-HRP משני עם נדנוד למשך שעה אחת.
    8. יש להשליך את המשני ולשטוף את הממברנה במאגר השטיפה (2, 5, 5 דקות).
    9. השאירו את הממברנה ספוגה בשטיפה הסופית עד שהיא מוכנה להדמיה.
    10. הפעל את מכונת ההדמיה בג'ל, המתן 15 דקות עד שמכונת ההדמיה תגיע לטמפרטורת ההפעלה הנדרשת ולאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
    11. בחלון התוכנה, לחץ על New Single Channel Protocol (איור 3A). לתמונת אור לבן של הממברנה, תחת יישומים | כתמים | לחץ על Colorimetric (איור 3B).
    12. לחץ על אזור הג'ל; כל אפשרות מתוכנתת למידות ספציפיות כך שיתאימו לגודל של סוגי ג'ל שונים. בחרו באפשרות המתאימה ביותר למידות הממברנה (איור 3C).
    13. הכינו את ה-ECL על ידי שילוב ריאגנטים של לומינול ופרוקסידז ביחס של 1:1. הכינו נפח מספיק של תערובת ECL כדי לכסות את כל הממברנה, בדרך כלל נדרש נפח כולל של 800-1,000 מיקרוליטר.
    14. מניחים את הממברנה על מגש פלסטיק גדול ושקוף ומפזרים את תערובת ECL על הממברנה.
    15. הניחו את הממברנה על לוח ההדמיה.
    16. לחץ על מיקום ג'ל (כפתור צהוב) לתצוגה חיה של המצלמה. לחצו לחיצה ממושכת וגררו את לחצן הזום כדי להגדיל את אזור ההדמיה של הממברנה. בשלב זה, יישרו את מיקום הממברנה במידת הצורך.
    17. לחץ על הפעל פרוטוקול (כפתור ירוק) והמתן להפקת תמונה צבעונית של הממברנה. שמרו תמונה זו כדי לסייע בהתאמת הנקודות לדוגמת הסיב המתאימה.
    18. מבלי להזיז את הממברנה, שנו את היישום בתוכנה על-ידי לחיצה על האפשרות לכריכה של 2 x 2 (Chemi High Resolution) (איור 3D).
    19. תחת חשיפה לתמונה ותוכנה, מטב את זמן החשיפה, לחץ על פסים חלשים (איור 3E) | מצב צבירת אותות.
    20. תחת הגדרה, הקלד 1 שניות עבור התמונה הראשונה, 30 שניות עבור התמונה האחרונה ו- 30 תמונות בסך הכל (איור 3F).
    21. לחץ על הפעל פרוטוקול.
    22. שמור תמונה בשלבים הבאים: לפני רוויית אות (כל הנקודות הגלויות שחורות), רוויית אות ראשונית (נקודות מסוימות מתחילות להרוות) וכתמים רוויים יתר על המידה (כל הכתמים עם אות חזק שזוהה הם רוויים).
    23. שמור את כל התמונות הדרושות לפני סיום הצטברות האות. הוציאו את הממברנה מהתמונה.
    24. בעזרת משחרר הג'ל, החזירו את הממברנה למיכל בעזרת חיץ השטיפה.
  2. איתור MHCI
    1. שפכו את חיץ השטיפה החוצה ופנקו את הממברנה עם חיץ הפשטה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C (ודאו שהקרום שקוע לחלוטין).
    2. אספו מחדש את חיץ ההפשטה ושטפו את הממברנה בחיץ השטיפה במשך 5 דקות עם נדנדה.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפשטה 10x לפני השלכתו.
    3. שפכו החוצה את חיץ השטיפה והפעם מרחו נוגדן MHCI ראשוני מדולל בריכוז התחלתי של 1 ל-200 (טווח: 1 ל-200 ל-1 ל-500). רוק את הממברנה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
    4. לאחר הדגירה בנוגדן MHCI ראשוני, יש לאסוף את הנוגדן ולשטוף את הממברנה כמו בשלבים 4.1.4 ו-4.1.5.
    5. לדלל עכבר IgM HRP נוגדן משני בחסימת חיץ ב 1 ל 20,000. יוצקים את המאגר החוסם מהממברנה ודגרים בעכבר IgM משני כמו בשלב 4.1.7.
    6. שטיפה ולכידת תמונה זיהו MHCI כמו בשלבים 4.1.8 עד 4.1.24.
      אזהרה: מאגר הפשטה מכיל אורגנו פוספין 3-5% (דרגה 8). עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
  3. איתור MHCIIx פוטנציאלי באמצעות Actin
    1. הפשיט את הממברנה פעם נוספת (שלבים 4.2.1 ו- 4.2.2).
    2. חזור על סעיף 4.1, הפעם תוך שימוש בנוגדן ראשוני אקטין מדולל ב-1 ל-500 במאגר BSA ולאחר מכן נוגדן משני HRP מדולל ב-1 ל-20,000 במאגר חוסם.

5. זיהוי סוג סיבים

  1. ניתוח אותות MHCI, MHCIIa ואקטין
    1. הכירו את לוח עוצמת האות (איור 4A). רשום לעצמך את שלבים 5.1.2 עד 5.1.4.
    2. עוצמת אות רווי מצביעה איכותית על כך שזיהוי החלבון חזק.
    3. מתון מציין כי חלבון המטרה נמצא ברמה בינונית.
    4. אות חלש מצביע על נוכחות מועטה של חלבון מטרה.
    5. השתמשו בלוח עוצמת האות כדי לסווג סיבים עם עוצמת אות 'רוויה', 'בינונית' או 'חלשה' (איור 4A).
    6. בצעו זיהוי סוג סיבים על-ידי השוואת תוצאות MHCIIa ו-MHCI תחילה (איור 4B, כתמים שמאליים ואמצעיים).
    7. הקלט סיבים עם עוצמת אות רוויה או בינונית של איזופורם MHC אחד בלבד.
    8. אם אות האיזופורם MHC 'חלש', השאירו את הסיב לא מסומן (ראו איור 4B).
    9. לבסוף, כאשר אקטין נצפה (עוצמת אות בינונית או רוויה) בסיבים ללא זיהוי MHCI או IIa, רשמו אותו כסיב פוטנציאלי מסוג IIx (איור 4B, כתם ימני).
    10. הקלט סיבים עם אות איזופורם MHC חלש אך אקטין זוהה (עוצמה בינונית או רוויה) כבלתי מזוהה.
    11. השליכו דגימות עם זיהוי חלש או ללא זיהוי (ללא סיבים נאספים) עבור כל שלושת חלבוני המטרה (איור 4C).
    12. הקלט כל סיב שבו אותות MHCI ו- MHCII מזוהים עם אות 'רווי' או מתון. דגימות אלה אינן מיועדות לשימוש בתכשיר ספציפי לסוג הסיבים.
  2. הכנת דגימות ספציפיות לסוג סיבים
    1. הכינו דגימה נפרדת מסוג I ו-II לכל ביופסיה. עבור דגימה מסוג II, שלב את מספר הסיבים המינימלי הנדרש (מחושב בשלב 2.1.5) שבהם MHCIIa מזוהה ברמות רוויות או בינוניות.
    2. בצינור נפרד שמסומן כסוג I, חזרו על התהליך הזה עבור סיבים שבהם MHCI מזוהה (איור 4D).
    3. השתמש בסיבים עם עוצמת אות בינונית אם אין מספיק סיבים עם אותות רוויים.
    4. שלב כל סיבי IIx פוטנציאליים.
    5. השתמש מיד בדגימות ספציפיות לסוג סיבים עבור כתמים מערביים או לאחסן אותם ב -80 ° C לשימוש עתידי.

6. אישור סוג סיבי כתם מערביים

  1. נצלו 10 μL מכל דגימה ספציפית לסוג הסיב (נפח הדגימה המינימלי הנדרש, ראה שלב 2.1.5).
  2. יש להפריד דגימות באמצעות הג'ל הטרומי שצוין באמצעות SDS-PAGE בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. השתמש במכונת הדמיה של ג'ל כדי לזהות את החלבון בג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  4. מניחים את הג'ל במאגר העברה קר 1x למשך 10 דקות.
  5. העברה רטובה של החלבונים לקרום ניטרוצלולוז בגודל 0.45 מיקרומטר (9.5 ס"מ x 13.5 ס"מ) על פי פרוטוקול היצרן.
  6. לאחר ההעברה, לשטוף בקצרה את הממברנה עם ultrapure H2O במיכל. יוצקים החוצה את המים האולטרה-טהורים.
  7. הוסף 10 מ"ל של תמיסת משפר אות נוגדנים לממברנה ולסלע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. אסוף מחדש את תמיסת משפר אות הנוגדנים ושטוף 5x (5 שניות לכל כביסה) עם H2O טהור במיוחד.
    הערה: ניתן להשתמש בתמיסת משפר אות נוגדנים פי 5 לפני השלכתה.
  9. יוצקים החוצה את השטיפה האחרונה, מוסיפים תמיסת חסימה ומתנדנדים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  10. השתמש בלהב אזמל נקי או מספריים כדי לחתוך אופקית על פני הממברנה במשקל מולקולרי המבטיח כי חלבונים בגודל 180 kDa ומעלה נמצאים בחלק העליון של הממברנה.
  11. השתמשו בחלק העליון הזה לאישור נוסף של סוג הסיב.
  12. השתמש בחלק מתחת 180 kDa כדי לזהות חלבוני מטרה שונים.
  13. בחלק העליון של הממברנה, בצע את סעיף 4.1 עם נוגדן משניים MHCIIx ראשוני ועכבר אימונוגלובולין M (IgM) HRP.
  14. הסירו את הממברנה (כמתואר בסעיפים 4.2.1 ו-4.2.2) לפני חזרה על התהליך עם MHCIIa IgG ראשוני ונוגדן משני מסוג IgG HRP בעכבר.
  15. הפשיטו פעם נוספת ולבסוף מרחו נוגדן משני מסוג MHCI IgM ראשוני ועכבר מסוג IgM HRP.
    הערה: שלב זה הוא איכותי ולכן כל אובדן חלבון עקב הפשטת הממברנה אינו מהווה דאגה.
  16. השוו את האות שזוהה בין איזופורמים שונים של MHC (כפי שניתן לראות באיור 5B). כאשר עוצמת האות מזוהה ברמות בינוניות עד רוויות במדגם הצפוי (MHCI - סוג I, MHCIIa - סוג II ו- MHCIIx - סוג IIx), הדגימות הספציפיות לסוג הסיב יירשמו כאמינות לשימוש במחקרים עתידיים.
  17. רשום את הדגימה כבלתי אמינה כאשר יותר מאיזופורם MHC אחד מזוהה באותה מידה בדגימה.
    אזהרה: תמיסת משפר נוגדנים מכילה נתרן הידרוקסידי 50%. עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודות
מאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע על כך שלא נאספו סיבים. התוצאות של כתם נקודה ספציפי זה היו זיהוי של 22 סיבים מסוג II, 7 סיבים מסוג I ו-3 סיבים פוטנציאליים מסוג IIx; 2 דגימות לא מזוהות ו-6 דגימות סווג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אוסף סיבים
בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ולאחר ביצוע שני מפגשי תרגול (~50 סיבים בכל מפגש) כדי להשיג סטנדרט סביר. כל הסיבים שנאספים עוברים MyDoBID כדי לזהות את סוג הסיבים, מה שיגלה עד כמה הטכניקה מבוצעת בצורה יעילה. זה ייראה כמספר נמוך של אות MHC 'ללא סיבים' או 'חלש'...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

הנוגדנים נגד MHC I (A4.840) ו- MHCIIa (A4.74) ששימשו במחקר זה פותחו על ידי ד"ר H. M. Blau והנוגדן נגד MHCIIx (6H1) פותח על ידי ד"ר C. A. Lucas והתקבל מבנק Hybridoma למחקרים התפתחותיים (DSHB), הודות לחסות המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה (איווה סיטי, IA). אנו מודים לוויקטוריה ל. ויקסמה על שסיפקה את דגימות השריר האנושי למחקר זה. רוב התמונות באיור 1 נלקחו מ-BioRender.com.

מימון:
מחקר זה לא זכה למימון חיצוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x מאגר דנטורינגהכינו לפי המתכוןניתן להשיג את המרכיבים מסיגמא-אולדריץ' או מחברות אחרות להפצת כימיקלים  מאגר דנטורציה 1x מיוצר על ידי דילול מאגר דנטורציה 3x 1 ב-3 v/v עם 1X Tris-HCl (pH 6.8). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3x מאגר דנטורינגלהכין לפי המתכוןניתן להשיג את המרכיבים מ-Sigma-Aldrich או ממפיצים כימיים אחרים3x מאגר דנטורציה מכיל: 0.125M Tris-HCI, 10% גליצרול, 4% SDS, 4 M אוריאה, 10% 2-מרקפטו-אתנול ו-0.001% ברומופנול כחול, pH 6.8.  יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
ניתן להשיג 95% אתנולN/A100% אתנול מכל חברהמדולל ל-95% עם H2O טהור במיוחד.
אקטין ארנב נוגדן רב-שבטיSigma-Aldrich  A2066יש לדלל 1 ל-1,000 עם מאגר BSA.
סולמות אנליטייםמטלר טולדומספר דגם: MSZ042101
משפר נוגדניםתרמו פישר סיינטיפיק32110שם המוצר הוא Miser Antibody Extender Solution NC.
(100 מ"ל)N/AN/A
צנטריפוגה ספסליתEppendorf5452שם הדגם: מיני ספין.
מאגר חוסם: 5% חלב דל שומן במאגר הכביסה.תעודהקנתה
מאגר BSA: 1% BSA/PBST, 0.02% NaN3BSA: Sigma-Aldrich                          PBS: מעבדות ביו-ראד. NaN3 : Sigma-Aldrich BSA: A6003-25G                                                10x PBS: 1610780                                            NaN3: S2002אלבומין בסרום בקר (BSA), תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ונתרן אזיד (NaN3). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
ידית פתיחת קלטת מעבדות ביו-ראד4560000משמש לפתיחת קלטות הג'ל הטרומיות.
Chemidoc MP Imager מעבדות ביו-ראדמספר דגם: מכסה מנוע אוניברסלי IIIכל מערכת הדמיה עם יכולות הדמיית ג'ל ללא כתמים.
Criterion BlotterBio-Rad Laboratories1704070כולל חבילת קרח, מגש העברה, רולר, 2 מחזיקי קלטות, נייר פילטר, רפידות קצף ומכסה עם כבלים.
תא קריטריון (ביו-רד)מעבדות ביו-ראד1656001
ECL (כימילומינסנציה משופרת)מעבדות ביו-ראד1705062שם המוצר: מצע ECL Clarity Max Western.
חוצץ אלקטרופורזה 1x Tris Glycine SDS (TGS)Bio-Rad Laboratories1610772לדלל 10x TGS 1 מתוך 10 עם H2O טהור במיוחד.
נייר סינון, עובי 0.34 מ"מWhatmann3030917גודל בתפזורת 3 מ"מ, אריזה של 100 גיליונות, 315 x 335 מ"מ.
מלקחיים לכריתת רקמות עדינותDumontF6521-1EAJeweller' מלקחיים מס' 5.
מגש/מכסה/מגש פלסטיק שטוח   N/AN/Aגדול מספיק כדי להניח עליו את הממברנה. ודא שהמשטח שטוח לחלוטין.
מערכת ייבוש בהקפאהLabconco7750030Freezone 4.5 L עם שלב דגימת תא זכוכית.
מקפיא -80 oC N/AN/Aכל מקפיא עם טמפרטורה קבועה של -80 מעלות; C מתאים.
משחררי ג'ל1653320Bio-Radהחליקו מתחת לממברנה כדי לאסוף או להזיז את הממברנה.
עיפרון עופרת אפורN/AN/A
  תוכנת מעבדת תדמית Bio-Rad LaboratoriesN/AFigures מתייחס לגרסת התוכנה 5.2.1 אך ניתן להשתמש בגרסאות אחרות.
חממתמעבדות ביו-ראד1660521כל חממה שניתן להגדיר ל-37 מעלות; C יספיק.
מנורהN/AN/A
בוחש מגנטי עם פרעושיםN/AN/A
רולר ממברנה מעבדות ביו-ראד1651279בחבילת הטרנספר. עם זאת, אם מוצר זה אינו זמין, כל צינור גלילי עם משטח חלק ארוך מספיק כדי להתגלגל על הממברנה יספיק.
צינורות מיקרוצנטריפוגה  (0.6 מ"ל)N/A N/A
עכבר IgG HRP משניתרמו פישר מדעי31430עיזים נגד עכבר IgG (H+L), RRID AB_228341. לדלל ב-1 ל-20,000 במאגר חסימה.
עכבר IgM HRP משניAbcamab97230עז נגד עכבר IgM בשרשרת. השתמש באותו דילול כמו IgG של העכבר.
נוגדן ראשוני Myosin Heavy Chain I (MHCI)DSHBA4.840 טווח דילול: 1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.
נוגדן ראשוני Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa)DSHBA4.74 טווח דילול: 1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.
ראשוני של Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx):1 ל-200 עד 1 ל-500 במאגר BSA.
ממברנת ניטרוצלולוזה 0.45 ומיקרו; מ מעבדות ביו-ראד1620115לכתמים מערביים.
מכסה צלחת פטריN/AN/A
פינצטה מפלסטיקN/AN/A
חבילת כוח מעבדות ביו-ראד164-5050שם המוצר: ספק כוח בסיסי.
סולם חלבוןThermo Fisher Scientific26616PageRuler סולם חלבון צבוע מראש, 10 עד 180 kDa.
קרום PVDF 0.2 ומיקרו; mמעבדות ביו-ראד1620177
ארנב HRP משניתרמו פישר מדעי31460עיזים נגד ארנב IgG (H+L), RRID AB_228341. דילול זהה לנוגדנים משניים של עכברים.
נדנדהN / AN / A
סרגלN / A/
מספרייםN / A/
סטריאומיקרוסקופמוטיקSMZ-168
מאגר הפשטהThermo Fisher Scientific21059שם המוצר: שחזר מאגר הפשטת כתם מערבי.
רקמות (ללא מוך)קימברלי-קלארק מקצועית34120שם המוצר: Kimwipe.
חוצץ העברה (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% מתנול)TG: Bio-Rad Laboratories    מתנול: מאגר TG של Merck: 1610771                    מתנול: 1.06018מדלל 10x TG buffer עם H2O טהור במיוחד ל-1x. הוסף 100% מתנול לריכוז סופי של 20% מתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מגש העברהמעבדות ביו-ראד1704089
  ג'ל טרומי להפעלת UVBio-Rad Laboratories5678085סוג ג'ל: 4– 15% ג'ל חלבון ללא כתמים Criterion TGX, 26 בארות, 15 µL.
מערבולתN/AN/A
מאגר שטיפה (1x TBST)10x TBS: אסטרל סיינטיפיק  טווין 20: סיגמא  מתכון BIOA0027-4L1x TBST: 10x תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) מדוללת ל-1x עם H2O טהור במיוחד, Tween 20 מתווסף לריכוז סופי של 0.1%. אחסן את המאגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מיכלי כביסה שחנותSistemaקנתהכל מיכל טאפרוור, שמתאים למידות המשוערות של הממברנה יספיק.
חנות ניתן לרכוש את טווח דילול N A N A

מקורות

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273(2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סיבי שריר שלדשרשרת כבדה של מיוזיןדוט בלוטינגסיבים מסוג Iסיבים מסוג IIסיבים מסוג IIxווסטרן בלוטינגSDS-PAGEבידוד סיבי שריר
זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.