Method Article

הערכת צריכת חמצן מיטוכונדריאלית באמצעות מבחן פלואורסצנטי מבוסס קורא צלחות

DOI:

10.3791/65760

⸱

April 12th, 2024

 ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Biology Department, Elon University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת צריכת החמצן מספקת מידע אינטגרלי על תפקוד המיטוכונדריה. באמצעות בדיקה זרחנית עם קורא לוחות פלורסנט, ניתן להשיג נתונים מדויקים וניתנים לשחזור בקלות ללא ציוד מיוחד. בדיקה זו מאפשרת לכל מעבדה למדוד את צריכת החמצן של מיטוכונדריה מבודדת ולחשב יחסי בקרת נשימה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה משרתת פונקציות חשובות רבות, כולל נשימה תאית, ייצור ATP, שליטה באפופטוזיס ופועלת כמוקד מרכזי של מסלולים מטבוליים. לכן, הערכה ניסויית של תפקוד המיטוכונדריה יכולה לספק תובנה לגבי הבדלים בין אוכלוסיות שונות או מצבי מחלה. בנוסף, חשוב להעריך אם מיטוכונדריה מבודדת בריאה מספיק כדי להמשיך בניסויים. מאפיין אחד המשמש לעתים קרובות להשוואת תפקוד המיטוכונדריה בדגימות שונות הוא קצב צריכת החמצן. צריכת חמצן וחישוב יחס הבקרה הנשימתית בתאים שלמים או במיטוכונדריה המבודדת מרקמה יכולים לשרת את כל שלוש המטרות. באמצעות מיטוכונדריה שבודדה מכבד של לטאות מברשת בשילוב עם בדיקה זרחנית הרגישה לתנודות בריכוז החמצן של תמיסה, מדדנו את צריכת החמצן באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. שיטה זו היא לא רק מהירה ויעילה אלא גם יכולה להתבצע עם כמות קטנה של מיטוכונדריה וללא צורך בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלב אחר שלב המתואר כאן מגביר את הנגישות של הערכה תפקודית מיטוכונדריאלית לחוקרים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים, בערך בגודל של חיידקים, הנמצאים בתאים אוקריוטיים. הם אברונים ייחודיים מכיוון שהם מכילים DNA ויש להם שני ממברנות, חיצונית ופנימית. הממברנות החיצוניות והפנימיות של המיטוכונדריה מופרדות על ידי חלל בין-ממברני, והממברנה הפנימית מתקפלת למבנים הנקראים קריסטה סביב התא הפנימי ביותר, הנקרא מטריצה. קריסטות אלה מגדילות את שטח הפנים של הממברנה הפנימית כך שמספר תהליכים המשתמשים בקריסטה יכולים להתרחש בו זמנית. בעוד שהמיטוכונדריה מעורבים בתפקודים תאיים רבים כגון שליטה באפופטוזיס ושיכון מסלולים מטבוליים מרובים, תפקידם החיוני בייצור ATP חיוני להישרדות התאים. למעשה, 90% מהאנרגיה של התא מופקת ממיטוכונדריה1. ייצור ATP כרוך ביצירת הבדל אלקטרוכימי על פני הממברנות החיצוניות והפנימיות, המכונה פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (Δψ), הנוצר כאשר יוני H+ נשאבים מהמטריצה לחלל הבין-ממברני. ייצור ATP נרתם בסופו של דבר במהלך חמצון של שווי ערך מפחיתים באמצעות תנועת אלקטרונים דרך שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (ETC). מקבל האלקטרונים הסופי הוא חמצן מולקולרי (O2). כאשר חמצן נצרך, הפרש ריכוז H+ מצטבר למקסימום שלו, ובשלב זה יוני H+ נעים במורד שיפוע הריכוז שלהם מהחלל הבין-ממברני למטריצה על ידי מעבר דרך קומפלקס סינתאז ה-ATP. התנועה של יוני H+ גורמת לשינוי קונפורמציה בסינתאז ATP, ו-ADP מובא בסמיכות לפוספט אנאורגני כדי להגיב וליצור ATP. לבסוף, ATP מועבר מהמטריצה המיטוכונדריאלית לציטוזול וניתן לאחסן אותו או להשתמש בו כדי להקל על תגובות בשל הכמות הגדולה של אנרגיה חופשית המשתחררת במהלך הידרוליזה של הפוספטים שלו. כל התהליך הזה נקרא זרחון חמצוני, ומכיוון שצורכים חמצן, אומרים שהמיטוכונדריה נושמים2.

ההצטברות והחוזק של Δψ, כמות ה-O2 המופחתת (המכונה צריכת חמצן), כמו גם יצירת ATP יכולים לשמש כאינדיקציות לבריאות התאים. ניתן לכמת מחקרים פונקציונליים מיטוכונדריאלים, כגון מדידת Δψ, תכולת ATP וייצור כולל, וצריכת חמצן בשיטות ביוכימיות מסורתיות או פלואורסצנטיות וזוהר במבחנים מבוססי צלחת. לדוגמה, ניתן להשוות את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות שונות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים כגון טטרמתילרודמין אתיל אסטר, הנקשר במיוחד למיטוכונדריה. ניתן לנטר את יצירת ה-ATP על ידי הוספת חלבון זוהר לתגובה שהשינויים בה קשורים לריכוז ה-ATP. כימות שיעורי צריכת החמצן, או שיעורי הנשימה המוחלטים, במהלך OXPHOS, יכול לעזור להבהיר את הגורמים לפערים בתפקוד המיטוכונדריה ובחילוף החומרים האנרגטי. ניתן להשתמש בהערכת צריכת חמצן לחישוב יחסי בקרת נשימה (RCR). ערכי RCR מתארים את היכולת של המיטוכונדריה לייצר ATP בתגובה לזרם ה-ADP, שהוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. ערכי RCR מסמלים את המצב הכללי של מיטוכונדריה מבודדת ומאפשרים השוואה של תגובות לטיפולים ניסיוניים שונים. הבדלים בערכי RCR עשויים לייצג תפקוד לקוי של המיטוכונדריה או להצביע על הבדל ביולוגי בין מיטוכונדריות שונות המבודדות משני מקורות או יותר. מדד חשוב נוסף לתפקוד במיטוכונדריה מבודדת הוא יעילות המיטוכונדריה המוגדרת כשומות של ATP המסונתזות לכל שומות של O2, או יחס P/O3.

בהתחשב בכמות המידע שניתן לאסוף ממדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים ומקרים שונים שבהם ניתן להשתמש במידע זה, היכולת לאסוף ביעילות נתונים פונקציונליים יכולה להיות שימושית בתחומי מחקר רבים ושונים. מדידות צריכת חמצן במיטוכונדריה מבוצעות במשך עשרות שנים עם מכשור ספציפי מאוד - באמצעות אלקטרודת קלארק, שיכולה להיות מוגבלת על ידי גודל המדגם הדרוש לביצוע מדידות, ולאחרונה, מכשירים מתוחכמים שיכולים למדוד נשימה מיטוכונדריאלית ופרמטרים רבים אחרים אך יכולים להיות חסכוניים. פרוטוקול זה הוא גישה חלופית מותאמת המשתמשת בבדיקה זרחנית רגישה לחמצן (MitoXpress)4,5. אות הבדיקה מזוהה עם קורא צלחות במצב פלואורסצנטי שנפתר בזמן למדידות רציפות לאורך זמן. לזרחן יש הפרש אנרגיה גדול יותר בין הפוטון הנספג והנפלט בהשוואה לפלואורסצנציה ולכן הוא מתאים יותר לניטור רציף של שינויים באות. זה מאפשר כמעט לכל מעבדה לבצע את המדידות הללו, לא רק לאלה שמתמקדות במטבוליזם של המיטוכונדריה או שיכולות להרשות לעצמן ציוד מיוחד ביותר. מערכת המודל שאנו משתמשים בה היא מיטוכונדריה מבודדת משלוש לטאות עצים, שני מיני הורים ואחד מוחדר (מכיל DNA גרעיני ממין הורה אחד ומיטוכונדריה מהשני - הכלאות). לטאות אלה נבחרו מכיוון ששיערנו שיש השלכות מטבוליות ואנרגטיות על יצורים כלאיים בעלי מקורות DNA גרעיניים ומיטוכונדריאלים שונים. השתמשנו בערכת בדיקה זמינה מסחרית עם קורא צלחות רב-מצבי שיכול להגדיל את הגישה לסוג זה של בדיקה לחוקרים ותחומי מחקר נוספים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לטאות הומתו על ידי חנקCO2 ואחריו עריפת ראש מיידית בהתאם למדיניות שהותוותה על ידי המשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אילון.

1. בידוד מיטוכונדריה6

הערה: שמור על כל התמיסות קרות (טבלה 1) ודגימות על קרח לאורך שלבים אלה.

  1. הסר את הכבד, שקול אותו ולאחר מכן שטוף אותו עם ~3 מ"ל של מי מלח עם פוספט קר כקרח (1x, -/-).
  2. טוחנים את הכבד ב-1 מ"ל של L-MIB בעזרת סכין גילוח טרי.
  3. הביאו את הנפח הכולל של הרקמה בתוספת L-MIB ל-2 מ"ל ושיבשו מכנית את תאי הכבד למשך ארבעה מעברים עם הומוגנייזר Dounce.
  4. סובב את ההומוגנאט בחום של 300 × גרם (37 מעלות צלזיוס, 10 דקות).
  5. העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור טרי והניחו אותו על קרח.
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של L-MIB, הומוגניזציה וסובבו שוב ב-300 × גרם (37 מעלות צלזיוס, 10 דקות).
  7. שלבו את הסופרנטנטים הן מהספינים והן מהצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 × גרם (37 מעלות צלזיוס, 10 דקות).
  8. השעו מחדש את הגלולה ב~0.350 מ"ל של L-MIB.
  9. קבע את כמות החלבון הכוללת (מ"ג מיטוכונדריה/מ"ל של L-MIB) לשימוש כקירוב לתכולת המיטוכונדריה 4,5,6.

2. צריכת חמצן

  1. מחממים מראש את כל התמיסות המשמשות (טבלה 1) בשלבים הבאים ל-30 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. יש לדלל את המיטוכונדריה ב-LEB ל-6 מ"ג/מ"ל על סמך תוצאות בדיקת ריכוז החלבון בשלב 1.9.
  3. הגדר את הבדיקה בצלחת תחתונה שקופה סטרילית עם קיר שחור של 96 בארות (טבלה 2).
    1. הוסף 50 מיקרוליטר מהדגימה (מאגר L-EB או דגימת מיטוכונדריה) לבארות המתאימות.
    2. יש להוסיף 50 מיקרוליטר של טיפול (L-EB, גלוטמט/מלאט או גלוטמט/מלאט עם ADP).
    3. יש לדלל את מלאי הגשושית ביחס של 1:10 ב-L-EB ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של הגשושית הפלואורסצנטית לכל באר.
    4. הוסף בעדינות 50 מיקרוליטר שמן מינרלי כבד לכל באר כדי לא לכלול חמצן סביבתי.
  4. קרא מדידות פלואורסצנטיות מתחתית הצלחת בעירור/פליטה של 380/650 ננומטר כל 1.5 דקה למשך 45 דקות. השתמש באופן קינטי עם עיכוב זמן של 30,000 μs וחלון מדידה של 100 μs.

3. ניתוח נתונים

  1. ייצא את קובץ הנתונים הגולמיים ממחשב קורא הלוחות כקובץ .xls.
  2. פתח את הקובץ, ולאחר מכן העתק והדבק את הנתונים הגולמיים בכרטיסייה חדשה, וסמן את השורות והעמודות בהתאם.
  3. התווה את מאגר L-EB בלבד לדגימת הבקרה ו-L-EB + G/M כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU) לעומת זמן.
    הערה: קווים אלה צריכים להיות שטוחים יחסית מכיוון שאין מיטוכונדריה, ולכן אין לזהות שינוי בריכוז החמצן.
  4. שרטט את ערכי הדגימה L-EB + G/M כ-RFU לעומת זמן.
  5. קבע היכן הקריאות הופכות לעקביות יותר ושטח עבור הפקדים.
    הערה: זה המקום שבו צריך להתחיל ניתוח נתונים עבור דגימות ניסוי (מסומן בחצים באיור 1A). התגובות יכולות לקחת 10-15 דקות להשתטח ולהגיע למקסימום.
  6. צור תרשים חדש המכיל את הנתונים רק לאחר נקודת הזמן שנקבעה בשלב 3.5 (נקרא נתונים "חתוכים") והוסף את הקו המתאים ביותר כדי להמחיש את הנתונים הגולמיים שיש לנתח.
  7. חשב את ערך ה-RFU הממוצע של נתוני מאגר הבקרה החתוכים בלבד (מודגש בצהוב). ערך זה משמש כערך ה-RFU המינימלי כקו הבסיס בחישוב החמצן שלהלן.
  8. חישוב קצב צריכת החמצן (μM O2/min)
    1. העתק והדבק את האזור הליניארי של הנתונים הגולמיים משלב 3.6 (כלומר, הנתונים החתוכים) כדי לקבוע את ריכוז החמצן בדגימות המיטוכונדריאליות בטיפול G/M + ADP בכל נקודת זמן 7,8,9,10.
    2. השתמש במשוואה (1)5 כדי לקבוע את ריכוז החמצן בכל נקודת זמן. [O2]a הוא ריכוז החמצן במאגר רווי אוויר (235 מ"מ ב-30 מעלות צלזיוס). I(t), Ia ו-Io הם האות הפלואורסצנטי של הדגימה + הגשושית בזמן t (למשל, דגימה + G/M + ADP), האות הממוצע של הגשושית במאגר רווי אוויר המחושב בשלב 3.7, והאות המקסימלי במאגר לא מחומצן (מוגדר באות המקסימלי שניתן להשיג), בהתאמה.
      figure-protocol-1(1)
    3. התווה את ערכי [O2]t המחושבים בשלב 3.8.2 לעומת זמן והוסף קו מגמה ליניארי יחד עם המשוואה של הקו המתאים ביותר.
      הערה: השתמש בשיפוע של כל קו כקצב צריכת החמצן. ניתן לצבור כפילויות או משולשות עבור כל מדגם ולהשתמש בהם להשוואת קצב הצריכה.
  9. חשב את ה-RCR על ידי חלוקת הנשימה המיטוכונדריאלית עם ובלי ADP, המייצגים מצבים 3 ו-2, בהתאמה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קצב צריכת החמצן וה-RCR המיטוכונדריאלי נקבעו מהמיטוכונדריה של שלוש לטאות שונות באמצעות ערכת בדיקה עם בדיקה חישת חמצן זרחנית וקורא לוחות פלואורסצנטי סטנדרטי. מחקרים קודמים קבעו כי הבדיקה בערכה זו קשורה ישירות לצריכת חמצן, כאשר הזרחן מרווה על ידי חמצן מולקולרי והאות הפלואורסצנטי עולה ככל שרמות החמצן יורדות עקב נשימה מיטוכונדריאלית 7,11. ערכי RFU נרשמים לאורך זמן הן עבור דגימות בקרה והן עבור דגימות ניסיוניות ולאחר מכן מנותחים. קריאות ה-RFU עבור בארות בקרה (חיץ בלבד, מאגר שטופל בגלוטמט/מלאט ומאגר שטופל בגלוטמט/מלאט + ADP) תווו כנגד הזמן כדי לקבוע שכל שינוי בקרינה בבארות מדגם ניסיוניות נובע מנוכחות מיטוכונדריה. יתר על כן, בקרת הגלוטמט/מלאט + ADP מאפשרת את כמות החמצן הבסיסית במהלך איסוף הנתונים. דגימות ניסוי המכילות מיטוכונדריה מבודדות שורטטו גם הן על אותו גרף כמו הביקורת.

איור 1A מדגים כי RFUs גדלים עם הזמן ממדגם של מיטוכונדריה מבודדת, בניגוד לערכי ה-RFU השטוחים יחסית של הבקרות. מכיוון שלוקח זמן לתגובות להתאזן, 10 הקריאות הראשונות בערך, עד שקריאות מדגם הבקרה אינן רועשות ומתאזנות, מוסרות ממערך הנתונים (טבלה משלימה S1 ואיור משלים S1). לאחר מכן, הערכים הנותרים מדגימת המיטוכונדריה שטופלה בגלוטמט/מלאט + ADP הופכים לריכוז החמצן בכל נקודת זמן באמצעות משוואה (1) (ראה שלב פרוטוקול 3.2) ולאחר מכן משורטטים מול הזמן. איור 1B מציג את התוצאה של מדגם הניסוי שנראה באיור 1A (צלבים) כאשר ערך R2 קרוב מאוד ל-1 וניתן לחשב את שיפוע הקו. שיפוע הקו שלילי מכיוון שככל שצורכים חמצן, ריכוז החמצן הכולל באותה דגימה יורד. אותו תהליך חוזר על עצמו עבור אותן דגימות מיטוכונדריאליות שטופלו בגלוטמט/מלאט ללא ADP כדי לקבל שיעורי צריכת חמצן (טבלה משלימה S2 ואיור משלים S2). לאחר מכן, ניתן להשתמש בנשימה מיטוכונדריאלית עם ובלי ADP, המייצגים מצבים 3 ו-2, בהתאמה, כדי לחשב את ה-RCR עבור כל סוג דגימה (איור משלים S2). בהשוואה זו לצד זו, ה-RCR הממוצע בין שלושת הסוגים השונים של לטאות עצים מצביע על כך שה-RCR של הכלאה עם מיטוכונדריה מוכנמת נמוך משמעותית מזה של כל אחד מסוגי ההורים (איור 1C). למיטוכונדריה של לטאה היברידית היו שיעורי צריכת חמצן בינוניים לשני סוגי ההורים (איור 2).

figure-results-1
איור 1: תוצאות בדיקת צריכת חמצן לדוגמה. (A) נתונים גולמיים מתגובות ותגובות בקרה של בופר בלבד, כולל מיטוכונדריה מבודדת שטופלה בגלוטמט ומלאט, עם או בלי תוספת של ADP. הקרינה נוטרה לאורך זמן. ככל שצורכים חמצן, הקרינה עולה. תגובות חוצץ בלבד (G/M, מסומן על ידי עיגולים, ו-G/M + ADP, מסומן על ידי משולשים) ומיטוכונדריה עם טיפול G/M (מסומן על ידי ריבועים) לא הראו שינוי. מיטוכונדריה שטופלה ב-G/M + ADP (מסומן בסימני פלוס) צרכה חמצן. (B) שינויים בריכוז החמצן לאורך זמן המחושבים מהנתונים הגולמיים של מיטוכונדריה שטופלו ב-G/M + ADP שהוצגו ב-A. (C) ערכי RCR עבור מיטוכונדריה משלושה סוגים שונים של לטאות שנמדדו בטמפרטורת החדר. איור זה שוחזר מהנל ודל גאיזו מור12. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVAs בקיצורי R. G=גלוטמט; M = מלאט; RCR = יחס בקרת נשימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שיעורי צריכת החמצן של מיטוכונדריה משלושה סוגים של לטאות. תרשימי קופסה מציגים את שיעורי צריכת החמצן החציוניים כסרגל ואמצעי כנקודה. סוגי ההורים, Urosaurus graciosus ו-Urosaurus ornatus, היו שונים באופן משמעותי זה מזה. הצורה המופנמת (היברידית) הייתה בינונית לסוגי ההורים ולא שונה באופן משמעותי מאף אחד מהם. איור זה שוחזר מהנל ודל גאיזו מור12. קיצורים: Ug = Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: מפת לוחות לבדיקת צריכת חמצן. עבור כל דגימה, יש להפריש לפחות 6 בארות (3 בארות בקרה: L-EB בלבד, L-EB עם טיפול G/M, L-EB עם טיפול G/M + ADP; 3 בארות/דגימה ניסיוניות: מיטוכונדריה עם טיפול L-EB, L-EB + G/M וטיפול L-EB G/M +ADP). במידת האפשר, הפעל כל דגימת ניסוי בכפול או משולש. קיצורים: G = גלוטמט; M = מלאט; L-EB = מאגר ניסיוני ספציפי ללטאה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

איור משלים S1: תרשימי נתונים. (A) תרשים של כל הנתונים הגולמיים להשוואה של דגימות ובקרות. (B) תרשים של הנתונים הגולמיים השוליים מהעמודות המודגשות בטבלה משלימה S1, המדגים שרק בבארות שהכילו דגימות של מיטוכונדריה הייתה עלייה ניכרת ב-RFUs. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S2: צריכת חמצן ויחסי בקרת נשימה. (A) תרשים של נתוני צריכת החמצן מטבלה משלימה S1 כדי לקבוע את ערכי מצב 2 ומצב 3 על ידי מציאת המשוואות של הקווים המתאימים ביותר. (ב) חישוב יחס RCR באמצעות שיפועי הקווים ב- (A), המייצגים את מצב 2 ומצב 3. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S1: דוגמה מייצגת לנתונים גולמיים. עמודות מודגשות הן נתונים המשמשים לאיורים ולחישובים (כלומר, נתונים חתוכים). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S2: דוגמה מייצגת של נתונים חתוכים וחישובי צריכת חמצן לאחר מכן. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת תפקוד המיטוכונדריה שימושית כאשר משווים דגימות שונות, כגון מצבי מחלה לעומת מצבים שאינם מחלה, סוגי רקמות שונים מאותה חיה או בין סוגי דגימות שונים. השתמשנו בהשוואה המאוחרת יותר כדי לבחון את ההשערה שלנו שיש השלכה מטבולית ללטאות עצים היברידיות שהכניסו מיטוכונדריה. ישנן מגוון דרכים לברר את תפקוד המיטוכונדריה באופן ניסיוני, כולל כימות של Δψ, תכולת ה-ATP הכוללת, ייצור ATP ובקרת נשימה וקצב צריכת החמצן. מדידות צריכת חמצן של מיטוכונדריה מבודדות יכולות להתבצע עם ציוד מיוחד כגון אלקטרודת קלארק או סוסון הים XFs המתוחכמים יותר. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות מגבילות על ידי גודל המדגם הדרוש לביצוע מדידות או עלות. קוראי צלחות מרובי מצבים שיכולים לקרוא פלואורסצנטיות הפכו לציוד סטנדרטי במעבדות ביולוגיה וביוכימיה של התא. לפיכך, גישה חלופית לניתוח כמותי של צריכת החמצן המיטוכונדריאלית היא שימוש בערכה זמינה מסחרית עם קורא לוחות פלורסנט. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מתאר כיצד למדוד את צריכת החמצן וכן לבצע את החישובים. ומבחינה כלכלית במיטוכונדריה מבודדת. מדידה מדויקת של יכולת המיטוכונדריה לייצר ATP כאשר היא מסופקת עם ADP, המכונה נשימה במצב 3, מאפשרת השוואה ישירה של OXPHOS בין דגימות והבדלים יכולים להצביע על פערים תפקודיים. יתר על כן, נשימה במצב 3 מצביעה גם על איכות המיטוכונדריה שבודדו, מה שיכול לקבוע אם הליך בידוד עבד ו/או הדגימה טובה מספיק כדי לשמש בבדיקות אחרות. ערכי RCR, המחושבים באמצעות מצב 2 (גלוטמט ומלאט, לבניית ערכי Δψ) ומצב 3 (גלוטמט ומלאט, בתוספת ADP, כדי לאפשר שימוש ב-Δψ לייצור ATP), נותנים פיסת מידע נוספת להשוואה ולבריאות המיטוכונדריה המבודדת. הנתונים המוצגים מדגימים כי השיטה המוצעת במאמר זה יכולה לסייע בפענוח וריאציות בין סוגי דגימות שונים ולמדוד את שיעורי צריכת החמצן וערכי ה-RCR ללא צורך בציוד מיוחד ביותר, ובכך להפוך את סוגי המדידה הללו לנגישים יותר.

בפרוטוקול זה, בודדנו לאחרונה מיטוכונדריה מלטאות, וצריכת החמצן נקבעה באמצעות בדיקת MitoXpress Xtra Hs בהתאם לפרוטוקול היצרן ושונתה על פי Hynes et al.4 ו-Will et al.5 לטאות נעו בין 3.3 גרם ל-5.1 גרם במסת הגוף הכוללת עם ממוצע של 0.170 גרם של רקמת כבד/לטאה, שהניב ~0.350 מ"ל של מיטוכונדריה מרוכזת וגולמית. המיטוכונדריה המבודדת שימשה בבדיקת צריכת החמצן בחלבון של 6 מ"ג/מ"ל. אם ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי, כפי שנקבע בשלב פרוטוקול 1.7, נמוך, ניתן לסובב מחדש את הדגימה ב-10,000 × גרם ולהשעות את הגלולה מחדש בנפח קטן יותר של L-MIB. יש לציין גם שהשתמשנו בהצלחה ב-4 מ"ג/מ"ל בלבד עבור דגימות כבד קטנות או כאשר כל הכבד לא היה זמין.

כדי להבטיח איזון גז וטמפרטורה של דגימות בתחילת הבדיקה, יש לחמם מראש את כל התמיסות המשמשות בסעיף פרוטוקול 2 ל-30 מעלות צלזיוס באמבט מים. בסעיף פרוטוקול 3, שיעורי השינוי של חמצן מומס (מ"מ/דקה) משוערים מהשיפועים הראשוניים של פרופילי ריכוז החמצן הפוחתים עבור כל דגימה (שלב פרוטוקול 3.3; טבלה משלימה S1 ואיור משלים S1). שיעורי הטיפול במדגם + G/M מייצגים נשימה מיטוכונדריאלית במצב 2, ואילו המדגם עם שיעורי הטיפול ב-G/M + ADP מייצג נשימה מיטוכונדריאלית במצב 3. לפיכך, RCRs מחושבים עבור כל דגימה על ידי חלוקת ערכי מצב 3 בערכי מצב 2 עבור כל דגימה (טבלה משלימה S2).

ניתן להשוות את צריכת החמצן בין דגימות ייחודיות כפי שמודגם כאן או בין טיפולים שונים בדגימה אחת. במקרה האחרון, ייתכן שיהיה צורך בבקרות נוספות, כגון בקרה ברכב בלבד עם ובלי מיטוכונדריה, כדי לשלול את האפשרות שהטיפול הכימי עצמו אינו מקיים אינטראקציה עם הגשושית הזרחנית. יתר על כן, ניתן להשתמש בצריכת חמצן ובנתוני RCR שנאספו בשילוב עם נתונים שנאספו מאותן דגימות עם בדיקות אחרות. לאחר בידוד המיטוכונדריה, ניתן להשתמש בהם בבדיקות מרובות כדי לספק תמונה מלאה יותר של תפקודם12. מדידת Δψ, תכולת ה-ATP הכוללת ושיעור תחלופת ה-ATP הם חלק מהבדיקות ששולבו. יתר על כן, השימוש במעכבי סינתאז ETC, OXPHOS ו-ATP עם הבדיקות נותן הבנה מלאה עוד יותר של סוגי דגימות מיטוכונדריאליות שונות, ומחזק את כל המסקנות הנובעות מהנתונים שנוצרו.

פרמטר נוסף שניתן למדוד במיטוכונדריה מבודדת הוא יעילות המיטוכונדריה, המוגדרת כיחס ה-P/O של שומות של ATP המסונתזות לכל מול של O23. ניתן לחשב יחסי P/O בהרחבה של פרוטוקול זה על ידי מתן אפשרות למיטוכונדריה במצב 3 למצות את ה-ADP המסופק בתגובה ולאחר מכן הוספת אליקוט של מצע ADP ואחריו עיכוב של סינתאז ה-ATP על ידי הוספת אוליגומיצין. שלבים נוספים אלה מאפשרים לחשב את מצב 4, המתרחש כאשר המיטוכונדריה ממשיכה לצרוך חמצן ולשמור על Δψ חזק כדי לייצר ATP מקסימלי, מספק מידע על דליפת המיטוכונדריה (אם יוני H+ חוצים בחזרה למטריצה ללא שימוש בסינתאז ATP ולכן מתפזרים Δψ), מה שבסופו של דבר מעיד על תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. יתר על כן, מדידות מצב 4 יכולות גם לגלות אם טרנסלוקטור ADP/ATP, המעביר ATP חדש שנוצר מהמטריצה ובמקביל מכניס מצע ADP פנימה, מתפקד ואם מתרחשת דליפה כלשהי של ADP ו-ATP על פני הממברנות. תוספת של אוליגומיצין, המעכב ATP סינתאז, היא בקרה כדי לקבוע אם המיטוכונדריה דולפת עקב תפקוד לקוי בפועל. בעוד שמדידת מצב 4 כך שניתן יהיה לחשב את יחס ה-P/O הייתה מעבר להיקף המידע שחיפשנו להשוואה בין שלושת סוגי הדגימות המיטוכונדריאליות, זהו נתון נוסף על תפקוד המיטוכונדריה וניתן לעשות זאת כהרחבה של פרוטוקול זה. לבסוף, ראוי לציין כי ניתן לבודד מיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות שונות מעכבר או חולדה (למשל, כבד, לב, חוט שדרה) בין היתר. ייתכן שיהיה צורך בהתאמות לפורמולציות MIB ו-EB כמו גם לפרוטוקולי הבידוד 4,13,14,15,16. יתר על כן, על פי הוראות היצרן, בדיקה זו יכולה להתבצע עם תאים שלמים ושלמים. לכן, השיטה המוצגת אינה מוגבלת ללטאות או למיטוכונדריה בכבד, מה שמאפשר לה להתאים למגוון רחב של מודלים ניסיוניים על פני תת-תחומים מדעיים רבים ושונים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי NSF CHE-1229562 (VDGM) ומענקים מוועדת המחקר והפיתוח של הפקולטה של אוניברסיטת אילון (VDGM ו-GH) ותוכנית המחקר לתואר ראשון (AJ).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
לוחות תחתונים שחורים/אופטיים 96 בארותThermo Fisher265301לוחות קיר שחורים לא מטופלים עם תחתית שקופה.
ADPSigmaA2754מדלל 100 ומיקרו; מלאי M עם EB מיד לפני השימוש.
BSAThermo FisherBP1600-100הכינו מלאי של 2 מ"ג/מ"ל במים לבדיקת חלבון.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)SigmaD8537ודא שה-PBS הוא ללא יוני Mg2+ או Ca2+.
EGTASigmaE3889
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
L-חומצה גלוטמיתSigmaG1251
L-חומצה גלוטמית מלח אשלגןSigmaS372226
L-חומצה מאליתSigmaM8304
חומצה מאלית מלח מונו-אשלגןSigma49601
ערכת צריכת חמצן MitoXpressAgilentMX-200-4מכילה מלאי בדיקה ושמן מינרלי HS.
MOPSSigmaM3183
Protien Assay Dye (5x)BioRad500-0006כל בדיקת חלבון יכולה להחליף.
גרסת R 3.3 R Core Development Team 2016
Thermomax microplate reader EnSpire Multi-mode קורא צלחות ותוכנהPerkinElmerקורא צלחות פלואורסצנטי סטנדרטי
בסיס Trisma SigmaT6066ניתן להשתמש בכל גרסה של בסיס Tris
ערכת .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drew, B., Leeuwenburgh, C. Method for measuring ATP production in isolated mitochondria: ATP production in brain and liver mitochondria of Fischer-344 rats with age and caloric restriction. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative andComparative Physiology. 285 (5), R1259-R1267 (2003).
  2. Ballard, J. W. O., Pichaud, N. Mitochondrial DNA: more than an evolutionary bystander. Functional Ecology. 28 (1), 218-231 (2014).
  3. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 437 (3), 575-575 (2011).
  4. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  5. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences. 92 (1), 186-200 (2006).
  6. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), 52076(2015).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle, and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  8. Dunn, D. A., Pinkert, C. A. Nuclear expression of a mitochondrial DNA gene: mitochondrial targeting of allotopically expressed mutant ATP6 in transgenic mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-7 (2012).
  9. Irwin, R. W., et al. Medroxyprogesterone acetate antagonizes estrogen up-regulation of brain mitochondrial function. Endocrinology. 152 (2), 556-567 (2011).
  10. Ma, D., et al. Cancer cell mitochondria targeting by pancratistatin analogs is dependent on functional complex II and III. Scientific Reports. 7 (1), 42957(2017).
  11. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
  12. Haenel, G. J., Del Gaizo Moore, V. Functional divergence of mitochondria and coevolution of genomes: cool mitochondria in hot Llzards. Physiological and Biochemical Zoology. 91 (5), 1068-1081 (2018).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1 G93A mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  14. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. Journal of Clinical Investigation. 117 (1), 112-121 (2007).
  15. Chonghaile, T. N., et al. Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science. 334 (6059), 1129-1133 (2011).
  16. Del Gaizo, V., MacKenzie, J. A., Payne, R. M. Targeting proteins to mitochondria using TAT. Molecular Genetics and Metabolism. 80 (1-2), 170-180 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/65760

Tags

Mitochondrial Oxygen ConsumptionFluorescent AssayPlate ReaderMitochondrial FunctionOxygen Consumption RateRespiratory Control RatioIsolated MitochondriaCellular RespirationPhosphorescent ProbeATP Production
Video Coming Soon

Related Articles