Method Article

טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

DOI:

10.3791/65766

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי1. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת 2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן לה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC

  1. הכינו תוסף N2.
    1. בתנאים לא סטריליים, הכינו את תמיסות המלאי הבאות (שלב 1.1.1.1) במכסה אדים בטיחותי כימי. מוסיפים את האבקה המוצקה של כל כימיקל לצינור חרוטי במשקל 50 מ"ל במשקל מראש. שקלו כל צינורית לאחר הוספת האבקה והוסיפו כמות מתאימה של ממס כדי להשיג את הריכוזים הבאים. עבור אצווה אחת של מדיה, הכן את הסכום המינימלי הרשום.
      הערה: הריאגנטים הבאים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מקומיות. ודא PPE תקין בעת הטיפול, ועבוד רק עם צורות האבקה המוצקה של כימיקלים אלה במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה.
      1. מינימום של 0.05 מ"ל נתרן סלניט במים ב 0.518 מ"ג / מ"ל, 0.5 מ"ל של putrescine במים ב 160 מ"ג / מ"ל, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה הפוכה מסתמכת במקום זאת על כך שקומפלקס הדנ"א מגיב יפגוש את התאים בזמן השעיה של תא יחיד. הבדל זה יכול להיות מכריע במיוחד במצבים שבהם תאים אינם גדלים כחד-שכבה אחידה ושטוחה ובמקום זאת מאמצים מורפולוגיה בעלת כיפה או מושבה יותר, כמו במקרה של.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, מכיוון שריאגנטים הזמינים מסחרית אינם מתאימים לכולם והם ישתנו ביעילות של כדאיות אספקת NA בין סוגי תאים. בנוסף, מציאת הכמות האידיאלית של NA ומגיב טרנספקציה, כמו גם היחס האופטימלי ביניהם, דורשת בדיקה. לעתים קרובות, ביצוע צעדי אופטימיזציה המו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות על התרומות הרבות לתחום שלא צוינו בעבודה זו בשל מגבלות מקום, כמו גם על סוכנויות המימון שסיפקו הזדמנות זו. המחברים מודים על מימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ומהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), שתמכו בעבודה זו. ק.מ. זכה במלגת CGS-M מטעם NSERC ובמלגת קילאם לדוקטורט מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. נ.ס. זכה בפרס Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אקוטאז MilliporeSigmaSCR005
אפוטנספרין תוסף תזונה MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 תרמו-פישר סיינטיפיק 
בטא-מרקפטואתנולThermoFisher Scientific 
שבר BSA V (7.5%)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
חרוזי סטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימהSpherotechURCP-38-2K
ג'לטין תוסף MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX תרמו-פישר סיינטיפיק 
אינסולין גיבקו12585-0014
ליפופקטמין 2000 Invitrogen11668-019מגיב טרנספקציה
מדיה נוירובזאליתThermoFisher Scientific 
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
פרוגסטרוןMilliporeSigmaP8783סכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש, ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במכסה אדים כימי
PutrescineMilliporeSigmaP6780סכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במכסה אדים
כימיmLIF רקומביננטי BioTechne8878-LF-500/CF
נתרן סלניט MilliporeSigmaS5261-25Gסכנה כימית - התייעץ עם הנחיות הבטיחות המקומיות, ודא שציוד הגנה אישי מתאים נלבש, ועבוד עם צורת האבקה המוצקה רק במנדף אדים כימי
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific 
1750404421985023350500612110304925200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reverse Poly TransfectionMouse Embryonic Stem CellsNucleic Acid RatiosPlasmid DeliveryTransient TransfectionGene DosageFlow CytometryPluripotent Stem CellsDNA StoichiometryLipofectamine Transfection

Related Articles