מאמר שיטה

בידוד, תרבית ואפיון תאי גזע במוך השן משיני אדם נשירים וקבועים

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65767

⸱

17 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה שם דגש על מיצוי, תרבית ושימור של תאי גזע רב-פוטנטיים ממוך השן באמצעות עיכול אנזימטי. בנוסף, הוא מדגים את הפוטנציאל שלהם להתמיין לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים, ומדגיש את חשיבות הדיוק והעקביות בתהליך.

תקציר

בתחום הרפואה הרגנרטיבית והיישומים הטיפוליים, מחקר תאי גזע צובר תאוצה במהירות. תאי גזע ממוך השן (DPSCs), הנמצאים הן בשיניים נשירות והן בשיניים קבועות, התגלו כמקור תאי גזע חיוני בשל נגישותם, יכולת ההסתגלות שלהם ויכולות ההתמיינות המולדת שלהם. DPSCs מציעים מאגר זמין ושופע של תאי גזע מזנכימליים, המציגים רב-תכליתיות ופוטנציאל מרשימים, במיוחד למטרות רגנרטיביות. למרות הבטחתם, המשוכה העיקרית טמונה בבידוד ואפיון יעיל של DPSCs, בהתחשב בייצוגם כשבריר זעיר בתוך תאי מוך השן. חיוני לא פחות הוא שימור נאות של משאב סלולרי יקר ערך זה. שתי השיטות העיקריות לבידוד DPSC הן עיכול אנזימטי (ED) וצמיחה מצמחי רקמות (OG), המכונה לעתים קרובות צמיחה ספונטנית. פרוטוקול זה מתרכז בעיקר בגישת העיכול האנזימטי לבידוד DPSC, ומפרט באופן מורכב את השלבים הכוללים מיצוי, עיבוד במעבדה ושימור תאים. מעבר למיצוי ושימור, הפרוטוקול מתעמק ביכולת ההתמיינות של DPSCs. באופן ספציפי, הוא מתאר את ההליכים המשמשים כדי לגרום לתאי גזע אלה להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, ומציג את התכונות הרב-עוצמתיות שלהם. שימוש עוקב בטכניקות צביעה קולורימטרית מאפשר הדמיה מדויקת ואישור של בידול מוצלח, ובכך לאמת את האיכות והפונקציונליות של DPSCs מבודדים. פרוטוקול מקיף זה מתפקד כתוכנית המקיפה את כל הספקטרום של מיצוי תאי גזע במוך השן, טיפוח, שימור ואפיון. הוא מדגיש את הפוטנציאל המשמעותי הגלום ב- DPSCs, מניע קדימה חקר תאי גזע וטומן בחובו הבטחה לפריצות דרך רגנרטיביות וטיפוליות עתידיות.

מבוא

מחקר תאי גזע פרח במדע הביו-רפואי בשל היישומים המבטיחים שלו ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת רקמות. תאי גזע של מוך השן (DPSCs), שמקורם ברקמת מוך השן של שיניים נשירות וקבועות אנושיות, משכו עניין רב כמקור לתאי גזע בשל זמינותם המוכנה ויכולתם הרב-פוטנטית 1,2. לתאים אלה יש פוטנציאל להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, כפי שאושר במחקרים רבים3.

במהלך העשורים האחרונים, המחקר והיישומים הטיפוליים של תאי גזע זינקו. הפוטנציאל הרחב של תאי גזע מחייב גיוון המקורות מהם הם מתקבלים. מספר גורמים משפיעים על היעילות, הכדאיות והגבעול של תאים נבחרים. למרות קיומם של מאגרים ידועים שונים של תאי גזע, כגון מח עצם ורקמות שומן, ההליכים הפולשניים, תחלואה באתר וחששות אתיים הקשורים למקורות אלה מגבילים לעתים קרובות את חקירתם 4,5. בין מקורות תאי הגזע השונים, תאי גזע דנטליים זכו לתשומת לב בשל נגישותם הקלה, פלסטיות גבוהה ויישומים פוטנציאליים מגוונים. תאי גזע אנושיים של מוך השן, בפרט, נחקרו בהרחבה עבור הסיכויים הטיפוליים שלהם6. שיניים, שבדרך כלל מושלכות כפסולת רפואית, מכילות שפע של תאי גזע מזנכימליים7. שמירה על מאגר תאי גזע יקר ערך זה דורשת מאמצים קולקטיביים מצד מטופלים, רופאי שיניים ורופאים כדי להבטיח שמשאבים אלה לא יבוזבזו, מה שהופך כל תא גזע במוך השן לזמין לדרישות התחדשות עתידיות.

תאי גזע שמקורם במוך השן, כגון תאי גזע אנושיים בוגרים של מוך השן (DPSCs) ותאי גזע משיניים נשירות אנושיות (SHED), ממוקמים בנישה הפרי-וסקולרית של מוך השן. תאים אלה הם האמינו שמקורם בתאי פסגה עצבית גולגולתית ומציגים סמנים מוקדמים הן עבור תאי גזע מזנכימליים (MSC) והן עבור תאי גזע נוירואקטודרמליים. DPSCs ו- SHEDs הוכיחו רב-עוצמה ויכולת לחדש סוגי רקמות מגוונים8.

מקורות פוטנציאליים של תאי גזע דנטליים כוללים שיניים בריאות, נשירות וקבועות. תאי גזע מהווים רק כ-1% מכלל אוכלוסיית התאים במוך השן, מה שמדגיש את החשיבות של טכניקות בידוד והתפשטות יעילות9. כתוצאה מכך, מיצוי והרחבה של תאי גזע אלה הם שלבים מרכזיים בבידוד DPSC10. שיניים שנעקרו או עברו קילוף צריכות להיות מאוחסנות באמצעי הובלה עשיר בחומרים מזינים, כגון מלוחים חוצצי פוספט (PBS) או תמיסת מלח חוצצת הנקס (HBSS).

השגת מוך השן יכולה להיות מושגת בשיטות שונות, המותנות בסוג השן 7,11. עבור שיניים נשירות עם שורשים נספגים, ניתן לבצע עקירה דרך קודקוד השורש. באופן דומה, ניתן להשתמש במוך דוקרני סטרילי כדי להשיג מוך שיניים קבועות עם קודקוד פתוח לא בוגר. במקרים של שיניים קבועות עם שורשים מפותחים, הגישה לחדר מוך השן כרוכה בהפרדת כתר השיניים מהשורש. זה מושג על ידי חיתוך השן באמצעות דיסק יהלום בצומת צמנטואמייל. חתך זה חושף את תא מוך השן ומאפשר שליפה של רקמת מוך השן 12,13,14.

תאי גזע של מוך השן (DPSCs) יכולים להיות מבודדים באמצעות עיכול אנזימטי (ED) או צמיחה מצמחי רקמות (OG), הידוע גם בשם צמיחה ספונטנית. שיטת ED משתמשת באנזימים, בעיקר collagenase I ו- dispase, כדי לפרק את הרקמה לתרחיפים חד-תאיים15,16. שיטת OG, פשוטה ומהירה יותר, כרוכה בחיתוך שברי עיסת השן והנחתם ישירות לתוך צלחת תרבית, המאפשרת לתאים לצמוח מצמחי הרקמה17. חוקרים השתמשו והשוו את שתי הטכניקות כדי להעריך את קצב התפשטות התאים, שימור תכונות תאי גזע מבודדים, התמיינות וביטוי סמנים על פני השטח18. הקמה וסטנדרטיזציה של פרוטוקולים לרכישת DPSCs עם יעילות גבוהה וגזע יכולים לסלול את הדרך לטיפולים יעילים ובטוחים19. פרוטוקול זה כולל חילוץ DPSCs באמצעות עיכול אנזימטי, עיבוד מעבדה, שימור והתמיינות תאים עם צביעה קולורימטרית עבור אדיפוגנזה, אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב, החל מהבידוד הראשוני של מוך השן מהשן, לאחר מכן תרבית ותחזוקה של DPSCs במעבדה, וכלה באפיון שלהם באמצעות סמנים ספציפיים של תאי גזע (איור 1). כמו כן מתוארות הטכניקות לגרימת תאי גזע אלה לשושלות תאים שונות, תוך הדגשת הרב-עוצמה שלהם.

פרוטוקול

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את הנחיות ועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). השימוש בשיניים שנעקרו נעשה על פי סטנדרטים אתיים כדי להבטיח את שלמותם, כבודם וזכויותיהם של המשתתפים. המשתתפים שנבחרו למחקר זה היו אנשים בריאים מתחת לגיל 30 שנזקקו לעקירת שן לצורך טיפול אורתודונטי. אלו עם עששת נרחבת או דלקת חניכיים חמורה לא נכללו במחקר. שיניים נשירות נאספו מילדים שנזקקו לעקירת שיניים שמורים. הסכמה מדעת בכתב התקבלה גם מהנבדקים המעורבים במחקר זה.

1. עקירה והובלה של שיניים

  1. אוסף שיניים נשירות וקבועות
    1. הסבירו למשתתפים את מטרת ההליך ואת השימוש האפשרי בשיניים שנעקרו למטרות מחקר.
    2. ביצוע עקירת שיניים בהרדמה מקומית על ידי מתן חומר הרדמה בקרבת השן לעקירה. באופן ספציפי, 1.75 מ"ל של לידוקאין מעורבב עם אפינפרין (ראה טבלה של חומרים) ביחס של 1:200,000 הוזרק עבור מחקר זה. בחירת שיניים שאינן מציגות עששת חמורה או דלקת חניכיים עדיפה20,21.
  2. הובלת השיניים שנעקרו
    הערה: מומלץ לעבוד בתנאים אספטיים כדי למנוע זיהום. זה כולל לבישת ציוד מגן אישי, כגון כפפות ומעיל מעבדה, ועבודה בסביבה סטרילית, כגון מכסה מנוע זרימה למינרית מסוכנת ביולוגית.
    1. לאחר עקירת השן, שטפו אותה בתמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS) כדי להסיר את הדם ופסולת אחרת. בעזרת מלקחיים סטריליים ואזמל, הסירו בזהירות את שאריות הרקמה הרכה המחוברת מפני השטח של השן (איור 2A).
    2. לטבול את השן בתמיסת חיטוי, כגון אתנול 70%, במשך 10 שניות. לאחר החיטוי, שטפו את השן עם PBS סטרילי כדי לשטוף את שאריות חומר החיטוי.
    3. מניחים את השן במיכל סטרילי המכיל את אמצעי ההובלה.
      הערה: אמצעי ההובלה כלל את Alpha-MEM, מדיום תרבית מסחרית בתוספת אנטיביוטיקה: 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים). מדיום זה סיפק חומרים מזינים חיוניים לתאים בתוך השן שנעקרה, והבטיח את הישרדותם עד לעיבוד מעבדה. האנטיביוטיקות שימשו לעיכוב צמיחת חיידקים.
    4. שמור על טמפרטורה של 4 ° C במהלך ההובלה כדי להאט את הפעילות המטבולית התאית ולעכב מוות תאי. העבירו את השן למעבדה לשלבים הבאים, כולל עיבוד ובידוד תאי הגזע של מוך השן.

2. איסוף רקמת מוך השן

  1. אבטחו את השן באמצעות מלקחיים דנטליים כדי להבטיח שהיא תישאר במקומה במהלך ההליך. השתמשו בדיסק יהלום כדי לחתוך את השן בידית דנטלית (ראו טבלת חומרים) שמחוברת לנוזל קירור מים (איור 2B).
    הערה: המטרה היא לחשוף את תא מוך השן מבלי לגרום נזק מיותר לרקמת מוך השן שבתוכו.
  2. השתמש במחפר שיניים (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר את רקמת מוך השן. מכשיר זה מאפשר הוצאת מוך השן מבלי לגרום נזק, ובכך משמר את יכולת הקיום של תאי הגזע של מוך השן (איור 2C).
  3. מניחים את הרקמה המתקבלת על צלחת פטרי זכוכית. לשטוף את רקמת מוך השן עם מלוחים חוצץ פוספט.

3. עיכול רקמת עיסת השן ובידוד תאים

  1. טחינת רקמות ועיכול
    1. בעזרת להב כירורגי סטרילי, טחנו בזהירות את רקמת מוך השן למקטעים קטנים (איור 2D) והניחו אותה במטחנת רקמות קטנה עם PBS כדי לקבל תערובת הומוגנית דקה. תהליך זה מגדיל את שטח הפנים של הרקמה, ומקל על פעולת אנזים יעילה יותר במהלך העיכול.
    2. מעבירים את מקטעי הרקמה ההומוגנית הטחונה לתוך צינור של 15 מ"ל ומעכלים אנזימטית באמצעות תערובת של 3 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג I ו-4 מ"ג/מ"ל דיספאס (ראו טבלת חומרים). אנזימים אלה הומסו בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להשיג את הריכוזים הרצויים.
    3. לדגור על רקמת מוך השן בתערובת האנזימים (שלב 3.1.2) במשך כשעתיים בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה, נטרלו את האנזימים, ואספו את התאים בצנטריפוגה (שלב 3.2.1) לתרבית נוספת.
  2. צנטריפוגה ומתלים
    1. לאחר הדגירה, מעבירים את הרקמה המעוכלת לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומסתובבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים. שלב זה מפריד את התאים מחלקי הרקמה והאנזימים הלא מעוכלים הנותרים. יש להשליך בזהירות את התווך העל-טבעי, ולהבטיח שלא להפריע לגלולת התא בתחתית הצינור.
    2. השהה מחדש את גלולת התא במדיום תרבית טרי. מדיום זה מספק את החומרים המזינים הדרושים ואת הסביבה עבור התאים המבודדים לשרוד ולהתרבות.

4. תרבית תאים

  1. ציפוי ודגירה של תאים
    1. מעבירים בזהירות את התאים המרחפים לצלוחית תרבית בגודל 25 סמ"ר.
      הערה: כל החומר מעיסה אחת מועבר לצלוחית אחת של25 ס"מ 2 תרבית תאים. נפח מדיה של 5-7 מ"ל מבטיח כיסוי מספיק וזמינות תזונתית עבור התאים. ודא שאמצעי התרבית עבור DPSCs הוא מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%-20% (ראה טבלת חומרים) כדי לספק גורמי גדילה נחוצים. יתר על כן, להשלים את המדיום עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום חיידקי. ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה לאורך הבקבוק כדי לקדם צמיחה הומוגנית.
    2. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C באטמוספירה המכילה 5% CO2.
  2. שינוי בינוני ומעקב אחר מפגש
    1. שנה את מדיום התרבית כל 2-3 ימים כדי לספק חומרים מזינים טריים ולהסיר פסולת מטבולית. כדי לעשות זאת, בזהירות לשאוף את המדיום הישן באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית ולהחליף אותו עם מדיום טרי.
    2. עקוב באופן קבוע אחר תרבית התאים תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר גדילת התאים ולבדוק אם יש סימני זיהום.
    3. המשיכו בתהליך זה עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הנקודה שבה התאים מכסים את רוב שטח הפנים של הבקבוק אך אינם צפופים מדי.
  3. טריפסיניזציה של תאים ומעבר או הקפאה
    1. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הסירו את מדיום התרבית ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להסיר את שאריות התווך והתאים שאינם דבקים.
    2. הוסף תמיסה של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוק כדי לנתק את התאים מפני השטח של הצלוחית. יש לדגור במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתרוממים.
    3. נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית, ולאחר מכן החזירו בעדינות את תרחיף התא למעלה ולמטה כדי להבטיח ניתוק תאים מלא.
    4. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.
    5. השהה מחדש את התאים במדיום תרבית טרי וצלחת אותם מחדש (מעבר) לצמיחה נוספת או הקפיא אותם לשימוש עתידי. בעת ההקפאה, השתמש באמצעי הקפאה המכיל הגנה קריופרוטקטיבית, כמו DMSO, כדי להגן על התאים מפני נזק במהלך ההקפאה.

5. אפיון DPSCs

  1. ניתוח ציטומטריית זרימה
    1. כדי לאשר את אופי תאי הגזע המזנכימליים של התאים המבודדים, בצע ניתוח ציטומטריית זרימה22,23. בתחילה, טריפסינזציה ואיסוף תאים כמתואר בשלב 4.3.
    2. קבע את כדאיות התא על ידי טכניקת אי הכללת צבע טריפאן. בצע את הניתוח באמצעות מנתח כדאיות התא (ראה טבלת חומרים) במהלך המעברים השניוהשמיני. בצע אנליזה פנוטיפית באמצעות ציטומטר זרימה במהלך המעבריםה-3 וה-7.
    3. לאחר הדגירה, שטפו את התאים במאגר ציטומטריית זרימה כדי להסיר נוגדנים עודפים ולנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
      הערה: מאגר ציטומטריית הזרימה מורכב ממלח חוצץ פוספט (1x PBS), 1%-2% סרום בקר עוברי (FBS), ו-0.1% נתרן אזיד (NaN3). ה- FBS או BSA חוסם את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים, בעוד שהנתרן אזיד פועל כחומר משמר. אחוז גבוה של תאים צריכים לבטא את הסמנים המזנכימליים של תאי גזע וחסרים את הסמנים ההמטופויטיים, המאשרים את זהותם כ- DPSCs24.
    4. נתקו את ה-DPSCs והכתימו אותם בנוגדנים אימונופלואורסנטיים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה.
      הערה: בחירת הסמנים לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבוססת על הקונצנזוס שנקבע על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT), הקובע כי MSCs צריכים לבטא CD105, CD73 ו- CD90, וחסרים את הביטוי של CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79a או CD19, ו- HLA Class II25. סמנים אלה משמשים בדרך כלל במחקרים החוקרים תאי גזע במוך השן26. ריכוזי הנוגדנים להכתמה יכולים להשתנות בהתאם לנוגדן הספציפי בו נעשה שימוש, ומומלץ לעקוב אחר הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לדילול נוגדנים ותנאי דגירה25.
    5. לקבוע את קריטריוני הסיווג 27,28 לביטוי סמני CD כאמור: פחות מ-10%, ללא ביטוי; בין 11% ל -40%, ביטוי נמוך; טווח של 41% עד 70%, ביטוי מתון; מעל 71%, ביטוי גבוה.
    6. בנוסף, לאשר את היעדר סמנים hematopoietic על ידי דגירה תא נפרד aliquot עם נוגדנים נגד CD34 ו CD45.

6. הבחנה בין שושלות מרובות

הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקולים להתמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית של תאי גזע דנטליים. התחל על ידי זריעת תרביות בצפיפות של 1 x 105 תאים לכל באר בצלחת תרבית רקמה מצופה פיברונקטין עם מדיום שלם (CM). עקוב אחר צמיחת התאים עד להשגת מפגש של 80%-90% לפני התחלת פרוטוקול ההתמיינות הרצוי. כדי להעריך את פוטנציאל ההתמיינות הרב-שושלתי של DPSCs, התחל את תהליך ההתמיינות כלפי אוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים על ידי זריעת תאים ללוחות של 24 בארות וטיפוחם באמצעי התמיינות מתאימים.

  1. התמיינות אוסטאוגנית
    1. התחל על ידי גידול DPSCs במדיום גידול רגיל בתנאים סטנדרטיים עד שהם מגיעים 70%-80% מפגש.
    2. הסר את מדיום הגידול מהתאים, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS. הוסף את מדיום ההתמיינות האוסטאוגני (ODM) לתאים.
      הערה: ODM מורכב אלפא מינימלי חיוני בינוני (α-MEM) בתוספת 10% FBS, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 mM בטא גליצרופוספט, ו 100 ננומטר dexamethasone (ראה טבלה של חומרים).
    3. לדגור על התאים בתווך אוסטאוגני ב 37 ° C עם 5% CO2. שנה את המדיום האוסטאוגני כל 2-3 ימים.
      הערה: לאחר 14 עד 21 יום, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי אוסטאובלסט. ניתן לאשר זאת על ידי בדיקת עלייה בביטוי של סמנים ספציפיים לאוסטאובלסט, כגון פוספטאז אלקליין, או על ידי שימוש בטכניקות צביעה כדי לזהות מטריצה מינרליזציה, כגון צביעת Alizarin Red S.
    4. תקן את התאים על ידי דגירה אותם עם אתנול 70% קר כקרח במשך 1 שעה ב -20 ° C.
    5. צבעו את התאים הקבועים בתמיסת צביעה 40 ננומטר Alizarin Red S (pH 4.2) בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10-15 דקות. דמיינו את הצביעה תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות אוסטאוגנית (איור 3). לאשר את ההבחנה על ידי צביעת התאים עם Alizarin אדום S, אשר מזהה משקעי סידן המעידים על מינרליזציה29,30.
  2. בידול אדיפוגני
    1. כפי שפורט בסעיף הקודם, DPSCs תרבית בתנאים סטנדרטיים באווירה לחה עם 5% CO2 ב 37 ° C. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החליפו את המדיום הדהוי במדיום בידול אדיפוגני. מדיום זה מורכב בדרך כלל מ- DMEM, 10% FBS, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון, 200 מיקרומטר אינדומתצין ו- 0.5 מילימטר IBMX (ראה טבלת חומרים).
    3. שנה את מדיום הבידול כל 3-4 ימים. לאחר כ-3 שבועות, שטפו את ה-DPSCs המובחנים באדיפוגנים עם PBS וקיבעו אותם עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. צבעו את התאים הקבועים עם שמן אדום O (ראו טבלת חומרים) כדי להמחיש הצטברות טיפות שומנים (איור 4). כדי לאשר עוד יותר התמיינות אדיפוגנית, בצע ניתוח ביטוי גנים של סמנים אדיפוגניים כגון peroxisome proliferator-activated receptor-activated receptor gamma (PPARγ) ו- adiponectin31,32.
  3. התמיינות כונדרוגנית
    1. תרביות DPSCs המתוחזקות באטמוספירה לחה עם 5% CO2 ב -37 מעלות צלזיוס משמשות להתמיינות כונדרוגנית. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החלף את המדיום שנשטף במדיום התמיינות כונדרוגני, המכיל בדרך כלל גלוקוז גבוה מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), 1% ITS, 100 ננומטר דקסמתזון, 50 מיקרוגרם/מ"ל אסקורבט-2-פוספט, 40 מיקרוגרם/מ"ל פרולין ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה-בטא 3 (TGF-β3) (ראה טבלת חומרים).
    3. לשמור על התאים במדיום התמיינות chondrogenic, שינוי המדיום כל 2-3 ימים. לאחר כשלושה שבועות, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי כונדרוציטים.
    4. תקן את התאים על ידי דגירה שלהם עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, צבעו את התאים בכחול אלקיאני (ראו טבלת חומרים) ודמיינו אותם תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות כונדרוגנית (איור 5).
    5. אשר את ההתמיינות של DPSCs לכונדרוציטים באמצעות טכניקות כגון צביעת Alcian Blue עבור פרוטאוגליקנים או ניתוח ביטוי גנים של סמנים כונדרוגניים כמו aggrecan, SOX9 וקולגןמסוג II 33,34.

תוצאות

הביצוע המוצלח של הפרוטוקול המתואר הניב תאי גזע של מוך השן (DPSCs) המסוגלים להתמיין בין שושלות, ולהדגים את רב-העוצמה שלהם.

מבחני כדאיות
הכדאיות של DPSCs הוערכה באמצעות בדיקת אי הכללת Trypan Blue בנקודות זמן שונות. התוצאות מראות כדאיות גבוהה באופן עקבי (יותר מ-95%) לאורך כל תקופת התרבות, מה שממחיש את החוסן של פרוטוקול הבידוד והתרבות שלנו.

מבחני יחידה יוצרת-מושבה (CFU)
בדיקות CFU נערכו כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית של DPSCs. תרחיף חד-תאי היה מצופה בצפיפות נמוכה ותורבית במשך 14 יום. המושבות שנוצרו אז הוכתמו ונספרו. התוצאות מראות מושבות רבות, המצביעות על שיעור גבוה של תאים המתחדשים מעצמם באוכלוסיית DPSC.

זמן הכפלת תאים
זמן הכפלת התאים חושב בהתבסס על עקומת הגדילה של DPSCs. התאים נזרעו בצפיפות מסוימת ונספרו באופן קבוע כדי לבנות עקומת גדילה. זמן ההכפלה חושב לאחר מכן באמצעות שלב הצמיחה המעריכית של העקומה. התוצאות מראות זמן הכפלה עקבי עם זה שדווח עבור MSCs, מה שמרמז על אוכלוסיית תאים בריאה ומתרבה (איור 6).

ניתוח ציטומטריית זרימה
ניתוח ציטומטריית הזרימה הראה שרוב גדול של DPSCs (למשל, >95%) היו חיוביים עבור CD90, CD73 ו- CD105, מה שאישר את זהותם כ- MSCs (איור 7). יתר על כן, פחות מ -2% מהתאים היו חיוביים ל- CD45, CD34 ו- HLA-DR, מה שמאשר את היעדר זיהום משמעותי בתאי המטופויאט או אנדותל.

התמיינות אוסטאוגנית
עם השלמת ההתמיינות האוסטאוגנית, התאים הציגו מטריצה מינרלית, אשר מודגמת על-ידי צביעת Alizarin Red S (איור 3). נוכחות הצבע האדום בתאים המוכתמים מצביעה על תצהיר מוצלח של מטריצה מינרליזציה, מאפיין חיוני של התמיינות אוסטאוגנית. חוסר היכולת להשיג בהצלחה צביעת בידול עשוי להיות קשור לאתגרים העומדים בפני הליך איסוף הדגימות.

בידול אדיפוגני
במהלך ההתמיינות האדיפוגנית, ה- DPSCs צברו טיפות שומנים, המעידות על אדיפוגנזה. ניתן לראות את טיפות השומנים עם צביעת שמן אדום O (איור 4). התמיינות מוצלחת הביאה לטיפות שומנים מוכתמות כתומות-אדומות בתוך התאים.

התמיינות כונדרוגנית
לבסוף, לאחר התמיינות כונדרוגנית, DPSCs ייצרו גליקוזאמינוגליקנים, מרכיב סחוס קריטי שאושר על ידי צביעת Alcian Blue, אשר נקשר לגליקוזאמינוגליקנים אלה. תאים שעברו בהצלחה כונדרוגנזה הציגו צבע כחול עם צביעתם (איור 5).

התאים שלא הצליחו להציג שינויי צבע מתאימים בהליכי הצביעה עשויים לנבוע מההתמיינות התת-אופטימלית, אולי בגלל בעיות באמצעי ההתמיינות או באיכות הראשונית של DPSCs. חשוב להבטיח את איכות המדיה והתוספים ואת הבריאות ומספר המעבר של DPSCs בשימוש. ההתמיינות המוצלחת של DPSCs לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים מאמתת את טבעם הרב-יכול של תאים אלה ומדגישה את הפוטנציאל שלהם ברפואה רגנרטיבית וביישומים טיפוליים.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של בידוד, אפיון והתמיינות של תאי גזע במוך השן. איור זה מספק ייצוג סכמטי של זרימת העבודה לבידוד, אפיון והבחנה של תאי גזע במוך השן (DPSCs). התהליך מתחיל עם עקירת השן (או השיניים), ואחריו בידוד של רקמת מוך השן, שממנו DPSCs נגזרים. לאחר הבידוד, ה-DPSCs עוברים בדיקות אפיון שונות כדי לאשר את זהות תאי הגזע שלהם ולהעריך את הכדאיות שלהם, קצב ההתרבות שלהם ותכונות מפתח אחרות. השלב הסופי המיוצג בתרשים זה כולל אינדוקציה של התמיינות, שבה DPSCs מטופלים עם גורמים ספציפיים כדי להנחות את הפיכתם לסוגי תאים מיוחדים, כגון אוסטאובלסטים, אדיפוציטים או כונדרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שליפת מוך השן משיניים שנעקרו. (A) שן שנעקרה מוכנה לעקירת רקמת מוך השן. (ב) חיתוך השן שנעקרה באמצעות בור יהלום. (ג) הוצאת רקמת מוך השן מתא מוך השן. (D) פיצול רקמת מוך השן באמצעות להב כירורגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: התמיינות אוסטאוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שנצפתה על-ידי צביעת Alizarin Red S (פי 40). הצביעה האדומה הבוהקת חושפת את התצהיר של המטריצה המינרליזציה, תכונה אופיינית של אוסטאובלסטים, המאשרת התמיינות אוסטאוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: התמיינות אדיפוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שהודגמה על-ידי צביעת שמן אדום O. נוכחותן של טיפות אדומות בוהקות מייצגת הצטברות שומנים, סימן היכר של אדיפוציטים, המאשר התמיינות אדיפוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע במוך השן (DPSCs) שהודגמה על-ידי צביעה כחולה אלסיאנית (40x). הצבע הכחול העז מציין את נוכחותה של מטריצה חוץ-תאית עשירה בפרוטאוגליקן, מאפיין של כונדרוציטים, המאשרת התמיינות כונדרוגנית מוצלחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: זמן הכפלת תאים עבור תאי גזע במוך השן (DPSCs). איור זה ממחיש את עקומת הצמיחה של DPSCs לאורך זמן. תאים נזרעו בתחילה בצפיפות מסוימת, וספירות תאים נלקחו במרווחי זמן קבועים (מיוצגים על ציר x) כדי לעקוב אחר קצב ההתפשטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: ביטוי סמן פני השטח של תאי גזע בתרבית DPSC. איור זה מדגים את הביטוי של סמני שטח ספציפיים ב- DPSCs. סמני תאי הגזע המזנכימליים CD44, CD90 ו- CD105 מראים רמות גבוהות של ביטוי, מה שמצביע על נוכחות של תכונות מזנכימליות בתאים אלה. לעומת זאת, הביטוי של סמנים המטופויטיים (CD34 ו-CD45) ומולקולת קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרית מסוג II (HLA-DR) הוא כמעט זניח, מה שמאשר את היעדרם של תאי שושלת המטופויטיים בתרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאי גזע במוך השן (DPSCs) משיניים נשירות וקבועות אנושיות. הוא כולל תיאור של אחסון והתפשטות של תאים אלה, כמו גם הערכה של פוטנציאל התמיינות החוץ גופית שלהם לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים35.

Chen et al.36 הראו כי ניתן להשיג תאי גזע של מוך השן (DPSCs) ממקורות שונים, כולל שיניים אנושיות חיוניות נגועות הסובלות ממצבים כמו דלקת חניכיים, ספיגת שורשים, פריקורוניטיס ושברים בשיניים, כמו גם שיניים סופר-מספריות ולא מיושרות. ממצא זה אושש עוד יותר על ידי מחקרים מאוחרים יותר שזיהו שיניים חיוניות נגועות כמקורות פוטנציאליים של DPSCs 37,38,39,40. עם זאת, Bernardi et al.10 הצביעו על כך שספיגת שורשים מוגברת עלולה להשפיע לרעה על יכולת הקיום של תאי גזע אלה. משוכה משמעותית בתהליך היא שימור התאים ומניעת התפרקותם, המתחילה מיד לאחר עקירת השן או קילוף. יתר על כן, חשוב לציין כי אין להשתמש בשיניים המושפעות ממצבים חמורים כגון מורסות פריאפיקליות, גידולים או ציסטות כדי לחלץ תאי גזע40,41.

DPSCs ניתן להשיג באמצעות טכניקת העיכול האנזימטי (ED) או הצמיחה משיטת צמחי רקמות (OG), הידועה גם בשם טכניקת הצמיחה הספונטנית14,15. חוקרים משתמשים באסטרטגיות אלה כדי לחקור את היעילות של התפשטות תאים או שמירה על תכונות מורפולוגיות ופנוטיפיות של תאי גזע מבודדים17. מחקרים מצאו כי תאי גזע שבודדו בשיטת OG מראים קצב התרבות איטי יותר וביטוי חלש יותר של סמני תאי גזע18. לעומת זאת, DPSCs שבודדו באמצעות שיטת ED הדגימו התפשטות מהירה יותר, התמיינות וביטוי מוגבר של סמני שטח נוספים מאלה שבודדו בשיטת OG. באופן מעניין, תאי גזע לא בשלים של מוך השן (IDPSCs) שחולצו משיניים נשירות בטכניקת OG הראו כי תרבית תאים עודדה התרבות סלקטיבית של IDPSCs, ובכך מנעה התמיינות מוקדמת42.

טיהור DPSCs חיוני להשגת תאים רגנרטיביים מאוד ודורש סמני תאים ספציפיים. בחירת תאים מתבצעת בשיטות מיון תאים פלואורסצנטיות או מגנטיות. מלבד הסמנים הנ"ל, אנטיגנים רבים אחרים פני השטח משמשים גם בשל האופי ההטרוגני של DSCs43. עם זאת, לא זוהה סמן יחיד המפריד בין תת-האוכלוסיות.

בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם, DPSCs הוכרו כמקור מבטיח לתאים רב-פוטנטיים בשל הפוטנציאל הרב-שושלת שלהם44. גבעול זה הוא ככל הנראה תוצאה של חוסר בשלות יחסית של רקמות המקור, שכן שיני בינה, לעתים קרובות המקור לעקירת DPSCs, הן השיניים הקבועות האחרונות להתפתח ולכן הן פחות בשלות ממח עצם45. פרוטוקול זה חוקר בהצלחה את האופי הרב-עוצמה של תאי גזע במוך השן על ידי גרימת תאים אלה לעבור אדיפוגנזה, אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה. יש לציין כי DPSCs הם סוג התא היחיד המווסת את ביטוי DSPP כאשר הם מתורבתים בתנאים אוסטאוגניים, דבר המעיד על התמיינותם העתידית לאודונטובלסטים46.

תאי גזע דנטליים, שבודדו ממקורות שונים, מציגים פוטנציאל ריבוי והתמיינות רבים47. הצעדים המשמעותיים שנעשו במערכות חוץ גופיות השפיעו עמוקות על הביולוגיה והטיפול של תאי גזע. למרות התקדמות זו, נותרו אתגרים בעת תרגום טיפולים בתאי גזע מספסל למיטה. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת להישרדותם ויציבותם של תאי גזע כדי להבטיח שטכניקות שימור לא יפגעו בכדאיות של תאים אלה. בעוד שמחקר תאי גזע דנטליים הניב תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים, יש צורך דחוף להרחיב ממצאים אלה לניסויים בבני אדם. על ידי המשך הנעת מחקר ופיתוח קפדניים, תאי גזע דנטליים צפויים למלא תפקיד משמעותי בקידום תחום בנקאות תאי הגזע.

בעוד שמשתמשים בה באופן נרחב, גישת העיכול האנזימטי לבידוד תאי גזע במוך השן (DPSCs) מציגה מספר מגבלות. בראש ובראשונה, התהליך עלול לפגוע ביכולת הקיום של התא, שכן אנזימים כמו collagenase ו-dispase יכולים לפגוע בשוגג בקרומי התא, ולהניב פחות תאי גזע חיים17. בנוסף, שיטה זו גורמת לעיתים קרובות לפירוק המטריצה החוץ תאית החיונית (ECM), שהיא חיונית לשימור התכונות הטבועות בתאי גזע48. ההליך עשוי גם לשנות את פני השטח של התא, ולהקשות על זיהוי ואפיון מדויקים של DPSCs43. מעבר לאילוצים ביולוגיים אלה, הגישה גוזלת זמן, ומעלה את הסיכונים לזיהום מיקרוביאלי עקב דגירות ממושכות ב -37 מעלות צלזיוס. יתר על כן, חוסר העקביות בין אצוות אנזימים יכול להוביל לתוצאות משתנות, לאתגר את יכולת השחזור של הליך הבידוד. אי אפשר להתעלם מהנטל הכספי, שכן אנזימים ברמה גבוהה המתאימים לעיכול רקמות הם יקרים49. יתר על כן, לאחר העיכול עלולה להיות פעילות אנזימים שיורית שעלולה להשפיע לרעה על תרביות תאים, להשפיע על בריאותן, שגשוגן והתמיינותן. לבסוף, הפוטנציאל של עיכול אנזימטי להעדיף תת-אוכלוסיות מסוימות של DPSC על פני אחרות עלול להטות בשוגג את מאגר התאים המתקבל, ולהשפיע על הפוטנציאל הטיפולי שלהם50.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים אסירי תודה לד"ר מתיו מז'וואנצ'ריל, מנהל וראש מרכז המחקר פושפאגירי בטירובאלה, על תמיכתו בתיעוד ההליכים במרכז המחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-איזובוטי-ל-מתיל-קסנטין סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"בI5879
חומצה אצטית סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"בAS001
אלסיאן בלו סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"בRM471
תמיסת מכתים אליזרין אדום Sסיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"בGRM894
אלקליין פוספטאז -ערכת צביעהתרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב
אלפא מינימום מדיום חיוני (&אלפא;-MEM) תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"בGibco
אלפא מדיום חיוני מינימלי (α-MEM) תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"בGibco
Alpha-MEM, או אלפא מינימום חיוני בינוניתרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"בGibco
Alpha-MEM, או אלפא מינימום חיוני בינוניתרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"בGibco
אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקהסיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USAP4333
אסקורבט-2-פוספטסיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב012-04802
בטא-גליצרופוספט סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USAG9422-10G
ארון בטיחות ביולוגית-מכסה מנוע זרימה למינאריLabconco Corporation, MO 64132-2696, ארה"ב
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 ו-HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, ארה"ב
מסננת תאים (70 ומיקרו; מ)מעבדות היימדיה  בע"מ מומבאי, הודוTCP025מסננת תאים
צנטריפוגהREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
צנטריפוגהמעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודו1101 | 1102
CO2 חממהתרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב
קולגנאז סוג Iוורת'ינגטון ביוכימיה. קורפ ניו ג'רזי 08701, ארה"ב
קולגנאז סוג Iוורת'ינגטון ביוכימיה קורפ. קורפ ניו ג'רזי 08701, ארה"ב
צמיחה מלאה בינוניתמעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודוAT006DMEM
צינורות חרוטיים (15 או 50)תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב546021P/546041P15 מ"ל ו-50 מ"ל
מיכל הקפאה קריו תרמופישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב15-350-50
תוויות קריותווית הודו:
קופסאות אחסון קריוביאליות אחסון Cryostore
CryovialsThermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב
Cryovials (1.8 מ"ל)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"בPW1282
בקבוק תרבית עצמאי (25 ס"מ²)Corning Inc.NY 14831, ארה"ב
צלוחיות תרבות מעבדותHiMedia  בע"מ, מומבאי, הודוTCG4 / TCG6T25 / T75
צלחות תרבות מעבדותHiMedia  בע"מ, מומבאי, הודוTCP129 / TCP00860 מ"מ / 100 מ"מ
דיסקי יהלומים דנטלייםKomet SC 29730, ארה"בKomet 
מחפר כפיות שינייםBrasseler, GA 31419, ארה"ב5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"בD4902-25MG
דקסמתוזוןסיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.ארה"בD4902-25MG
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics, מנהיים, גרמניה.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, מנהיים, גרמניה
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, ארה"ב
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, ארה"ב
אתנול (70%)מעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודוMB106
אתנול -70%תרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"בפישר מלקחיים
מיצוי מדעיים Dentsply Sirona, ארה"ב
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"בF2442-500ML
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"בF2442-500ML
סרום בקר עוברי (FBS)מעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודוRM9954
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"בF2442-500ML
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, ארה"בF2442-500ML
צלחת תרבית רקמות מצופה פיברונקטיןקורנינג בע"מ קורנינג, ניו יורק 14831, ארה"
ציטומטר זרימהBD Biosciences, CA 95131, ארה"ב
מאגר ציטומטריה זרימהBD Biosciences, CA 95131, ארה"ב
כיסוי זכוכית 22 x 22 מ"ממעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודוTCP017
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)קבוצת לונזה בע"מ, 4002 באזל, שוויץ
ידית שיניים במהירות גבוהה NSK בע"מ, טוקיו 8216, יפןTi-Max Z
סדרת סרום סוסתרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"ב
IBMX, או 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017, ארה"ב
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"בI5523
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)תרמו פישר מדעי, MA 02451, ארה"בI5523
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) premixCorning Incorporated, MA 01876, ארה"ב
מיקרוסקופ הפוךOlympus Corp., טוקיו 163-0914, יפן
איזופרופנול (60%)Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USAI9516
איזופרופיל אלכוהול סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USAMB063
קולט אדים זרימה למינאריתרמו פישר סיינטיפיק, MA 02451, ארה"ב
לידוקאין מעורבב עם אפינפריןDENTSPLY, NC 28277, ארה"בCitanest
חנקןנוזלי אוויר נוזלי, 75007 פריז, צרפת
מיכל אחסון חנקן נוזליCryo Scientific Systems Pvt. בע"מ
MicropipettesEppendorf AG, 22339 המבורג, גרמניה30020Accupipet-2-20 ומיקרו; L
מיני מטחנת רקמותBio-Rad Lab, Inc. CA 94547, ארה"במטחנות מיני ReadyPrep
מינוס 80 מקפיאBlue Star Limited
תא ספירת נויבאוארMarienfeld Superior, arktheidenfeld, גרמניה
שמן אדום O כתםSigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.USA1024190250
מדיום בידול אוסטאוגני (ODM) STEMCELL Technologies Inc.ונקובר, קולומביה הבריטית, V5Z 1B3, קנדה
פרפורמלדהיד (PFA) סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, MO 63103.USATCL119
פניצילין-סטרפטומיציןGibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, ארה"ב
תמיסת פוספט חוצץ (PBS) ללא Ca++ ו-Mg++HiMedia Laboratories  בע"מ מומבאי, הודוTS1101
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)תרמו פישר מדעיGibco
חוצץ פוספט (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"ב
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק, MA, ארה"בP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
פרולין Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב
להב אזמל גודל 15 סוואן-מורטון בע"מ, שפילד, S6 2BJ, בריטניהBDF-6955C
נתרן היפוכלוריטמעבדות HiMedia  בע"מ מומבאי, הודוAS1024% w / v פתרון
צינורות צנטריפוגה סטרילייםTarsons Products Pvt. בע"מ
מיכל סטרילי -20 מ"ל3M מרכז, MN 55144-1000, ארה"ב3 M
מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS)סיגמא אולדריץ', ארה"בP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
פיפטות סטריליות (2, 5 ו-10 מ"ל)Eppendorf AG, 22339 המבורג, גרמניה
פיפטות וטיפים סטרילייםEppendorf India Limited
להב כירורגי ידיתבקטון, דיקינסון ושות', ניו ג'רזי, ארה"ב371030BP ידית 3
גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא 3 (TGF-β 3)מו"פ D Systems, Inc.MN 55413, ארה"ב
גורם צמיחה טרנספורמטיבי-בטא 3 (TGF-β 3)מו"פ D Systems, Inc.MN 55413, ארה"ב
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. סנט לואיס, MO 63103.ארה"ב
טריפאן כחול 0.4% סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"בTCL046
טריפאן כחול 0.4% סיגמא-אולדריץ' ושות' סנט לואיס, מיזורי 63103.ארה"בTCL046
טריפסין-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, ארה"ב
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA
WaterBath Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USABSW-01D
קופסאות ב

מקורות

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DPSCExplant Outgrowth

מאמרים קשורים