מודל חולדות פגות לחקר כאב

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תמציתי ליצירת מודל של חולדות פגות, המאפשר מחקר על ניהול מוקדם של כאב לאחר לידה. השיטה כוללת ביצוע ניתוח קיסרי שלושה ימים לפני הלידה הצפויה, חילוץ גורי חולדות פגים באמצעות כריתת רחם, ושילובם עם צאצאים ביולוגיים של סכר פונדקאית.

תקציר

מחקר זה מתעמק בהשלכות של גירוי עקבי של דקירה על צאצאים מוקדמים כדי לברר את השלכותיו ארוכות הטווח על רגישות לכאב. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הייתה לחקור את ההשפעה של גירויי דקירה בילודים על סף הכאב בשלבים מאוחרים יותר של החיים באמצעות מודל של חולדה מוקדמת. על ידי הקמת מודל זה, אנו שואפים לקדם את המחקר על הבנה וניהול של כאב מוקדם לאחר לידה הקשור לפגות. ממצאי מחקר זה מצביעים על כך שבעוד שספי הבסיס לגירויים מכניים לא הושפעו, חלה עלייה ניכרת ברגישות יתר מכנית לאחר הזרקה מלאה של פרוינד אדג'ובנט (CFA) בחולדות בוגרות. באופן מעניין, בהשוואה לחולדות זכרים, חולדות נקבות הפגינו רגישות יתר דלקתית מוגברת. יש לציין כי התנהגות האם, משקל ההמלטות ומסלול הגדילה של הצאצאים נותרו ללא שינוי בעקבות הגירוי. הביטוי של תגובות nociceptive שונה בבגרות לאחר גירויים כואבים בילוד יכול להצביע על שינויים בעיבוד החושי ואת תפקודם של קולטנים glucocorticoid. עם זאת, יש צורך במחקר נוסף כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים המעורבים ולפתח התערבויות להשלכות של פגות וכאבי ילודים אצל מבוגרים.

מבוא

במהלך תקופת היילוד, מסלולים nociceptive לעבור הבשלה מבנית ותפקודית משמעותית, ואת נוכחותם של נזק לרקמות וכאב נלווה יש השלכות עמוקות על התפתחות עיבוד somatosensory¹.

שימוש במודלים של בעלי חיים מאפשר מניפולציה ניסויית מבוקרת של בעלי חיים לא אנושיים, ומאפשר הבנה עמוקה יותר של ההשלכות של כאב בילודים על התנהגות בשלב מאוחר יותר בחיים, תוך הפחתת משתנים מבלבלים פוטנציאליים ^2,3. תוצאה נפוצה שנצפתה היא ההשפעה של כאב בילודים על רגישות מוגברת לכאב בבגרות ^2,4,5. ביחידה לטיפול נמרץ יילודים (פגיה), כאב יילודים הוא מקור שכיח ביותר ללחץ, כאשר פגים עוברים בדרך כלל חציון של 10 הליכים פולשניים ביום⁶. יילודים מוקדמים בפגייה נתקלים במגוון גורמי לחץ, הכוללים כאב, מגע אימהי, גירויי שמיעה ותאורה מוגזמת ^7,8,9.

השימוש במודלים של בעלי חיים חיוני לקידום הבנתנו את המנגנונים הבסיסיים המעורבים בתהליכים אלה ולקידום התפתחויות חדשות בתחום זה. בפרט, שימוש במודלים של פגים במחקרים יכול לתרום רבות להרחבת גוף הידע על פגים ולספק תובנות חשובות לגבי התערבויות לניהול כאב עבור פגים¹⁰.

נכון לעכשיו, ישנם מספר מוגבל של מודלים מכרסמים המתייחסים באופן ספציפי לפגות, כאשר רוב המחקרים הללו חוקרים בעיקר את ההשפעות של פגות על המוח¹¹, התפתחות ריאות¹², enterocolitis נמק¹³, או מחקרים תזונתיים חיסוניים¹⁴. עם זאת, אף אחד מהמודלים הללו אינו בוחן את הבשלת מערכת הכאב, שהיא פגיעה במיוחד במקרים של פגות.

לידה מוקדמת והשלכותיה על ניהול מוקדם של כאב לאחר לידה נותרו תחומי מחקר חיוניים. לכן, העבודה הנוכחית ביקשה לתרום לספרות על ידי ביסוס מודל חולדות פגות. מודל זה מספק תובנות לגבי ההשפעה של גירויי דקירה בילוד על סף הכאב בשלבים מאוחרים יותר של החיים, ומשפר את הבנתנו לגבי כאב הקשור לפגות.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי עקבו אחר המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שאומץ על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הפדרלית של אלפנס (פרוטוקול 32/2016).

1. בעלי חיים

1. השג חולדות זכרים בוגרים ונקבות וויסטאר (גיל שמונה שבועות בקירוב) ממתקן החיות המרכזי של האוניברסיטה הפדרלית של אלפנס.
2. אכנו את החולדות בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים באור של 12:12 שעות: מחזור חשוך והאכילו אותן בצ'או ובמים אד ליביטום , בפקולטה לפיזיותרפיה במתקני בעלי חיים (האוניברסיטה הפדרלית של אלפנס).

2. בדיקת הריון

1. במשך חודש, כל בוקר בין השעות 8:00-9:00 בבוקר, מעבירים כל כלוב בעלי חיים לחדר הניסויים. כדי לבצע שטיפה בנרתיק, הכניסו בזהירות פיפטה מפלסטיק המכילה 10 μL של תמיסת NaCl 0.9% לנרתיק החולדה. יש להקפיד על החדרה רדודה כדי למנוע חדירה עמוקה, ולאחר מכן לסגת בעדינות כדי לאסוף הפרשות מהנרתיק.
2. הניחו את נוזל הנרתיק שנאסף על שקופיות זכוכית בודדות, והקצו שקופית נפרדת לכל כלוב של בעלי חיים.
   1. השג טיפה אחת של חומר לא מוכתם מכל חולדה באמצעות קצה פיפטה נקי. בחנו את החומר תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשות אובייקטיביות 10x ו-40x, ללא שימוש בעדשת המעבה.
   2. זהה שלושה סוגי תאים נפרדים על פי המאפיינים שלהם: תאי אפיתל עגולים וגרעיניים, תאים קרניים לא סדירים ללא גרעין, ולויקוציטים קטנים ועגולים¹⁵.
3. חשוף נקבות חולדות וויסטאר עם קרטיניזציה אינטנסיבית והרס נרתיקי, האופייניים למחזור הייחום ומצביעים על פתיחות גברית מוגברת, להזדווגות. הזדווגו עם החולדות על ידי הצבת 2 נקבות וזכר אחד בכל כלוב. לקבוע יום הריון 0 על ידי בדיקת נוכחות של תאי זרע ותאי שלב הייחום במריחות הנרתיק.

3. סיווג וניהול סכרים בהריון וצאצאיהם

1. השליכו שלושה סוגים של סכרים בהריון (2 סכרים כל אחד) בהתבסס על שלב ההריון שלהם: סכרים מוקדמים, סכרים תקופתיים וסכרים חלופיים. אפשרו לסכרים ההריוניים ללדת באופן טבעי ביום ה-22 של ההיריון, והשתמשו בהמלטות שלהם עבור קבוצת המונחים.
2. ביום ה -19 של ההריון, לבצע ניתוח קיסרי על סכרים הריון מוקדם, אשר 3 ימים לפני תאריך הלידה הצפוי שלהם. נצלו את ההמלטות הללו לקבוצת הפגים. בהתחשב בכך שהליך זה אינו תורם להישרדות האם, הפקידו את הגורים המוקדמים בסכרים פונדקאיים, אשר ילדו באופן טבעי יומיים לפני הניתוח הקיסרי של הסכרים המוקדמים.
3. החזיקו את הגורים של הסכר הפונדקאי איתה למשך כמה שעות, ואפשרו לריחות שלהם להתערבב עם ההמלטות של הפגים. לאחר תקופה זו, הציגו את ההמלטות המוקדמות והוציאו את הגורים המקוריים של הפונדקאית, ולאחר מכן הקריבו אותם בשאיפת איזופלורן במינונים גבוהים.
   הערה: צעד זה חיוני כדי להבטיח שהסכרים הפונדקאיות כבר עוררו את ייצור החלב בבלוטות החלב שלהם, ומציבים אותם להניק ביעילות את הגורים¹⁶ בטרם עת.

4. ניתוח קיסרי

1. הרדימו חלקית את הסכרים ההרות המוקדמות עם 2% איזופלורן והרדימו אותם 3 ימים לפני מועד הלידה הצפוי באמצעות פריקת צוואר הרחם. לאחר המתת חסד, לחלץ את הצאצאים אחד אחד באמצעות כריתת רחם.
2. בצע חתך של 3 ס"מ בקו האמצע של הבטן התחתונה, ואחריו חתך אורכי של 2 ס"מ. בצע חתך לאורך הגבול antimesenteric בחלק האמצעי של כל צינור הרחם חתכים אלה.
3. לחלץ בעדינות גורי חולדות ושליה באמצעות כריתת רחם^17,18. לחלץ את הצאצאים אחד אחד מיד.

5. טיפול לאחר הניתוח והכנת גורים לאימוץ

1. השתמש בהליך האימוץ כדי למנוע מהאם המנותחת להפגין התנהגות בלתי הולמת עקב ההליך הכירורגי וכאב פוטנציאלי, אשר עלול להשפיע על התנהגותם הבוגרת של הגורים.
2. נקו את דרכי הנשימה של גורי החולדות באמצעות מגבות נייר לאחר ההמלטה. נקו את גורי החולדות על ידי אמבטיה למניעת קניבליזם על ידי סכרים חלופיים. שטפו את גורי החולדות במים בטמפרטורה של 28°C וייבשו אותם.
3. הסירו כל עקבות דם והניחו את הגורים בצלחות פטרי תחת תאורת אינפרא אדום מחוממת, תוך שמירה על טמפרטורה של כ -28 מעלות צלזיוס עד שנשימתם הופכת סדירה.
4. חתכו את חבל הטבור שלהם ממש מתחת לשליה והשתמשו בכותנה ספוגה ב- H₂O₂ כדי לעצור כל דימום מחבל הטבור. לבסוף, הציעו אותם לאימהות האומנה לאימוץ.

6. אינטראקציה עם אם אומנת ואימוץ צאצאים מוקדמים

1. שכן כל אם אומנת עם המלטה שלה בכלובי פלסטיק נפרדים. לפני ההעברה, סמנו כל גור מונח מהיד האומנת. סימון זה חיוני לניתוחי התנהגות אימהיים הבאים. לשמור על שלמות כלובי האומנה לאורך כל תהליך האימוץ.
2. בתחילה, הניחו את הגורים הפגים מחוץ לקן. אסטרטגיה זו מאפשרת לאם הפונדקאית לזהות ולהכיר את ריחם של הגורים החדשים בטריטוריה ניטרלית. כמו כן, בחרו אחד או שניים מהגורים של האם המאמצת והניחו אותם מחוץ לקן לצד הגורים הפגים. תמהיל זה גורם לאם הפונדקאית לאסוף הן את הגורים שלה והן את הגורים המוקדמים, ובכך לקדם קבלה ושילוב של הגורים החדשים בקן שלה.
3. מערבבים את הצאצא המאמץ עם הצאצא הביולוגי בתחילה. אשר אימוץ יעיל. הוציאו את גורי האם המאמצת מהקן והקריבו אותם¹⁹.
   הערה: במחקר זה, הכדאיות של חולדות פגות הייתה 100% והן לא נדחו על ידי הסכר הפונדקאי.

7. סטנדרטיזציה של פסולת

1. שמרו על גודל המלטה של 8 גורים בכל המלטה בכל קבוצות הגורים שגודלו בפונדקאות, עם 4 זכרים ו-4 נקבות. הקריבו את חולדות הגורים הנותרות לאחר סטנדרטיזציה.

8. תכנון ניסוי ויישום פרוטוקולים

הערה: מטרת פרוטוקול זה הייתה להשיג גורי פגים בני קיימא לפיתוח הליכים ניסיוניים עוקבים.

1. השתמש בסך הכל 20 סכרים בהריון עבור ההליכים. חלקו אותם לשתי קבוצות ניסוי, שכל אחת מהן מורכבת מ-10 סכרים.
   1. לעורר את הגורים בקבוצה הראשונה, קבוצת PP, עם גירויי pinprick מ PND 2 ל PND 15.
   2. ייעדו את הקבוצה השנייה כקבוצת CC, המשמשת כקבוצת הביקורת, כאשר הגורים בקבוצה זו אינם מקבלים גירוי דקירה.
   3. עקוב אחר ההתנהגות האימהית של הסכרים ומשקל ההמלטות בחריצות לאורך תקופה זו.

9. הערכות לאחר גמילה ומבחנים התנהגותיים

1. לגמול את הצאצאים על PND 22. מיין אותם לפי מין ושכן אותם בכלובים עם קיבולת מקסימלית של 4 בעלי חיים כל אחד עד שהם מגיעים בערך 8 שבועות של גיל.
2. לאחר מכן, העבירו בעלי חיים אלה הערכות רגישות לגירויים מכאיבים באמצעות מבחן פון פריי האלקטרוני. התמקדו במיוחד בכאב הנגרם על ידי דלקת מ-CFA.
3. כדי למתן השפעות פוטנציאליות הקשורות להמלטה, בחרו חולדה אחת זכר ונקבה אחת מכל המלטה עבור כל קבוצת ניסוי כדי לעבור בדיקות התנהגותיות במהלך הבגרות.
4. השתמשו בכל חיה בניסוי יחיד כדי למנוע התערבות הורמונלית בתגובות הנוסיספטיביות של נקבות צאצאים חולדות. באופן ספציפי, ודא כי בדיקות מבוצעות על נקבות במהלך שלב diestrus של מחזור הייחום שלהם.

10. השראת כאב בילוד חוזרת

1. לגרום לכאב ילודים חוזר באמצעות טכניקת דקירה דומה לזו שתוארה במחקר קודם²⁰. התחילו גירויי דקירה יומיים עבור גורי החולדות החל מהיום השני שלאחר הלידה (PND 2) והמשיכו בתרגול זה עד PND 15.
2. הכנס בזהירות מחט 22 גרם לעומק רדוד לאזור אמצע הפלנטר של הכף האחורית הימנית.
   1. ודא כי החדירה היא בדיוק מספיק כדי לעורר מבלי לגרום נזק מיותר. כיילו את המד כדי למנוע חדירה עמוקה יותר, בהתחשב בסיכון שהוא יעבור כולו דרך הכף בגיל זה.
   2. אם מתרחש דימום, להפסיק אותו מיד באמצעות צמר גפן; בדרך כלל, התערבות זו נמשכת רק כמה שניות. מתן גירויים 4 פעמים, שמירה על פער של 2 דקות בין כל אחד, בסך הכל 8 דקירות ביום.
3. כדי למזער גורמים מבלבלים פוטנציאליים הקשורים להפרדת האם ולטיפול בילודים, הפרידו את גורי החולדות מהסכרים שלהם למשך 5 דקות לכל היותר. החל את אותו משך הפרדה על קבוצת הביקורת. לאחר כל סט גירויים, החזירו מיד את גורי החולדות לסכרים שלהם ^5,21,22.

11. הערכת התנהגויות אימהיות

1. כדי להעריך התנהגות אימהית, הערך את התנהגות הסכרים בשתי קבוצות הניסוי (n = 10 לכל קבוצה) מ- PND 2 ל- PND 15. בצעו את ההערכה בשני מפגשים: אחד בבוקר, לפני גירויי הדקירה על גורי החולדות (בין השעות 08:00-09:30), והשני אחר הצהריים, לאחר גירויי הדקירה על גורי החולדות (בין השעות 15:00-16:30).
2. במהלך מפגשים אלה, התבונן בשקידה, תעד ודרג את התנהגותה של כל אם כל 3 דקות במהלך מפגשים אלה, מה שמוביל ל -30 תצפיות בכל תקופה ביום. זה מצטבר לסך של 60 תצפיות לאם ביום.

12. רישום התנהגויות אימהיות ולא אימהיות

1. רשום פרמטרים של התנהגות אימהית הכוללים פעולות כגון טיפוח או ליקוק (על הגוף או באזור האנוגניטלי), הנקה, שמירה על גב מקושת ב"שמיכה" כמו יציבה על ידי שכיבה מעל הגורים, שכיבה פסיבית על הגב או על הצד בזמן הנקה, עיסוק בבניית קנים וטיפוח עצמי אימהי (כולל גירוי השדיים באמצעות ניקוי עצמי).
2. תעד פרמטרים של התנהגות לא אימהית, כולל פעולות כגון האכלה, חקירת דיור הכלוב, אי חקירה והיעדר טיפוח עצמי אימהי.
3. הצג את הנתונים כאחוז מסך ההתנהגות האימהית וההתנהגות הלא אימהית. חלק את מספר התצפיות המתועדות בהתנהגות המטרה במספר הכולל של התצפיות והכפל את התוצאה ב- 100 ^5,23,24.

13. הערכת משקל המלטה

1. במהלך שלב גירוי הדקירה (PND 2-15), עקוב אחר משקל ההמלטות הן בקבוצת PP והן בקבוצת CC, שכל אחת מהן כוללת 8 המלטות.
2. במהלך שלב גירוי הדקירה (PND 2-15), יש לבדוק באופן רציף את משקל ההמלטות הן בקבוצות PP והן בקבוצת CC, שכל אחת מהן מורכבת מ-8 המלטות.

14. מבחן סף מכני

1. בניסוי זה, יש לתת זריקות של מי מלח או CFA, כל אחד בנפח של 100 μL, לחולדות (בנות 8 שבועות) מקבוצות PP ו-CC. לאחר מכן, הניחו אותם בנפרד בכלובים אקריליים (42 ס"מ × 24 ס"מ × 15 ס"מ) עם רצפות רשת תיל 15-30 דקות לפני הבדיקה כדי להעריך שיכוך כאבים מכני.
2. במבחן, השראת רפלקס כיפוף כף אחורית באמצעות מתמר כוח ידני המצויד בקצה פוליפרופילן² 0.5 מ"מ (פון פריי אלקטרוני).
   1. יש למרוח בהדרגה את הקצה בין חמש כריות כף הרגל הדיסטליות של הכף האחורית הימנית, ולהגביר את הלחץ עד לצפייה בתגובה.
      הערה: כאשר מתרחשת נסיגת כפות, הגירוי נפסק באופן אוטומטי, ועוצמתו מתועדת. המבחן מסתיים בתגובת רפיון ברורה ואחריה משיכת כפות. מתן תת עורי של CFA גורם לדלקת ממושכת, שמגיעה לשיאה ב -24 שעות ונמשכת לפחות 7 ימים²⁵.
3. לערוך בדיקות על בעלי חיים לפני ו 4 שעות, 7 שעות, 10 שעות, ו 24 שעות לאחר מתן מלוחים או CFA⁴. הציגו את התוצאות במונחים של סף משיכה, הנמדד בגרמים (g), וחשבו אותו על ידי ממוצע של שלוש מדידות.
4. כדי למנוע התערבות של גורמים הורמונליים פוטנציאליים בתגובות nociceptive בקרב צאצאים נקבה, ודא שהבדיקות מבוצעות אך ורק בשלב הדיסטרוס של מחזור הייחום שלהם.

15. ניתוח נתונים

1. עבד את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי והצג אותם כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). כדי לזהות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצות, יישמו ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מדדים חוזרים ונשנים, תוך התחשבות בגורמים כגון הערכת פרמטרים אימהיים לעומת לא אימהיים והערכת משקל המלטה.
2. באופן ספציפי, לנתח PND ו pinprick גירויים עבור פרמטרים אימהיים פון פריי: CFA ו pinprick גירויים עבור הערכת משקל המלטה. בצע ניתוח פוסט-הוק באמצעות מבחן Bonferroni בעת הצורך.

תוצאות

במחקר הזה לא היו הבדלים בהתנהגות אימהית או לא אימהית בין אימהות, ללא קשר אם צאצאיהן עברו ניסויי דקירה במהלך תקופת היילוד או היו פגים או פגים (איור 1). באשר להתנהגות האימהית של אמהות מאמצות של צאצאים מוקדמים, ANOVA דו-כיווני הראה כי הייתה השפעה של PND (יום לאחר הלידה) אך לא השפעה של גירויי pinprick או כל אינטראקציה בין שני הגורמים על הערכת ההתנהגות האימהית שנצפתה בשעה 8 בבוקר. [גורם PND: F_{(13, 140)} = 6.31, p < 0.001; גורם גירוי פינדק: F_{(1, 140)} = 1.04, p = 0.30; גירו...

דיון

במחקר זה, ראינו כי התנהגויות אימהיות ולא אימהיות של אמהות לא הושפעו מניסויי דקירה בילוד. מגמה זו התרחבה גם להתנהגות לא אימהית. יתר על כן, העלייה במשקל של המלטות מוקדמות במהלך תקופת גירוי הדקירה לא הייתה שונה באופן משמעותי בין קבוצת הביקורת לבין קבוצת הדקירה. ניתוחי סף נסיגת כפות גילו ירידה ניכרת הן בגורים זכרים והן בגורים נקבות מקבוצות הדקירה וה-CFA בהשוואה לאלו מקבוצות הביקורת. בולטת במיוחד הייתה התצפית על ירידה נוספת בסף נסיגת הכפות 4 שעות לאחר הזרקת CFA בקבוצת הדקירה/CFA בהשוואה לקבוצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת NaCl 0.9%	Concare, ברזיל
כלובי אקריליק (42 ס"מ ופעמים; 24 ס"מ ופעמים; 15 ס"מ) עם רצפות רשת תיל	Insight Equipamentos, ברזיל
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,Insight	Equipamentos, ברזיל
H2O2 (מי חמצן)	ACS Cientifica, ברזיל
תאורת אינפרא אדום	Carci, ברזיל
Isoflurane (2%)	Cristá lia, ברזיל
מיקרוסקופ זקוף	ניקון, ברזיל	Ei ECLIPSE עם	עדשות אובייקטיביות 10x ו-40x

מיקרוסקופ