מערכת בדיקת דורסיפלקסיה פסיבית בקרסול למודל In Vivo של טנדינופתיה הנגרמת על ידי שימוש יתר

מכיוון שגידים מחברים שריר לעצם וחווים תנועות חוזרות ונשנות מדי יום במהלך חייהם, הם נוטים מאוד לפציעות שימוש יתר שהן כואבות ומגבילות וגורמות לתפקוד מכני לקוי, המשפיעות על 30-50% מהאוכלוסייה¹. טנדינופתיות הן מצבים כרוניים הנחשבים לפציעות שימוש יתר עקב תנועות עייפות חוזרות ונשנות וריפוי לקוי לרמות שלפני הפציעה. הן הגפיים העליונות והן התחתונות מושפעות בדרך כלל, כולל השרוול המסובב, המרפק, גיד אכילס וגיד הפטלר 2,3,4,5. טנדינופתיה אכילס נפוצה בפעילויות הכוללות ריצה וקפיצה, במיוחד ספורטאים המעורבים באתלטיקה קלה, ריצה למרחקים בינוניים וארוכים, טניס וענפי ספורט כדור אחרים, ומשפיעה על 7-9% מהרצים ^6,7. פציעות מריצה וקפיצה עלולות לגרום גם לדורסיפלקסיה מוגבלת בקרסול, המהווה גורם סיכון לאכילס וגידי פטלר ^8,9,10. לפיכך, יש צורך בהערכה ואפיון טובים יותר של גידים, אשר מחקר זה יכול לספק כמודל חולדה של דורסיפלקסיה פסיבית בקרסול עבור שימוש יתר בגיד אכילס.

עבודה קודמת באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים נועדה לחקור את התפתחות וסמנים של טנדינופתיה. אלה כוללים פעילות גופנית על הליכון, הגעה חוזרת, העמסת גיד ישירה, זריקות collagenase, ניתוח, ומחקרי מבחנה 11,12,13,14,15,16. למרות שהספרות נהנתה מזיהוי סמני נזק משימוש במודלים אלה של טנדינופתיה, המגבלות כוללות העמסת הגיד בתנועות מפרקים שאינן רלוונטיות פיזיולוגית, כמו במקרה של העמסה ישירה של הגיד, אי מדידה ישירה של עומסים מופעלים, כגון במחקרי הליכון, ולא שימוש בשימוש יתר פיזיולוגי, כמו במקרה של זריקות קולגנאז, בין היתר. לשם כך, מחקר זה ביקש לפתח מערכת המפעילה עומסים מכומתים באופן לא פולשני על גיד אכילס עם יישום למחקרי טנדינופתיה הנגרמים על ידי שימוש יתר כדי למלא את הפערים במודלים של בעלי חיים קטנים שפותחו בעבר עבור טנדינופתיה. ביצענו מחקר פיילוט כדי להדגים שהמערכת גורמת לשינויים הניתנים לשחזור בתכונות מכניות על פני טווח של מחזורי טעינה. מערכת זו מאפשרת לתנועה ולהעמסה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית לגרום לשימוש יתר ובו זמנית לכמת ולמדוד את הכוחות המופעלים והנחווים על ידי הגיד במהלך משטר ההעמסה.

מחקר זה נערך בהתאם לאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. בעלי חיים הורדמו באמצעות 5% איזופלורן לזירוז ו-2.5% לתחזוקה, וננקטה זהירות כדי למנוע היפותרמיה.

1. הקמת מערך הבדיקות

1. שלוט בסיבוב הקרסול הפסיבי על ידי מנוע צעד כדי להחיל סיבוב ומומנט עקביים. שלוט במנוע הצעד באמצעות מיקרו-בקר. השתמש בכניסות ממערכת המיקום והכיוון התלת-ממדית כדי לסמן את דרגות הסיבוב. השתמש ביציאות מחיישן המומנט כדי לספק בקרת משוב להגדלת זווית הדורסיפלקסיה אם לא מגיעים לגבול הסף.
2. כדי להתחיל, חבר את המיקרו-בקר, חיישן המומנט, המיקום האלקטרומגנטי התלת-ממדי ומערכת הכיוון למחשב ולאספקת החשמל. שלוט במערכת שנבנתה בהתאמה אישית באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה (איור 1). הורד את קובצי הקוד של MATLAB מ- GitHub ופעל בהתאם להוראות ספציפיות להפעלת הקוד מהוראות הדף של GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. פתחו את MATLAB עם קובצי הקוד. פתח את תוכנת PDImfc כדי לחבר את מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית לתוכנית MATLAB. לחץ על התחבר | P& רציף | StartSockExport(). השאר את היישום פתוח ברקע.

2. Ex-vivo ופוסט-מורטם

1. הרדימו שש חולדות ספראג-דולי בנות 13 שבועות באמצעות שאיפת_CO2 ושיטה משנית של המתת חסד באמצעות תורקוטומיה. מנתחים את גיד אכילס הימני עם הצומת הקלקניוס והמיוטנדי בשלמותם. יש להקפיא בטמפרטורה של -20°C כדי לבצע בדיקות מכניות במועד מאוחר יותר. לאחר הפשרת הגיד, חתך עדין והכנה לבדיקה מכנית, יש לבצע העמסת מתיחה עד לקבלת חוזק המתיחה האולטימטיבי (UTS) של הגיד (העמסה מוקדמת ל-0.1N, התניה מוקדמת למשך 10 מחזורים מ-0.1 ל-1 N, רמפה לכשל בתזוזה קבועה של 0.1 מ"מ לשנייה). השתמש ב- 15% מה- UTS כקלט עבור המערכת לביצוע התניה מוקדמת לשלב מאוחר יותר, כמתואר בשלב 3.4.
2. הרדימו קבוצה נוספת של חמישה בעלי חיים עם אותו הליך למדידות זרוע ומאמץ מומנטיות. בצע צילום רנטגן של רגל שמאל עם הקרסול ב 90° dorsiflexion ליד סרגל כהפניה. פתח את תמונת רנטגן בפיג'י, באמצעות הסרגל בתמונה כהפניה, מדוד את זרוע מומנט הגיד ממרכז הסיבוב של מפרק הקרסול לחלק האחורי של הקרסול כדי לשמש קלט בקוד MATLAB כדי להמיר את כוח הקלט עבור התניה מוקדמת המתוארת בשלב 2.1 לערך המומנט המתאים וכן המרה בין מומנט פלט וכוח לניתוח נתונים.
3. לשתק את הגפה האחורית השמאלית על ידי הקשה על שני סדים כדי למקם את הברך בהארכה מלאה. דורסיפלקס קלות את הקרסול על ידי לחיצה על הבהונות כדי להבטיח שסיבוב הקרסול יתרחש עקב הגיד המבודד ולא מערב רקמות רכות מסביב ונמצא במתח. אם לא במתח או אם יש תנועה בברך, הדביקו מחדש את הסד.
4. חשוף את הגיד על ידי הסרת העור סביב גיד אכילס. מניחים דבק על חרוז אלומיניום בקוטר 1/32 אינץ', מניחים אותו על הגיד החופשי הקרוב ביותר לצומת המיוטנדי של גיד אכילס, ומשתמשים במקלון צמר גפן עם מי מלח להסרת עודפי דבק. יש למרוח שוב ושוב מי מלח על גיד אכילס לאורך כל ההליך הנותר כדי להבטיח לחות של הרקמה.
5. מדוד את שטח החתך של הגיד באמצעות קליפר דיגיטלי לפני הפעלת עומס כלשהו. נניח שהגיד הוא אליפסה ומודדים את הרוחב והעובי בטריפליקטים.
6. הניחו את החולדה על משטח גוף מלא במצב נוטה. הדקו את הקרסול למפעיל המפרק באמצעות אזיקון סביב הקרסול ועוד אחד סביב אצבעות הרגליים, ואבטחו את פיצול הברך באמצעות שני אזיקונים. סובב את הסרן כך שהקרסול יהיה בפלנטרפלקסיה מלאה.
7. חבר את העט הדיגיטלי של מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית למחשב והפעל את ספק הכוח.
8. הפעל את קוד המערכת (המתואר בפירוט רב יותר בשלב 3) עבור מספר המחזורים שצוין (במחקר זה, שש חולדות שעברו המתת חסד קיבלו 7,200 מחזורים).
9. במחזורים של 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 ו-7,200 למדידות זן ex vivo, יש להשהות את משטר ההעמסה המחזורי ולמדוד את אורך הגיד מהקלקניוס לחרוז האלומיניום במרווחים של 5° מ-0 עד 40° של דורסיפלקסיה (גבול ההפעלה עקב אילוצים פיזיים של המערכת) באמצעות עט דיגיטציה תלת-ממדי בטריפליקטים לסירוגין.
10. חשב את המאמץ של הגיד בזוויות משתנות באמצעות האורכים המתקבלים משלב 2.9, כאשר האורך ההתחלתי הוא 0° dorsiflexion עבור כל מספר מחזור. בצע התאמה ליניארית כדי לקבל את הקשר בין זווית dorsiflexion ומאמץ בכל מספר מחזור. השתמש בקשר גומלין זה כדי להמיר נתוני זווית גולמיים למאמץ לצורך ניתוח נתונים.
11. חשב את שטח חתך הגידים באמצעות קליפר דיגיטלי ב 40° dorsiflexion בהנחה של אי דחיסות (נפח קבוע) כאשר אורך הגיד מודד ב 0° ו 40° ואת שטח החתך הנמדד ב 0°. השתמש באזור חתך זה בכל מספר מחזורים כדי להמיר כוח ללחץ לצורך ניתוח נתונים (מתח = כוח / שטח חתך).

3. פרוטוקול העמסה מכני

1. בחלק זה של המחקר השתמשנו ב-25 נקבות של חולדות בנות 11 שבועות מספראג-דוולי, כאשר כל אחת מהן חולקה באופן אקראי לקבלת 500, 1,000, 2,000, 3,600 או 7,200 מחזורים של העמסת עייפות.
   הערה: ההתניה המוקדמת, הכיול הראשוני והמדידה לפני ואחרי המדידה אורכים כ-15 דקות, ומשטר העמסת העייפות המחזורית אורך שנייה אחת בכל מחזור. לפיכך, הזמן הארוך ביותר שהחולדה נמצאת תחת הרדמה הוא כשעתיים, אשר בוצע תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC.
2. חבר את המיקרו-בקר, חיישן המומנט, המיקום האלקטרומגנטי התלת-ממדי ומערכת ההתמצאות למחשב ולספק הכוח. שלוט במערכת שנבנתה בהתאמה אישית באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה (איור 1).
3. הפעל את המחשב ופתח את MATLAB עם קבצי הקוד. פתח את תוכנת PDImfc כדי לחבר את מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית לתוכנית MATLAB. לחץ על התחבר | P& רציף | StartSockExport(). השאר את היישום פתוח ברקע.
4. יש להשרות הרדמה עם איזופלורן 5% באמצעות שאיפה בתא אינדוקציה. לאחר הזירוז, אבטחו את בעל החיים על מצע גוף מלא עם גוף חימום על בסיס מים המחובר כדי לשמור על הטמפרטורה ולקיים הרדמה עם 2.5% איזופלורן באמצעות חיבור חרוט אף. השתמש משחה רטובה על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.
5. הניחו את החולדה על משטח גוף מלא במצב נוטה. הדקו את הקרסול למפעיל המפרק באמצעות אזיקון סביב הקרסול ועוד אחד סביב אצבעות הרגליים, ואבטחו את פיצול הברך באמצעות שני אזיקונים. סובב את הסרן כך שהקרסול יהיה בפלנטרפלקסיה מלאה.
   הערה: יש לוודא שהאזיקונים אינם גורמים להתכווצות או לנגעים, יש להקפיד על הידוק ובמידת הצורך להניח גזה בין האזיקון לעור לקבלת שכבת הגנה.
6. לשלבים הבאים הכרוכים בהפעלת קוד המערכת, לחצו על 'הפעל ב- MATLAB' עבור כל מקטע בקוד המתאים לבדיקת הטעינה הספציפית.
7. סובב את הקרסול 50 פעמים עד 15% מלחץ המתיחה האולטימטיבי בהתבסס על הערך של לחץ המתיחה האולטימטיבי של גיד אכילס ממשיכה, ex vivo לבדיקות כישלון כפי שנמדד על בסיס שלב 2.1.
8. בצע כיול ראשוני של הגיד על ידי dorsiflexing אותו שלוש פעמים עד 12°. השתמש בשיפוע האזור הליניארי של אזור הטעינה של עקומת ההיסטרזיס כדי לחשב את האזור המעריכי של העקומה.
9. בהדרגה dorsiflex הקרסול בזוויות עולות עד לקבלת האזור המעריכי של העקומה על ידי חישוב שיפוע שיא אזור ההעמסה של העקומה (מחושב באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה) או עד שהוא מסובב ל 40°, המוקדם מביניהם.
10. בזווית הסופית שהתקבלה, בצע חמש מדידות מכניות מחזוריות כבסיס טעינה מראש.
11. בצע את משטר העמסת העייפות המחזורית עבור מספר מסוים של מחזורים (במחקר זה, עבור 500, 1,000, 2,000, 3,600 או 7,200 מחזורים).
12. כל 50 מחזורים, חשב את שיפוע חלק ההעמסה של עקומת ההיסטרזיס (מחושב באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה) כדי לוודא שהוא עדיין באזור המעריכי. הגדל את זווית הדורסיפלקסיה ב- 1° אלא אם כן היא כבר ב- 40° עד להשגת אזור מעריכי זה.
13. לאחר השלמת משטר ההעמסה המחזורי, בצע חמש מדידות מכניות מחזוריות כמדידות לאחר העמסה בזווית שנבחרה בתחילה למדידת התכונות המכניות של הגידים.
14. הסירו את האזיקונים ואת הסד. החזירו את בעל החיים לחדר ההתאוששות. החיה אינה נותרת ללא השגחה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת, ולאחר מכן היא מוחזרת לכלוב שלה. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום עבור כל סימנים קליניים שליליים ואם קיים, לנהל buprenorphine במינון של 1.2 מ"ג / ק"ג תת עורית אחת כל 72 שעות או לבצע המתת חסד מוקדמת. יש להרדים את בעלי החיים לאחר 7 ימים של פעילות בכלוב באמצעות שאיפת_CO2 ואמצעי משני להמתת חסד באמצעות תורקוטומיה.
    הערה: יישום ההעמסה המחזורית והמדידות המכניות התקבלו באמצעות ג'יג בהתאמה אישית המורכב מחיישן מומנט, מפעיל מפרק קרסול מודפס בתלת-ממד ומיטת בעלי חיים, מערכת מיקום וכיוון אלקטרומגנטית תלת-ממדית, ומנוע צעד המסובב פיר כדי להשיג דורסיפלקסיה, כפי שדווח בעבר על ידי הקבוצה שלנו¹⁷. מערכת זו נשלטת על ידי סקריפט MATLAB המוזכר בשלב 1.2. חיישן המומנט ומערכת המיקום והכיוון לוכדים נתוני מומנט ומיקום לאורך פרוטוקול הטעינה של המערכת.

4. ניתוח נתונים

1. טענו את הנתונים לפני ואחרי המדידה בנפרד לתוך MATLAB.
2. המר את המומנט ללחץ בהתבסס על זרוע המומנט הנמדדת משלב 2.2 ושטח החתך שנמדד במספר העומסים שצוין שהופעל המתקבל משלב 2.11 באמצעות משוואות (1) ו- (2):
   (1)
   (2)
3. המר את הזווית למאמץ בהתבסס על ההמרה שהתקבלה משלב 2.10.
4. חשב את ממוצע ההיסטרזיס (השטח בין עקומות ההעמסה והפריקה), שיא הלחץ (ערך הלחץ המרבי של המחזור) ומודולי הטעינה והפריקה (התאמה ליניארית של 50% האחרונים של ההעמסה ו-60% הראשונים של עקומות הפריקה) עבור מחזורי המדידה לפני ואחרי המדידה.
5. חשב את אחוז השינוי בתכונות המכניות משלב 4.4 בין מחזורי המדידה שלפני ואחרי המדידה.

עם המספר ההולך וגדל של מחזורים מיושמים, חלה ירידה גדולה יותר בתכונות המכניות של גיד in vivo . הייתה ירידה נמוכה משמעותית בהיסטרזה ובמודולי ההעמסה והפריקה בקבוצת 500 המחזורים בהשוואה לקבוצות המחזור 3,600 ו-7,200 (p < 0.05) (תרשים 2). בעוד שחלה ירידה משמעותית בלחץ השיא למחזור מקבוצת 500 לקבוצת 3,600 מחזורים, לא הייתה ירידה משמעותית בין קבוצות 500 ל-7,200 מחזורים. חלה ירידה עקבית באחוזים בהיסטרזיס, מתח שיא ומודולים של העמסה ופריקה עבור 3,600 ו-7,200 קבוצות מחזור. תמונות מוכתמות של Hematoxylin ו-eosin ו-Masson של דגימות גידים אימתו רמות גבוהות יותר של נזק מיקרו-מבני עם מחזורים גבוהים יותר של dorsiflexion עם תאים מעוגלים יותר, hypercellularity, הפרעה בסיבים והתכווצות סיבים (איור 3). התוצאות במאמר זה מראות כי מחזורים גבוהים יותר של דורסיפלקסיה גורמים לרמות מוגברות של נזק לגיד אכילס.

איור 1: מערכת בדיקת דורסיפלקסיה פסיבית בקרסול. (A) ספק כוח, (B) מיקרו-בקר, (C) מנוע צעד, (D) חיישן מומנט, (E) חיישן מיקום וכיוון אלקטרומגנטי תלת-ממדי, (F) תושבת קרסול מודפסת בתלת-ממד, (G) מיטת בעלי חיים מודפסת בתלת-ממד, (H) מחזיק חרוט אף מודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עקומות עומס מאמץ מחזוריות מייצגות. עקומות ההיסטרזיס במחזורים 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 ו-7,200. החץ מציין ירידה בלחץ השיא עם מספר גדל והולך של מחזורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות מוכתמות היסטולוגית מייצגות של דגימות גידים. Hematoxylin ו-Eosin (משמאל) ו-Masson's Trichrome (מימין) צבעו תמונות של גידים עבור 500, 1,000, 2,000, 3,600 ו-7,200 קבוצות מחזוריות עבור מחקר זה שהראו כי הגדלת מספר המחזורים המופעלים גורמת לתאים מעוגלים יותר, תאיות יתר (כוכבים), הפרעה בסיבים והתכווצות סיבים (חיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.