מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להתוות את הצעדים הדרושים כדי לבסס ולהשתמש במבחן העדפה חברתית עבור דג זברה בוגר ולהוכיח שניתן להשתמש בו כדי לאפיין פגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מידול הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי בדגי הזברה כדי לאפיין את ההשפעה של סביבה עוברית שלילית על התנהגות חברתית של מבוגרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתארות את כל המומים המולדים הנגרמים על ידי אלכוהול. מומים מולדים כגון ליקויי גדילה, הפרעות גולגולתיות, התנהגותיות וקוגניטיביות קשורים ל-FASD. קשיים חברתיים הם הפרעות התנהגותיות נפוצות הקשורות ל-FASD ולעתים קרובות גורמות לבעיות בריאותיות חמורות. מודלים של בעלי חיים הם קריטיים להבנת המנגנונים האחראים לפגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול. דגי הזברה הם בעלי חוליות חברתיים המייצרים ביצים שקופות מופרות חיצונית; מאפיינים אלה מספקים לחוקרים הליך מדויק אך פשוט ליצירת פנוטיפ FASD והתנהגות מולדת שניתן למנף כדי להדגים את הליקויים החברתיים הקשורים ל-FASD. לפיכך, דג הזברה אידיאלי לאפיון הליקויים החברתיים של FASD. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לספק למשתמש מבחן התנהגותי פשוט שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את ההשלכות של סביבה שלילית בשלב מוקדם במהלך ההתפתחות ואת ההשפעות שיכולות להיות לה על התנהגות חברתית בבגרות. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לאפיין את ההשפעה שיש למוטציות או טרטוגנים על התנהגות חברתית של מבוגרים. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד לאפיין את ההתנהגות החברתית של דגים בודדים במהלך בדיקה חברתית של 20 דקות. יתר על כן, הנתונים המתקבלים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי מספקים ראיות לכך שניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לאפיין את ההשפעות של פגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול עוברי בדגי זברה בוגרים.
מבוא
חשיפה לאלכוהול לפני הלידה עלולה להוביל למגוון מומים מולדים הידועים בשם הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD)1. התנהגות לקויה, כגון קשיים חברתיים, הם מומים מולדים נפוצים הקשורים ל-FASD 2,3. למרבה הצער, קשיים חברתיים גורמים לעתים קרובות לבעיות נפשיות חמורות4, שעלולות להשפיע לרעה על איכות החיים של אנשים עם FASD. לפיכך, הבנת המנגנונים האחראים לפגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול היא בעלת חשיבות עליונה.
לדגי הזברה יש מאפיינים ביולוגיים והתנהגותיים שהופכים אותם למתאימים היטב לקידום הבנתנו את המנגנונים האחראים לפגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול. לדוגמה, דג הזברה מייצר כמויות גדולות של ביצים מופרות חיצונית שקופות; מאפיינים ביולוגיים אלה מאפשרים לחוקרים ליצור בקלות פנוטיפים מדויקים וניתנים לשכפול של FASD5. כדי לחשוף עוברים לאתנול ב-24 שעות לאחר ההפריה (hpf), יש פשוט להשתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לבחון את הביצית השקופה ולשלב את העובר על סמך עבודות שפורסמו בעבר כגון Kimmel et al.6, ואז למקם את הביצית בריכוז האתנול הרצוי למשך הזמן הרצוי. מכיוון שהכוריון הוא מחסום חלש לאלכוהול7, האתנול רוחץ את העובר בקלות. כדי לעצור את החשיפה, פשוט צריך להוציא את הביצים מתמיסת האתנול. מלבד מתן שיטה פשוטה אך מדויקת ליצירת פנוטיפים של FASD, דג הזברה גם מאפשר לחוקרים לבצע השוואות גנטיות לבני אדם מכיוון של-70% מהגנים האנושיים יש אורתולוג של דג הזברה, ולכן הם כלי רב ערך להבנת גנים הקשורים למחלות אנושיות8. בנוסף, בניגוד למודלים אחרים של בעלי חיים, דגי הזברה יוצרים קבוצות חברתיות9 הנקראות shoals10. ניתן להשתמש בהתנהגות צניחה כדי לאפיין את ההשפעות שיש לחשיפה לאתנול עוברי על התנהגות חברתית11. יתר על כן, בדג הזברה ניתן לעורר תגובה חברתית על ידי שימוש בגירוי חברתי מבוקר מחשב12 או גירוי חברתי חי13.
עבודות קודמות אפיינו את התגובה החברתית של דג זברה בוגר בקבוצות14, אולם מגבלה של גישה זו היא חוסר היכולת לתאם את התנהגותו של דג בודד עם מדד ספציפי כגון שינויים ברמות המוליכים העצביים11. הפרוטוקול הבא ייתן למשתמשים את היכולת לאפיין את ההתנהגות החברתית של דג זברה בוגר בודד. מכיוון שהתנהגות חברתית נרכשת עבור דגים בודדים, משתמשי הפרוטוקול יכולים כעת לתאם את הפרופיל ההתנהגותי הנרכש של כל דג עם תוצאה תלויה. לדוגמה, עבודות קודמות הראו כי חשיפה לאתנול עוברי פוגעת בתגובה הדופמינרגית לגירוי חברתי11. בעוד שהנתונים המוצגים כאן השתמשו בחשיפה לאתנול עוברי כמשתנה בלתי תלוי, משתמשי הפרוטוקול יכולים לאפיין את ההשפעות שיש לטיפולים תרופתיים אחרים או למוטציות גנטיות על התנהגות חברתית. יתר על כן, משתמשי הפרוטוקול אינם מוגבלים לבחון כיצד טיפולים עובריים משנים התנהגות, אלא יכולים גם לקבוע כיצד טיפולים תרופתיים חריפים בדגי זברה בוגרים משפיעים על התנהגות חברתית15.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום דקוטה.
1. דיור, טיפול וחשיפה לאתנול עוברי של דג הזברה
- לגדל ולגדל דג זברה כמתואר16.
- חשיפה לאתנול
- בחר את השלב ההתפתחותי המתאים לביצוע החשיפה לאתנול. בפרוטוקול זה העוברים נחשפו לאתנול ב-24 hpf.
- מניחים ביצים בנפח/נפח אתנול של 1.0% למשך שעתייםורבע. יחס של ביצה אחת למ"ל EM הוא תרגול טוב. באופן ספציפי, הניחו עוברים ב-50 מ"ל של תווך עוברי (EM; אנא ראו Westerfield16 למתכון EM) ואז הסירו 500 מיקרוליטר של EM והחליפו ב-500 מיקרוליטר אתנול.
- לאחר חשיפה לאתנול, יש לגדל עוברים כמתואר17. בדיקת התנהגות חברתית כאשר דגים בני 16 שבועות.
2. אקראיות והגדרת טנק
- באמצעות מחולל רצפים אקראיים מקוון, בצע רנדומליזציה אדירה של כל הניסויים לביצוע הבדיקות ההתנהגותיות. ודא שצד הגירוי וקבוצות הטיפול משתנים באופן אקראי.
- כדי להימנע מגורמים מבלבלים כמו שעה ביום או יום הבדיקה, התחל וסיים את הבדיקה ההתנהגותית באותה שעה בכל יום ובצע את הבדיקה ההתנהגותית בימים רצופים עד שכל דגי הניסוי נבדקו.
- עבור בדיקה זו (איור 1), השתמש במיכל 37 ליטר (50 ס"מ x 25 ס"מ x 30 ס"מ, אורך x רוחב x גובה) עם מיכלי 1.4 ליטר הממוקמים בחוץ לאורך רוחב המיכל כפי שתואר קודם לכן17.
- רפדו את החלק האחורי והתחתון של מיכל ה-37 ליטר בפלסטיק גלי לבן כדי להגביר את הניגודיות בין דג הניסוי לרקע כדי לשפר את מעקב הווידאו.
- הנח את הפלסטיק הגלי על הקיר החיצוני של מיכלי ה-1.4 ליטר כדי להגביר את הניגודיות של הגירוי החברתי עבור דגי הניסוי. לבסוף, הניחו פלסטיק גלי לבן בין מיכלי 1.4 ליטר למיכלי 37 ליטר; מחסום אטום זה משמש כדי למנוע מדגי הניסוי לצפות בגירוי החברתי במהלך ההתרגלות.
- מקם את המצלמה במרחק מספיק רחוק כדי ללכוד את כל אורכו של מיכל ה-37 ליטר בתוספת מחצית ממכלי ה-1.4 ליטר ולעקוב במדויק אחר דגי הניסוי הבוגרים.
הערה: לראות איזה צד מחזיק את הגירוי מבטיח שהחוקרים סימנו את אזורי המעקב בצורה נכונה ומספק יתירות כגיבוי. - אם לא נעשה שימוש במעקב אינפרא אדום, הקפד להאיר את מיכל ה-37 ליטר. השתמש בכל מנורות מכסה המנוע הזמינות מסחרית עם מנורת ספקטרום מלא 15 W T8.
הערה: אם מוקמות מספר זירות השתמש במכסי אקווריום זהים עם מנורות זהות.
3. ביצוע הבדיקה החברתית
- התחל במילוי מיכל ה-37 ליטר המשמש לבדיקה ההתנהגותית במים זהים למים המשמשים במדף הדיור. ודא שטמפרטורת המים נמצאת בטווח של 2 מעלות צלזיוס ממדף הדיור.
- בסוף היום רוקנו את מיכל ה-37 ליטר. התחילו כל יום בדיקה במים מתוקים. ודא שמפלס המים במיכל 37 ליטר ומפלס המים במיכלי 1.4 ליטר זהים. אם טמפרטורת החדר אינה שומרת על המים במיכל 37 ליטר על 28.5 מעלות צלזיוס 2 מעלות צלזיוס, החלף את המים במים חמים ב-28.5 מעלות צלזיוס.
- לאחר מכן הגדר את אזורי העניין. התייעץ עם תוכנת המעקב הידנית למשתמש לבחירתך כדי ליצור אזורים. בפרוטוקול זה לאורך מיכל ה-37 ליטר בחלקו העליון והתחתון נעשה שימוש בסרט מדידה לסימון מרווחים של 5 ס"מ. בהתחשב בכך שמיכל הבדיקה הוא 50 ס"מ, מרווחים של 5 ס"מ מובילים ל -10 אזורים שהם 5 ס"מ כל אחד.
- באמצעות הסימנים שנעשו על מיכל ה-37 ליטר כהפניה, השתמש בתוכנה כדי לבנות את האזורים על ידי חיבור נקודת ה-5 ס"מ בחלק העליון לנקודה המתאימה של 5 ס"מ בתחתית. בנוסף, צור אזור לאורך החלק התחתון ולאורך הגירוי. התאם אישית אזורי עניין.
- השתמש בתוכנת המעקב בפרוטוקול זה כדי למדוד את המרחק מאזור ואת משך השהייה באזור. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-12 אזורים.
- כמת את הזמן המושקע באזורים 1 עד 10 ואת המרחק מהגירוי והתחתית כאזור 1, כאזור הקרוב ביותר לגירוי בעוד שאזור 10 הוא הרחוק ביותר מהגירוי.
- לאחר מכן, בחרו את שני הזכרים ושתי הנקבות שישמשו לגירוי החברתי. השיטה הטובה ביותר תהיה להשתמש בזכרים ונקבות מאותה קבוצה כמו דגי הניסוי. אם זה לא אפשרי, נסו למצוא דגים שמתאימים לזן, לגיל ולגודל של דגי הניסוי.
- העבירו את דגי הניסוי ממיכל הדיור לזירת הבדיקה (מיכל 37 ליטר). השתמש ברשת כדי לתפוס את הדגים במיכל הדיור. מניחים את הרשת עם הדגים בתוכה, לתוך מיכל עם מי דגים.
הערה: שימוש בגישה זו יפחית את הלחץ על דגי הניסוי בזמן המעבר בין מיכלים. - מקם את דג הניסוי במרכז זירת הבדיקה.
- לאחר שהגדרות הזיהוי משביעות רצון על סמך התוכנה לבחירת המשתמש (ראה מדריך למשתמש), התחל את תקופת הניסיון של 20 דקות. במהלך 10 הדקות הראשונות, השאר את המחסום האטום בין מיכל ה-37 ליטר למיכלי ה-1.4 ליטר במקומו. זה ימנע מדגי הניסוי לראות את הגירוי החברתי, המורכב משני זכרים ושתי נקבות דג זברה, ויאפשר לדגים להתאקלם בזירת הניסוי13,17.
- לאחר 10 דקות, הסר בזהירות את המחסומים האטומים על ידי משיכתם מאחורי המיכל; זה יאפשר לדגי הניסוי לראות את הגירוי החברתי.
- השתמש בתוכנת מעקב כדי לעקוב ולכמת את התנהגות דגי הניסוי 11, 12, 17 על סמך העדפות המשתמש ומדריך התוכנה. בפרוטוקול הנוכחי, כמת את המרחק מהגירוי החברתי ותחתית המיכל וכן את זמן השהות בכל האזורים.
- נתח נתונים באמצעות כלים מסורתיים לניתוח נתונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 שונה מ-Fernandes et al.17 ומראה כי חשיפה לאתנול עוברי מקהה את תגובת ה-shoaling על ידי בחינת המרחק מהגירוי. הנתונים באיור 2 מייצגים את המרחק מהגירוי החברתי במהלך הניסוי בן 20 הדקות. ציר ה-Y מראה את המרחק בסנטימטרים ואילו ציר ה-X מציג את הניסוי בן 20 הדקות מחולק למרווחים של דקה. הפס השחור לאורך ציר ה-X מייצג את הזמן שבו המחסומים האטומים הוסרו והגירוי החברתי גלוי לדגי הניסוי. בכל הקבוצות בתחילה יש ירידה מהירה לכיוון הגירוי החברתי ברגע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לדגי הזברה מספר מאפיינים ביולוגיים והתנהגותיים ההופכים אותם לאורגניזם אטרקטיבי ביותר למחקר הכולל גנים, סביבה והתנהגות 5,19. פרוטוקול זה נותן למשתמש הקצה מדריך פשוט יחסית לבדיקת התנהגות חברתית, דרכים מרובות לכמות ההתנהגות החברתית, ויש לו פוטנציאל לקשר את התגובות ההתנהגותיות של דגים בודדים עם טיפולים כגון חשיפה לאתנול עוברי, מוטציות גנטיות או חומרים פרמקולוגיים אחרים.
כדי לבחון התנהגות חברתית בדגי זברה ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מימון לתמיכה במחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) / המכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול (NIAAA) [R00AA027567] ל- Y.F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.4 ליטר ZT140 Aquaneering טנקים | Aquaneering | ZT140 | טנקים לתמריצים חברתיים |
| Aqueon 20 אינץ' דלוקס פלורסנט אור אקווריום מכסה מנוע מלא | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | אור עבור מיכל | |
| אקווריום זכוכית פתוחה סטנדרטי של Aqueon, מיכל 10 ליטר | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | 37 ליטר לבדיקה החברתית | |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | ||
| BP28184 מערכת מעקב Ethovision XT | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| מצלמת Basler GigE צבעונית בעלת יכולת R | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| פלסטיק גלי לבן | פלסטיק כדי לרפד את החלק האחורי והתחתון של מיכל 37-I ואת החלק האחורי של המיכלים המשמשים לגירוי החברתי |
מקורות
- Institue Med. Fetal alcohol syndrome: diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academies Press. Washington, D.C. (1996).
- Abel, E. L. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. , Springer. (1984).
- Stevens, S. A., Clairman, H., Nash, K., Rovet, J. Social perception in children with fetal alcohol spectrum disorder. Child Neuropsychol. 23 (8), 980-993 (2017).
- Streissguth, A. P., et al. Risk factors for adverse life outcomes in fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. J Dev Behav Pediatr. 25 (4), 228-238 (2004).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
- Pitcher, T. J. Heuristic definitions of fish shoaling behaviour. Animal Behav. 31 (2), 611-613 (1983).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Embryonic alcohol exposure impairs the dopaminergic system and social behavioral responses in adult zebrafish. Int J Neuropsychopharmacol. 18 (6), pyu089(2015).
- Fernandes, Y., Gerlai, R. Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish. Alcohol Clin Exp Res. 33 (4), 601-609 (2009).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Jones, E. M., Eberhart, J. K. Social deficits following embryonic ethanol exposure arise in post-larval zebrafish. Addict Biol. 24 (5), 898-907 (2019).
- Buske, C., Gerlai, R. Early embryonic ethanol exposure impairs shoaling and the dopaminergic and serotoninergic systems in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 33 (6), 698-707 (2011).
- Pannia, E., Tran, S., Rampersad, M., Gerlai, R. Acute ethanol exposure induces behavioural differences in two zebrafish (Danio rerio) strains: A time course analysis. Behav Brain Res. 259, 174-185 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)/Monte Westerfield. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2007).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Eberhart, J. K. Social behavioral phenotyping of the zebrafish casper mutant following embryonic alcohol exposure. Behav Brain Res. 356, 46-50 (2019).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Impairment of social behaviour persists two years after embryonic alcohol exposure in zebrafish: A model of fetal alcohol spectrum disorders. Behav Brain Res. 292, 102-108 (2015).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochem Cell Biol. 96 (2), 88-97 (2018).
- Park, J. S., et al. Innate color preference of zebrafish and its use in behavioral analyses. Mol Cells. 39 (10), 750-755 (2016).
- Gerlai, R., et al. Forward genetic screening using behavioral tests in zebrafish: a proof of concept analysis of mutants. Behav Genet. 47 (1), 125-139 (2017).
- Scerbina, T., Chatterjee, D., Gerlai, R. Dopamine receptor antagonism disrupts social preference in zebrafish: a strain comparison study. Amino Acids. 43 (5), 2059-2072 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
