מאמר שיטה

מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

DOI:

10.3791/65836

⸱

21 בנובמבר 2023

 ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex), LMU Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ורידים ריאתיים (PVs) הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיות בהפרעות קצב פרוזדוריות וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות ובהתקדמות של פרפור פרוזדורים (AF). PVs מכילים שרוולי שריר הלב (MS) המורכבים קרדיומיוציטים. טרשת נפוצה מעורבת בהפעלה ובתחזוקה של מיקוד אוטומטי, מכיוון שהיא שומרת על דמיון לשריר הלב הפועל בלב, כולל היכולת לייצר דחפים חשמליים חוץ רחמיים. מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב ועשויים לייצג מודלים מצוינים של בעלי חיים לחקר שריר הלב של ורידים ריאתיים, שכן קרדיומיוציטים נמצאים באופן נרחב בכל דופן כלי הדם. עם זאת, מיקרודיסקציה מדויקת והכנה של PVs מורין מאתגרת בשל גודל האיבר הקטן והאנטומיה המורכבת.

אנו מדגימים פרוטוקול מיקרודיסקציה מונחה מיקרוסקופיה לבידוד האטריום השמאלי של מורין (LA) יחד עם PVs. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים Troponin-T (cTNT) ו- connexin 43 (Cx43) מבוצעת כדי להמחיש את LA ו- PVs באורך מלא. הדמיה בהגדלה של 10x ו- 40x מספקת תצוגה מקיפה של מבנה PV, כמו גם תובנות מפורטות על ארכיטקטורת שריר הלב, במיוחד הדגשת נוכחותו של קונקסין 43 בתוך הטרשת הנפוצה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרפור פרוזדורים (AF) הוא הפרעת הקצב המתמשכת הנפוצה ביותר1. השכיחות של AF עולה עוד יותר עם מספר צפוי של ~ 17.9 מיליון חולים באירופה בשנת 20601. AF חשוב מאוד מבחינה קלינית מכיוון שהוא גורם סיכון חיוני להתפתחות אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב או שבץ, וכתוצאה מכך נטל אישי, חברתי וסוציו-אקונומי עצום. למרות שמיקוד אוטומטי ידוע כבר עשרות שנים, הפתופיזיולוגיה של AF עדיין לא מובנת במלואה2.

כבר בסוף שנות התשעים, מחקרים הדגימו את ההשפעה הגדולה של ורידים ריאתיים (PVs) בייזום ושמירה על AF, שכן הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיותהמפעילות AF 3. הוכח כי PVs שונים מבחינה מבנית מכלי דם אחרים. בעוד כלי דם טיפוסיים מכילים תאי שריר חלקים, מדיה טוניקה של PVs מכיל גם cardiomyocytes4. במכרסמים, שריר לב זה נמצא בכל מקום בכל PVs, כולל חלקים תוך ריאתיים וחוץ-ריאתיים, כמו גם באזור הפתח5. בבני אדם, PVs מכילים גם קרדיומיוציטים, אשר ניתן לראות בתוך שלוחות של שריר הלב השמאלי פרוזדורים (LA) - מה שנקרא שרוולי שריר הלב (MS)6,7.

לטרשת נפוצה יש דמיון מורפולוגי לשריר הלב הפרוזדורי8. הצורה והגודל של קרדיומיוציטים פרוזדורים ו- PV אינם משתנים באופן משמעותי זה מזה ומראים תכונות אלקטרופיזיולוגיות דומות8. רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתוך PV הוכיחו את הפעילות החשמלית של טרשת נפוצה, והדמיה אנגיוגרפית חשפה התכווצויות המסונכרנות עם פעימות הלב 9,10.

צמתי פער הם קומפלקסים חלבוניים יוצרי נקבוביות המורכבים משש תת-יחידות קונקסין, המאפשרות מעבר של יונים ומולקולות קטנות11. צמתי מרווחים קיימים באפפוזיציות בין תאים, מחברים קרדיומיוציטים שכנים, ומאפשרים צימוד חשמלי בין-תאי בין קרדיומיוציטים12,13. מספר איזופורמים של קונקסין מבוטאים בלב, כאשר קונקסין 43 (Cx43) הוא האיזופורם הנפוץ ביותר המתבטא בכל אזורי הלב14. מחקרים קודמים מספקים ראיות לביטוי של Cx43 בקרדיומיוציטים של PVs15,16.

זה עדיין מאתגר לחקור טרשת נפוצה בתוך PVs שלמים בשל המבנה העדין שלהם, במיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לזהות ולבודד PVs יחד עם LA ואונות ריאה בעכברים באמצעות מיקרודיסקציה מונחית מיקרוסקופיה. בנוסף, אנו מדגימים צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של PVs כדי להמחיש קרדיומיוציטים והחיבורים שלהם בתוך PVs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן במינכן, וכל ההליכים באמצעות עכברים אושרו על ידי Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). עכברי C57BL6/N הושגו באופן מסחרי.

1. הכנה

  1. הכינו ג'ל אגרוז 3% על ידי ערבוב 3 מ"ג אגרוז ו-100 מ"ל של מלח חוצץ 1x Tris בצלוחית Erlenmeyer בנפח 500 מ"ל. מחממים את התמיסה במיקרוגל ב 600 W במשך 2-3 דקות עד הג'ל הופך הומוגני.
  2. הכינו את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של הג'ל לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. ממלאים את צלחת הפטרי חצי בג'ל. בועות שקופות מהג'ל כדי להבטיח עקביות הומוגנית. השאירו את צלחת הדיסקציה להתקרר עד שהג'ל הופך מוצק.
  3. הכינו את כל המאגרים והפתרונות הדרושים, כולל תמיסת קיבוע, תמיסת חלחול, חיץ חוסם וחיץ כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1.

2. קצירת איברים והכנת רקמות

הערה: פרוטוקול נרחב המפרט את הליך הרדמת העכבר וקצירת הלב פורסם בעבר17,18. לפיכך, אנו מציגים רק תיאור קצר של חלק זה. ניסויים בוצעו על עכברים בני 12 עד 16 שבועות C57BL6 (שישה זכרים, ארבע נקבות). משקל הגוף של הזכר גדל מ-26 גרם ל-28 גרם ומשקל הגוף של הנקבה מ-19 גרם ל-22 גרם. השלבים הבאים בוצעו ללא הזרקת הפרין סיסטמית קודמת.

  1. מרדימים את העכבר עם איזופלורן (5%, 95% חמצן, זרימה: 1 ליטר/דקה) ומבטיחים עומק הרדמה מספיק.
  2. העבר את העכבר לשולחן הניתוח והציב אותו במצב שכיבה. לשמור על הנרקוזיס עם שאיפת איזופלורן (2%, 98% חמצן, זרימה: 1 ליטר לדקה) דרך מסכת הרדמה ולתקן את העכבר עם סרט בגפיים. להזריק פנטניל עבור שיכוך כאבים (0.1 מ"ג / 25 גרם משקל גוף i.p).
  3. הרימו את הפרווה בתהליך הקסיפואידלי וקבעו חתך רוחבי של 2 מ"מ. מנתקים את הפרווה מהפאשיה התת עורית באמצעות דיסקציה קהה (אחורי מספריים) ומרחיבים את החתך באופן גולגולתי ורוחבי כדי לחשוף את בית החזה.
  4. בזהירות לפתוח את הבטן caudal אל הקשת costal. להרים את התהליך xiphoidal מעט כדי לחתוך את הסרעפת מן caudal ולגרום לריאות לקרוס. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים כלשהם ופתחו את בית החזה באופן דו צדדי כדי לחשוף את הלב.
  5. חותכים את הווריד הנבוב התחתון (IVC) בזמן שהלב עדיין פועם כדי להרגיע את העכבר ולהמשיך לחורר את הלב על ידי חדירה לחדר השמאלי עם מחט 27 G והזרקת 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS).
  6. לאחר ניקוי הדם מלב העכבר, אתר את קשת אבי העורקים, את הווריד הנבוב העליון (SVC) ואת קנה הנשימה. חותכים אותם ~ 3 מ"מ מעל בסיס הלב וקוצרים את הלב יחד עם הריאות המחוברות.
  7. השקיעו את האיברים שנקטפו בצינור חרוטי של 10 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז מעוקרת. אפשר לדגימות להתייבש במשך 24 שעות ב 4 ° C.

3. הכנה מונחית מיקרוסקופיה של LA ו- PVs

  1. הכניסו את הלב והריאות המיובשים לצלחת דיסקציה המכילה 40-50 מ"ל של 1x PBS. שים אותו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר עם הגדלה פי 10 והגדר את התאורה. מניחים את הלב עם המשטח הגבי שלו על צלחת הדיסקציה. זהה את המעבר בין דופן החדר לדופן הפרוזדורים, והפרד בזהירות את החדרים מהאטריה באמצעות מספריים כירורגיים.
    הערה: חתכו כ-1 מ"מ נחותים מהאטריה כדי לשמור על רקמת חדר. זה יהיה נחוץ מאוחר יותר כדי להצמיד את האטריה לצלחת הדיסקציה מבלי לפגוע במבנים בבסיס הלב. אנו ממליצים לשמור על החדרים מכיוון שהם יכולים לשמש כדגימת בקרה חיובית. כדי להטמיע את רקמת החדר, בצע את אותו הליך המתואר להטמעת PVs, כמתואר בסעיף 4.
  2. מניחים את האטריה המופרדת עם משטח חיתוך החדר (שלב 3.1) על צלחת הדיסקציה כך שבסיס הלב פונה כלפי מעלה. כוונו את האטריה כך שאונות הריאה יהיו אחוריות, LA ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) יהיו בצד ימין, והאטריום הימני (RA) ותוספתן פרוזדורים ימני (RAA) יהיו בצד שמאל. תקן את ההכנה על ידי הצמדת רקמת החדר השמאלי הנותרת לצלחת הדיסקציה. פזרו בעדינות את אונות הריאה מבלי להפעיל כוח מוגזם והצמידו אותן לצלחת הדיסקציה (איור 1A).
  3. קבל סקירה כללית של ציוני הדרך האנטומיים בבסיס הלב.
    1. מצא את אבי העורקים עם קשת אבי העורקים במרכז בסיס הלב.
    2. זהה את תא המטען הריאתי (PT) ישירות מימין לאבי העורקים ועקוב אחר מסלולו לכיוון האחורי כדי להבחין בין עורקי הריאה (PAs). אמת את מיקומם על ידי מעקב אחר מסלולם עד לאונה השמאלית ולאונות הימניות העליונות/אמצעיות כדי למצוא את הילום הריאה המתאים (LH).
    3. קבעו את מיקום קנה הנשימה ו/או הסמפונות הראשיים השמאליים והימניים (L Br, R Br), הממוקמים אחוריים לאבי העורקים, וודאו את מיקומם על-ידי מעקב אחר מסלולם לכיוון LH (איור 1A).
    4. מצא את SVC משמאל לאבי העורקים ואמת על ידי ביצוע מסלולו לתוך RA ליד RAA.
  4. הסר רקמת חיבור ושומן סביב בסיס הלב תוך שמירה על כל ציוני הדרך שזוהו לעיל. נוסף על כך, הסירו את קשת אבי העורקים ואת קנה הנשימה כדי לקבל מבט חופשי על בסיס הלב (איור 1B).
  5. יש להפריד בעדינות את ה-PAs מהמשטח העליון של האטריום על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים עדינים. לאחר מכן, חתכו אותם ב-LH והפכו אותם הצידה כדי לחשוף את הקיר השמאלי נטול הפרוזדורים (LAFW) ואת ה-PVs בממד המלא שלהם. נתקו את הסמפונות הראשיים מה-LH והוציאו את רקמת הסימפונות (איור 1C).
    הערה: ה-LH משמש הן כנקודת הכניסה המשותפת ל-PAs ולדרכי הנשימה לריאות, והן כנקודת היציאה של ה-PVs. חשוב לבצע כל הליך ב- LH בזהירות כדי למנוע נזק ל- PVs.
  6. כדי להפריד את LA/RA ואת החדר השמאלי והימני (LV, RV), בצע חתך החל מהחלק הקדמי של RV הנותר כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד (TV) עד הצד הקדמי של SVC כדי לפתוח את RA מהצד הקדמי. חתכו את הקיר החופשי האחורי של RA (RAFW) ליד המחיצה הבין-פרוזדורית כדי להפריד בין RA ו-LA. חתכו את דופן החדר הימני האחורי ליד המחיצה הבין-חדרית כדי לנתק לחלוטין את ה-LV וה-RV.
    הערה: פרוטוקול נרחב המתאר בפירוט את הליך ההכנה והבידוד של האטריום הימני פורסם בעבר19. ההפרדה של RA שימושית כדי להסיר רקמות לא רצויות מקומפלקס רקמות LA-PV ולאסוף רקמות לניסויים נוספים.
  7. להקטין את גודל אונות הריאה על ידי חיתוך חלק מרקמת הריאה הבסיסית כך כ 3-4 מ"מ של רקמת הריאה נשאר.
    הערה: שמרו על האפיקים של אונות הריאה כפי שהם משמשים כצפים במהלך שלבי ההטבעה הבאים ואפשרו הטבעה אופקית של PVs בתרכובת O.C.T.

4. הטבעת רקמות

  1. העבירו את התכשיר, כולל LA ו-PVs, לקריומולד, וודאו שבסיס הלב וקודקוד הריאה פונים כלפי מעלה. סדרו אותם בתצורה פיזיולוגית - ודאו שה-PVs אינם מעוותים או מתהפכים.
  2. מלאו את הקריומולד בתרכובת O.C.T ודחסו בעדינות את ה-PVs במלקחיים עדינים כדי להסיר את האוויר שנותר. לשמור על התצורה הפיזיולוגית שלהם ללא שינוי לאורך כל התהליך.
  3. הניחו את הקריומולד עם הרקמה המוטבעת על קרח יבש כדי להקפיא את תרכובת ה-O.C.T. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
    הערה: חיוני לשמור על PVs במצב אופקי כדי להבטיח קבלת חלקים המכילים PVs באורך מלא עבור הליכים הבאים.

5. חיתוך ואיסוף קטעי רקמות קפואים

הערה: כדי לחתוך את בלוקי הרקמות, הגדרות המכונה הותאמו לטמפרטורת דגימה של -18 ° C, וטמפרטורת להב של -25 ° C.

  1. התקן בלוק רקמה על מחזיק הדגימה על-ידי החלת שכבה של תרכובת O.C.T. בין בלוק הרקמה למחזיק הדגימה. מקפיאים אותם למשך 3-4 דקות.
  2. חסום את ראש הדגימה וטען את מחזיק הדגימה עם בלוק הרקמה על ראש הדגימה על ידי סגירת ידית שחרור הדגימה צ'אק. כוונן בעדינות את מיקום בלוק הרקמה באמצעות ידיות הכוונון העדינות.
  3. הסר את הקריומולד מהדגימה. בטל את חסימת ראש הדגימה ואת הבלם החשמלי של ההקפאה.
  4. הגדר את הקריוסטט למצב חיתוך עם גודל חיתוך בין 30 מיקרומטר ל- 50 מיקרומטר. חתוך את דגימת הרקמה עד שה- PVs הופכים גלויים.
  5. עבור למצב חיתוך חתך עדין והגדר את העובי ל -10 מיקרומטר. התחל לאסוף מקטעים, כולל PVs ורקמות ריאה ופרוזדורים מחוברים. אספו חלקים בעזרת צלחת נגד גלגול או על ידי קיבוע הקצה החופשי של כל חלק למחזיק הלהב בעזרת מברשת קרה עדינה ופרשו אותם.
  6. מקם שקופית (נשמרת בטמפרטורת החדר) בסמוך למקטע. שחררו בזהירות את החלק מהמברשת, ואפשרו לחלק להיצמד באופן טבעי לשקופית, כאשר החלק הקפוא ותרכובת ה-O.C.T נמסים עם נגיעה במשטח ההחלקה החם יותר.
    הערה: שמור על מצב יציב ועדין במהלך תהליך החתך כדי למנוע קרעים או קפלים במקטעים. החלף את הלהב בלהב חדש במידת הצורך.
  7. אסוף עד שלושה מקטעים בכל שקופית. תייג את השקופיות ואחסן אותן בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: אנו ממליצים לאסוף לפחות חמישה מקטעים (שווה ערך לשתי שקופיות) עבור כל PV.

6. צביעת אימונופלואורסנציה של קריוסקציות מה- PVs

  1. מסדרים את המגלשות הקפואות על מערכת צביעה ומניחים למקטעים להפשיר כ-20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: מלאו את מערכת הצביעה במים כדי לשמור על לחות הדגימות. ייבוש הרקמה עלול לפגוע באנטיגנים, לגרום לקשירת נוגדנים לא ספציפיים ולהכתמת יתר במהלך הליכי הצביעה.
  2. לאחר 20 דקות של הפשרה, כסו את המקטעים בכמה טיפות של תמיסת קיבוע (4% פרפורמלדהיד [PFA], טבלה 1) כדי לקבע את הרקמה על המגלשות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הקיבוע, העבר את השקופיות למדף השקופיות האנכי וטבול אותן במיכל מלא ב- PBS 1x. הניחו את המיכל על שייקר במהירות נמוכה ושטפו את המגלשות במשך 5 דקות. חזור על מחזור כביסה זה פעמיים נוספות, באמצעות PBS טרי 1 בכל פעם.
  4. לאחר הכביסה, הקיפו בעיגול כל חלק בנפרד בכל שקופית בעט חוסם נוזלים המכיל קסילול. סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה ומרחו 1 או 2 טיפות של תמיסת חדירה (0.1% Triton X-100, טבלה 1) על כל דגימה עם פיפטה של פסטר. תנו למקטעים לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לחדור את קרומי התאים ואברוני התא.
  5. לאחר החדירה, הסר את תמיסת Triton X-100 0.1% על-ידי שטיפת המגלשות במשך 3 x 5 דקות ב-PBS אחד, בהתאם לאותו הליך המתואר בשלב 6.3.
  6. לאחר הכביסה, סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה והחילו טיפה אחת או שתיים של מאגר החסימה (טבלה 1) על כל חלק, כדי לוודא שהן מכוסות במלואן במאגר החסימה. אפשר לדגור על המגלשות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  7. הכן 1 מ"ל של תערובת הנוגדנים הראשונית על ידי פיפטציה של 5 μL של נוגדן נגד cTNT עכבר (מדולל 1:200) ו 1 μL של נוגדן ארנב נגד Cx43 (מדולל 1:1,000) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל מלא 994 μL של מאגר חוסם. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי.
    הערה: התאם את כמות תערובת הנוגדנים המיושמת בהתאם לגודל המקטע. ודא כי החלקים מכוסים במלואם על ידי תערובת נוגדנים. הריכוז, זמן הדגירה וטמפרטורת הדגירה האופטימלית של נוגדנים יכולים להשתנות בהתאם לגורמים כגון סוג הנוגדן, שיבוט נוגדנים ומאפייני הרקמות. אנו ממליצים לבדוק ולייעל את תנאי הכתמים בנפרד עבור כל נוגדן.
  8. לאחר שלב החסימה (שלב 6.6), הסר את מאגר החסימה הנותר ומרח ישירות 2 או 3 טיפות של תערובת הנוגדנים העיקרית על כל מקטע. אפשר למגלשות לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו את המגלשות במשך 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1).
  10. הכינו 1 מ"ל של תערובת הנוגדנים המשנית על ידי פיפטציה של 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עז מצומד AF488 (מדולל ביחס של 1:1,000) ו-1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז מצומד AF568 (מדולל ביחס של 1:1,000) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא ב-998 מיקרו-ליטר של חיץ כביסה. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
  11. לאחר שלב הכביסה (שלב 6.9), סדרו מחדש את המגלשות במערכת הצביעה ומרחו 2 או 3 טיפות מתערובת הנוגדנים המשנית על כל חלק עם פיפטה. אפשר לנוגדנים לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה על הדגימות מפני אור כדי למנוע מרווה פלואורופורית. לאחר הדגירה השניונית של הנוגדנים, שטפו את המגלשות במשך 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1).
  12. סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה. הכתימו את המקטעים עם Hoechst-33342 (בדילול של 1:1,000 ב-1x PBS) על ידי מריחת 2 עד 3 טיפות של תמיסת Hoechst-33342 על כל קטע. אפשר לדגור על המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1). הרכבה של המגלשות על-ידי החלת טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה פלואורסצנטי על כל שקופית. כסו את המגלשות בכיסויים.
    הערה: ודא שמכסה הכיסוי שטוח בעת הנחתו. אם קיימות בועות אוויר, הפעילו בעדינות לחץ על צד הבועה כדי להסיר אותן.
  14. אחסן את השקופיות המותקנות בשומר שקופיות ב- 4 °C.
    הערה: מומלץ לצלם את השקופיות מוקדם ככל האפשר. פרוטוקול זה אינו תקף באופן בלעדי עבור הנוגדנים שהוזכרו. ניתן להחליף או לשנות אנטיגנים ונוגדנים ממוקדים בהתאם לדרישות הניסוי הבודד או אסטרטגיות זיהוי אנטיגן חלופיות.

7. הדמיה של פרוסות צביעת immunofluorescence

  1. הגדר את המיקרוסקופ.
    1. הפעל את המיקרוסקופ עם מקור אור הלייזר, המחשב המחובר והתוכנה הנלווית בהתאם למדריך היצרן.
    2. הזן את תפריט תצורה . לחץ כדי לבחור את סוג המצלמה המתאים לצילום פלואורסצנטי (למשל, מצלמת מונוכרום DFC365FX).
    3. היכנסו לתפריט 'רכישה' וצרו שלושה ערוצים.
    4. בחר ערוץ FCr1 לזיהוי Hoechst-33342, תייג אותו ובחר את קוביית מסנן DAP במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 2 ואת עוצמת האור ל- 17%.
    5. בחר ערוץ FCr2 לזיהוי cTNT (מוכתם בנוגדן מצומד AF488), תייג אותו ובחר את קוביית המסנן L5 במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 200-300 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 1.8 ואת עוצמת האור ל- 100%.
    6. בחר ערוץ FCr3 לזיהוי Cx43 (מוכתם בנוגדן מצומד AF568), תייג אותו ובחר את קוביית מסנן TXR במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 150 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 2 ואת עוצמת האור ל- 100%.
      הערה: המאפיינים הספקטרליים של קוביות המסנן מפורטים בטבלה 2.
  2. טען את השקופית על במת המיקרוסקופ.
  3. בצע הדמיה כללית בהגדלה של 10x:
    1. בחר במטרה 10x ופתח את תריס הלייזר על-ידי לחיצה על Live. כאשר ערוץ FCr1 נבחר, השתמש בפונקציית הנווט כדי לנווט בשקופית עד לזיהוי אות. מקדו בערך את הדגימה עד שניתן יהיה להבחין בין גרעיני התא.
    2. הפעל את מצב הסריקה הספירלית כדי ללכוד תצוגה מקדימה מלאה של הדגימה. בטל את ההפעלה החיה על-ידי לחיצה נוספת על הלחצן כדי להגן על הדגימה. זהה את LA, PVs ורקמת הריאה.
    3. הגדר את תחום העניין לסריקת האריחים הבאה; בחר נקודות מיקוד מרובות באזור העניין. לחץ על שידור חי בערוץ FCr1 והתאם את המיקוד עבור כל נקודת מיקוד. שמור את מיקומי Z המתאימים, המייצגים את מיקום המיקוד המדויק עבור כל נקודת מיקוד. התחל את סריקת האריחים בהגדלה של 10x כדי ללכוד תמונת סקירה מלאה של הדגימה.
    4. לאחר השלמת הסריקה, פתח את סריקת האריחים ומיזג את התמונות הבודדות. כדי לשפר את הבהירות והניגודיות של ערוצים בודדים, בחר אותם בסרגל האובייקטים והתאם את טווח האות שלהם באמצעות המחוונים כרצונך.
  4. קבל תמונות מוגדלות בהגדלה של 40x :
    1. בחר את המטרה 40x. התאם את זמן החשיפה ואת הגדרות הרווח עבור כל ערוץ באופן הבא: FCr1: קוביית מסנן DAP: זמן חשיפה: 50 אלפיות השנייה, רווח: 1.5; FCr2: קוביית מסנן L5: זמן חשיפה: 80 אלפיות השנייה, רווח: 1.8; FCr3: קוביית מסנן TXR: זמן חשיפה: 20 אלפיות השנייה, רווח: 2.
    2. השתמש בתמונת הסקירה של שלב 7.3 כדי לאתר את פתח ה- PV (PVO), כמו גם אזורי PV חוץ-ריאתיים ותוך-ריאתיים (PVex, PVin). הגדר אזור זה לסריקה.
    3. פתח את תפריט המשנה תמונה ולחץ על z כדי להפעיל Z-Stack.
      1. בחר את ערוץ FCr1 ופתח את תריס הלייזר כדי לקבל תצוגה מקדימה חיה .
      2. עבור לתפריט המשנה Z-Stack וקבע את נקודות ההתחלה והסיום של Z-Stack על ידי סיבובידית הכוונון העדין f ocus בכיוון השעון ונגד כיוון השעון עד שהאות הכולל מתחיל לאבד את המיקוד.
      3. לאחר הגדרת טווח המיקוד, בחר במצב Z-Stack ממוטב של המערכת והפעל את האפשרות חשב עומק שדה מורחב של תמונות (EDF). בהתאם למידת השטוחות של הרקמה, צפו לכ-20 שכבות עם מרווח צעדים של כ-0.5 מיקרומטר.
    4. התחל את סריקת האריח. לאחר הסריקה, פתח את סריקת האריח ומיזג רק את תמונת ה- EDF. כדי לשפר את הבהירות והניגודיות של ערוצים בודדים, בחר אותם בסרגל האובייקטים והתאם את טווח האות שלהם באמצעות המחוונים לפי הצורך (ראה שלב 7.3.4).
  5. לאחר יצירת התמונות, שמור את הפרויקט וייצא את שניהם, את הגרסה הממוזגת ואת ערוצי הגלם של כל תמונה כקובץ TIFF.
    הערה: שמירת הקבצים כ- TIFF קריא של ImageJ מאפשרת ל- ImageJ לייבא את גודל האריח המקורי במיקרומטר במקום בפיקסלים. סגור תמיד את תריס הלייזר בכל פעם שאין צורך באות לייזר כדי למנוע הלבנה של הנוגדנים המשניים.

8. עריכת תמונות עם ImageJ

  1. טען את קובצי הערוצים הגולמיים המתאימים ב- ImageJ. לחץ על תמונה | צבע | מזג ובחר את הצבע הרצוי לכל ערוץ.
  2. צור סרגל קנה מידה על-ידי בחירה באפשרות נתח | כלים | סרגל קנה מידה והדבק אותו בפינה השמאלית התחתונה. המשך בעיבוד וניתוח נוספים בהתאם לדרישות התמונה. שמרו את התמונות הממוזגות בסיום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו מיקרודיסקציה, צביעה והדמיה של PVs ב-10 עכברים בני 12-16 שבועות. בעקבות הפרוטוקול, חתכנו בהצלחה PVs יחד עם LA בכל עכברי הניסוי והשגנו חלקים עם תצוגה מקיפה של PVs בשמונה עכברים. תמונות סקירה צולמו בהגדלה של פי 10 כדי לזהות את אזור פתח ה-PV (PVO) בצומת LA-PV, את ה-PVs החוץ-ריאתיים (PVex) (PVs בין הילום הריאה לצומת LA-PV), ואת ה-PVs התוך-ריאתיים (PVin) (PVs מוקפים ברקמת ריאה) (איור 2). תמונות מוגדלות של האזורים שהוזכרו התקבלו ביעד הגדלה של פי 40 (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם פרוטוקול זה, אנו חולקים שיטה להבחין ולבודד את PVs של לב העכבר ולבצע צביעה immunofluorescence עליהם. לאחר קצירת האיברים, הלב והריאות התייבשו בתמיסת סוכרוז מעוקרת, ולאחר מכן הפרדת החדרים מהאטריום ואונות הריאה בהנחיה מיקרוסקופית. לאחר מכן, בסיס הלב היה מוכן לדמיין את PVs ואחריו לחתוך אותם מן הריאות בהילום. הצביעה האימונופלואורסצנטית שלאחר מכן בוצעה באמצעות קריוטכניקה על ידי הטמעת הרקמה בתרכובת O.C.T, חיתוך שלה עם קריוטום וביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית עבור cTNT ו- Cx43.

בידוד PVs יכול להיות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 ל- S.C.), מועצת המלגות של סין (CSC201808130158 ל- R.X.), קרן המחקר הגרמנית (DFG; תכנית מדען קליני ברפואת כלי דם (PRIME), MA 2186/14-1 עד P. T.), וקרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופיות הידבקותEpredia10149870
AF568-נוגדן משניInvitrogenA11036מארח: עז, תגובתיות: ארנב
AgaroseBiozym LE840104-Alexa
Fluor 488-נוגדן משניטכנולוגיית איתות תאים4408Sמארח: עז, תגובתיות:
נוגדן עכבר Anti-Connexin 43 /GJA1 Abcamab11370נוגדן פוליקלונלי, שיבוט: GJA1, מארח: ארנב 
נוגדן נגד cTNTInvitrogenMA5-12960נוגדן חד שבטי, שיבוט: 13-11, מארח:
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA2153
מברשתLukas 5486גודל 6
תלושי כיסויEpredia24 מ"מ x 50 מ"מ
Cryotome Cryo Star NX70Epredia הגדרות: טמפרטורת דגימה: -18 ו-deg; C, טמפרטורת להב: -25 ו-deg;
C DFC365FX מצלמהLeica 
מיקרוסקופ פלואורסצנטי DM6 BLeica 
קרח
תמיסת מלח חוצצת פוספט של דובקו (DPBS) 1x conc.Gibco14040133500 מ"ל
דומונט #5FS מלקחייםFST91150-202 חלקים דרושים
מספריים עדיניםFST14090-09
מדיום הרכבה פלואורסצנטיDAKOS3023
Graefe ForcepsFST11052-10
Hoechst 33342InvitrogenH3570גרעיני תאים תוכנת ניתוח
ועיבודImageJFIJI
LAS XLeica תוכנת הדמיה עבור Leica DM6 B
להבי מיקרוטום S35Feather207500000
מיקרוגל
סרום עיזים רגילSigma-AldrichS26-M
O.C.T. תרכובתTissue-Tek4583
Paraformaldehyde 16%Pierce28908
פיפטות פסטרVWR612-1681
צלחת פטריTPP93100קוטר 100 מ"מ
נדנדה דיגיטלית תלת מימדיתIKA Schü ttler00040010000
צנצנות צביעת שקופיותEasyDipM900-12
תבניות דגימהTissue-Tek Cryomold455725 מ"מ x 20 מ"מ x 5 מ"מ
מערכת צביעה StainTray M920StainTray631-1923מערכת צביעה ל-20 שקופיות
Sterican NeedleBraun4657705G 27 - משמש להזרקה (<חזק>שלב 2) והצמדה (<חזק>שלב 3 ו-4) בפרוטוקול
Student Vannas Spring ScissorsF.S.T.91500-09
סופר PAP עט נוזלי חוסםסופר PAP עטN71310-N
מזרקיםבראון4606108V10 מ"ל
Tris baseRocheTRIS-ROרכיב עבור 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP2287
עכבר יבש ללא מתנול

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
  2. Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
  3. Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
  4. Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
  5. Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
  6. Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
  7. Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
  8. Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432(2020).
  9. Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
  10. Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
  11. Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
  12. Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
  13. Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
  14. Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
  15. Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
  16. Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
  17. Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
  18. Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
  19. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
  20. Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23(2021).
  21. Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
  22. Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T43

מאמרים קשורים