הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל איסכמיה כלייתית דו-צדדית לפגיעה כלייתית חריפה בעכברים

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65838

⸱

2 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ניתן להשתמש במודל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) בשלבים שונים של התפתחות פגיעה כלייתית חריפה (AKI), במיוחד במהלך התקדמות AKI למחלת כליות כרונית (CKD). כאן, אנו מתארים את ההליך לפיתוח מודל IRI בעכברים באמצעות גישה טרנס-בטנית, הידוק פדיקלים כלייתיים באמצעות קליפ כלי דם כדי לגרום לפגיעה איסכמית.

תקציר

פגיעה כלייתית חריפה (AKI) מוגדרת כירידה מהירה בתפקוד הכליות, שבה תפקוד כליות מתמשך מתקדם בהדרגה למחלת כליות כרונית (CKD) עקב אובדן בלתי הפיך של נפרונים ותיקונם הלא מסתגל. בשנים האחרונות, שכיחות AKI גדלה לגבי אטיולוגיות מגוונות, כולל דלדול נפח, אלח דם, רעילות כליות, פגיעה בשרירים וטראומה גדולה, שבה פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) אחראית לרוב האפיזודות. פיתוח מודל ה-IRI בעכברים מושרה על ידי הידוק כירורגי של פדיקל הכליה, המספק כלים רבי עוצמה וניתנים לשליטה למודלים פרה-קליניים של AKI. חשוב לציין, מודל ה-IRI מיושם בשלבים שונים של פיתוח AKI, במיוחד בתהליכים של AKI ל-CKD. למרות שמודל IRI מיושם באופן נרחב במעבדות רבות, סדרה של משתנים עדיין משפיעים על תוצאות מודל זה. כאן, אנו מתארים את הליך פיתוח מודל IRI כדי לספק שיטה חוזרת ואמינה לחוקרים לחקור את הפתוגנזה הבסיסית בהתפתחות AKI ואת ההתקדמות של AKI ל-CKD.

מבוא

פגיעה כלייתית חריפה (AKI) היא תסמונת קלינית חמורה עם תחלואה ותמותה משמעותיים, המוגדרת כעלייה בקריאטינין בסרום של ≥ 0.3 מ"ג/ד"ל (26.5 מיקרומטר/ליטר) תוך 48 שעות או עלייה בקריאטינין בסרום ל-≥ פי 1.5 מנקודת ההתחלה תוך 7 ימים, או נפח שתן <-0.5 מ"ל/ק"ג/שעה למשך 6 שעותו-1. 2,3. למרות עשרות שנים של מחקר, חסר טיפול יעיל ב-AKI כדי להקל על נזק לכליות או להאיץ את התאוששות הכליות, וחלק ניכר מחולי AKI מתקדמים למחלת כליות כרונית (CKD)4,5,6. מולקולות ומסלולים מורכבים מעורבים ב-AKI ובהתקדמותו בחלקם, ולכן מודלים פרה-קליניים מספקים כלים רבי עוצמה לפענוח המורכבויות הללו לפיתוח שיטות טיפוליות יעילות.

מבחינה קלינית, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) היא הגורם העיקרי ל-AKI במצבים שונים, כולל ניתוחי לב וכבד, הלם במחזור הדם, דלדול נפח, אלח דם, חסימה או חסימה של כלי דם בכליות, השתלת כליה וכן הלאה7. דגם העכבר IRI-AKI נמצא בשימוש מאז שנות ה-60; מודל זה פותח על ידי הידוק כירורגי של פדיקל הכליה עם מהדקים לא טראומטיים בעכברים המובילים לאיסכמיה ואחריו זלוף מחדש של זרימת הדם הכלייתית על ידי הסרת המהדקים. מודל IRI-AKI מאופיין בדרך כלל במוות של תאי צינוריות כליה ונזק מתקדם לרקמת הכליה. ה-IRI הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר המשמשים לפתוגנזה והתערבות טיפולית ב-AKI מכמה סיבות: (1) הפשטות והבטיחות של ההליך הכירורגי משפרות את שיעור ההישרדות ושיעור ההצלחה של מודל IRI-AKI8; (2) מאחר שאיסכמיה היא אטיולוגיה עיקרית ב-AKI אנושי, מודל IRI-AKI משמש טוב יותר להערכת אירוע AKI קליני9; (3) מודל ה-IRI יכול להציג פגיעה בכליות ושינויים בהיסטופתולוגיה בשלבים שונים של AKI, מה שרלוונטי גם לחקר ההתקדמות מ-AKI ל-CKD10. בהתאם לתכנון הניסוי, מודלים של AKI המושרים על ידי IRI כוללים IRI דו-צדדי, IRI חד צדדי עם כליה נגדית שלמה, ו-IRI חד צדדי עם כריתת כליה נגדית בו זמנית. יש לציין כי מודל ה-IRI הדו-צדדי נחשב רלוונטי יותר למצבים פתולוגיים אנושיים של AKI מכיוון ששתי הכליות הושפעו מאספקת הדם11. מודל IRI ישים להדמיית ההשפעות של זרימת דם כלייתית מופחתת לאחר השתלת כליה, מעקף לב, כלי דם כלייתיים או ניתוח חסכוני בנפרון, כמו גם בהגדרה של תת לחץ דם9. כאן, אנו מתארים את ההליך למודל IRI דו-צדדי כדי לספק שיטה עקבית ואמינה לחוקרים לחקור את הפתוגנזה הבסיסית ב-AKI המושרה על ידי איסכמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברי C57BL/6J זכרים בגיל 8 שבועות ובמשקל 25 גרם שימשו לביסוס מודל AKI על ידי איסכמיה-רפרפוזיה דו-צדדית. על פי מחקרים קודמים, אנו שומרים על טמפרטורת הגוף בסביבות 36.5-37 מעלות צלזיוס, ומשך האיסכמיה של הכליה הוא 30 דקות בניתוח IRI12,13. בסך הכל נדרשו 6 עכברים לכל קבוצה, ועכברים שהופעל על ידי דמה שימשו כביקורת. הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת ג'ג'יאנג כדי להגן על רווחת בעלי החיים. כל הליכי המחקר בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולעקרונות האתיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג.

1. הכנה טרום ניתוחית

  1. לעקר בלחץ גבוה את כל המכשירים הכירורגיים.
  2. הכן את תמיסת ההרדמה על ידי הוספת 2 מ"ל קטמין ו-0.4 מ"ל קסילזין ב-7.6 מ"ל מי מלח סטריליים. להרדים את העכבר בתערובת של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (16 מ"ג/ק"ג) על ידי הזרקה תוך-צפקית. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת הבוהן.
  3. הנח את העכבר המורדם על השמיכה ההומותרמית כדי להבטיח שדרכי הנשימה שלו יישארו ללא הפרעה. שמור על טמפרטורת הגוף בטווח של 36.5-37 מעלות צלזיוס.
  4. יש לכסות את עיני העכבר במשחת עיניים 1% טטרציקלין הידרוכלוריד למניעת יובש בזמן הרדמה.
  5. לגלח את שיער הבטן בעזרת קוצץ שיער ולנקות את עור אזור הניתוח עם תמיסת פובידון-יוד למשך 3x.

2. ניתוח

  1. בצע חתך חציוני בבטן כ-1-1.5 ס"מ עם מספריים כירורגיים דרך שכבת העור והשריר ופתח את חלל הבטן בעזרת מפזר.
  2. חשוף את הכליה על ידי הזזת השומן הרטרופריטונאלי ודחיפת המעיים ואיברים אחרים למצב האופסייד בעזרת צמר גפן. הכליה ממוקמת בחלל הרטרופריטונאלי, כ -0.5 ס"מ לרוחב עמוד השדרה, ומתחת לצלע ה- 13.
  3. נתח את פדיקל הכליה בעזרת מלקחיים מחודדים עדינים כדי להפריד ולהסיר את הפאשיה ורקמת השומן ולחשוף את פדיקל הכליה השמאלי.
  4. מהדקים את פדיקל הכליה בעזרת קליפ כלי דם באמצעות מלקחיים מחזיקים וודא שהנזק לכלי הדם יהיה מינורי ככל האפשר. הימנע מהידוק שומן סינוס כלייתי מיותר, שעלול להוביל לאיסכמיה כלייתית לא שלמה.
  5. הגדר את משך האיסכמיה של הכליה, החל מהידוק למשך 30 דקות. המאפיין של איסכמיה מוצלחת הוא שהכליה משתנה בהדרגה מאדום לסגול עמוק תוך מספר דקות.
  6. העבר את הכליה לחלל הרטרופריטונאלי. חזור על ההליך בצד הנגדי כדי לחשוף ולהדק את פדיקל הכליה הימני.
  7. רשום את זמן האיסכמיה בכל צד בנפרד כדי להבטיח ששתי הכליות מקבלות את משך הזמן המדויק של איסכמיה. פתח מחדש את החתך ושחרר את קליפ כלי הדם בסוף משך האיסכמיה.
  8. החזר את הכליה לחלל הרטרופריטונאלי, ולאחר מכן תפר את השריר והעור שכבה אחר שכבה עם תפר Vicryl 4-0.
    הערה: יש לבצע את ההליכים הכירורגיים בתנאים סטריליים. נקה את שולחן הניתוח והמכשירים עם 75% אתנול במהלך הפעולה בעת הצורך.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. יש לתת 0.5-1 מ"ל של מי מלח חמים וסטריליים על ידי הזרקה תוך-צפקית כדי לפצות על אובדן הנוזלים.
  2. שמור על שכיבה חזה בתשומת לב עד שהעכבר יחזור להכרה מספקת. הניחו את העכבר על השמיכה ההומותרמית עד שהוא יגיע להכרה מלאה, ואז חזרו לכלוב שלו. אין להחזיר את העכבר לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמתו המלאה.
  3. תן בופרנורפין 0.05-0.10 מ"ג/ק"ג כל 12 שעות במשך 3 הימים הראשונים כדי להקל על הכאבים לאחר הניתוח. עקוב אחר העכברים המנותחים מדי יום.

4. הערכת מודל

  1. צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE)
    1. המתת חסד של בעלי חיים באמצעות נתרן פנטוברביטל על ידי הזרקה תוך-צפקית בימים 1, 3, 7 או 14 לאחר IRI.
    2. יש לתקן רקמות כליה טריות עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך הלילה, ולאחסן ב-75% אתנול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר התייבשות והטמעה, חותכים את הדגימות שהתקבלו לעובי של 8 מיקרומטר לצביעה.
    4. הסירו שעווה מקטעי הרקמה בקסילן, ולאחר מכן החזירו לחות עם ריכוזים הולכים ופוחתים של אתנול.
    5. מכתים את חלקי הרקמה בהמטוקסילין ואאוזין.
    6. ייבשו את חלקי הרקמה על ידי הגדלת ריכוזי אתנול וקסילן.
  2. בדיקת תפקודי כליות
    1. אסוף דגימות דם בשיטת איסוף הדם של גלגל העין לאחר ההרדמה.
    2. דגימות דם צנטריפוגות ב-12000 x גרם למשך 10 דקות להפרדת סרום.
    3. קבע קריאטינין בסרום וחנקן אוריאה בדם (BUN) על ידי מנתח הכימיה היבשה האוטומטי לניטור תפקוד הכליות.
  3. PCR בזמן אמת (RT-PCR)
    1. חלץ את סך ה-RNA מרקמות הכליה באמצעות ערכת מיצוי RNA מהירה, ולאחר מכן סנתז cDNA עם ערכת תערובת טרנסקריפטאז הפוכה. בצע RT-PCR עם ערכת SYBR Green Premix והפעל על מכשיר RT-PCR. רצפי הפריימר המשמשים כאן דווחו לפני14: KIM1 קדימה, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; הפוך 5'-GGAAGGCAACCACCCTTAGA-3'; פורוורד NGAL, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; הפוך 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH קדימה, 5'-GGTGAAGGTCGGTGAACG-3'; הפוך 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מצב הכליה במהלך הניתוח

המאפיין של איסכמיה מוצלחת הוא שהכליה משתנה בהדרגה מאדום לסגול עמוק תוך 1-2 דקות, ורפרפוזיה מוצלחת מאופיינת בכך שהכליה משתנה בהדרגה מסגול עמוק לאדום תוך 1-2 דקות.

היסטולוגיה של הכליה לאחר ניתוח

צביעת HE ו-Periodic Acid Schiff (PAS) הן הדרכים הישירות לאמת פגיעה חריפה בכליות. במודל הפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, האתר הפגוע הדומיננטי הוא מקטע S3 של צינוריות פרוקסימליות. הביטויים הקלאסיים של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, סיפקנו נוהל מפורט על מודל ה-IRI הכלייתי, ולאחר מכן הדגשנו כי זהו מודל חזק להתקדמות של AKI ו-AKI ל-CKD. בנוסף, אנו מדגימים את ההשפעה של שני הקריטריונים העיקריים של פגיעה בכליות, כולל היסטולוגיה ותפקוד הכליות.

יש להדגיש מספר נקודות מפתח בפרוצדורות כירורגיות למודל חוזר ואמין. לניתוח בטן, מומלץ לבצע חתך בקו האמצע כדי לחשוף את הכליה כדי למזער את הטראומה הקשורה לניתוח. קשה לנתח את פדיקל הכליה לחלוטין בגלל השומן הרטרופריטונאלי, לכן, יש לקלף את פדיקל הכליה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מביעים את הערכתנו לכל המשתתפים על שיתוף הפעולה שלהם במחקר הנוכחי. מחקר זה נתמך על ידי מימון מקרן מדעי הטבע המחוזית של ג'ג'יאנג בסין (LZ22H050001) והתוכנית המחוזית של ג'ג'יאנג לטיפוח כישרונות בריאות חדשניים ברמה גבוהה לווייקיאנג לין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוצץ שיער לבעלי חייםFEIYUBIO19-7002
מזרקים 1 מ"לLongreenSR60061
אתנולמקליןE885996
גזהFEIYUBIO19-5022
מערכת מוניטור הומותרמיתWarmmate40 x 50
מחזיק מחטDKBTCZQ-00160
מפזרRWDR22029-03
מלח סטריליBiosharpBL158A
מספריים לרקמותDKBTDC-YKJ1002
פינצטה לרקמותDKBTDK079904
קליפ כלי דםFine ScienceTools 18055-02
תפר ויקרילשנחאי Jinhuan4 -0 

מקורות

  1. Al-Jaghbeer, M., Dealmeida, D., Bilderback, A., Ambrosino, R., Kellum, J. A. Clinical decision support for in-hospital AKI. J Am Soc Nephrol. 29 (2), 654-660 (2018).
  2. Kellum, J. A., Lameire, N. KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1). Crit Care. 17 (1), 204(2013).
  3. Zhang, C., et al. The Hippo pathway and its correlation with acute kidney injury. Zool Res. 43 (5), 897-910 (2022).
  4. He, L., et al. AKI on CKD: heightened injury, suppressed repair, and the underlying mechanisms. Kidney Int. 92 (5), 1071-1083 (2017).
  5. Sato, Y., Takahashi, M., Yanagita, M. Pathophysiology of AKI to CKD progression. Semin Nephrol. 40 (2), 206-215 (2020).
  6. Wang, Z., Zhang, C. From AKI to CKD: Maladaptive repair and the underlying mechanisms. Int J Mol Sci. 23 (18), 10880(2022).
  7. Hoste, E. A. J., et al. Global epidemiology and outcomes of acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 14 (10), 607-625 (2018).
  8. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  9. Skrypnyk, N. I., Siskind, L. J., Faubel, S., de Caestecker, M. P. Bridging translation for acute kidney injury with better preclinical modeling of human disease. Am J Physiol Renal Physiol. 310 (10), F972-F984 (2016).
  10. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  11. Zhang, J., et al. A two-stage bilateral ischemia-reperfusion injury-induced AKI to CKD transition model in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 319 (2), F304-F311 (2020).
  12. Hukriede, N. A., et al. Experimental models of acute kidney injury for translational research. Nat Rev Nephrol. 18 (5), 277-293 (2022).
  13. Bao, Y., Yuan, Y., Chen, J., Lin, W. Kidney disease models: tools to identify mechanisms and potential therapeutic targets. Zool Res. 39 (2), 72-86 (2018).
  14. Bao, Y., et al. DNA demethylase Tet2 suppresses cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Discov. 7, 167(2021).
  15. Rossiter, A., La, A., Koyner, J. L., Forni, L. G. New biomarkers in acute kidney injury. Crit Rev Clin Lab Sci. 5, 1-22 (2023).
  16. Hesketh, E. E., et al. Renal ischemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. J Vis Exp. (88), e51816(2014).
  17. Zager, R. A., Altschuld, R. Body temperature: an important determinant of severity of ischemic renal injury. Am J Physiol. 251, F87-F93 (1986).
  18. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  19. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).
  20. Tannenbaum, C., Ellis, R. P., Eyssel, F., Zou, J., Schiebinger, L. Sex and gender analysis improves science and engineering. Nature. 575, 137-146 (2019).
  21. Lee, H. T., Ota-Setlik, A., Fu, Y., Nasr, S. H., Emala, C. W. Differential protective effects of volatile anesthetics against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. Anesthesiology. 101 (6), 1313-1324 (2004).
  22. Heyman, S. N., Rosen, S., Rosenberger, C. Animal models of renal dysfunction: acute kidney injury. Expert Opin Drug Discov. 4 (6), 629-641 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מחלה בכליותמודל עכבריתפקוד כלייתימחלת כליות כרוניתחסימת פדנקול כליתיאובדן נפרוניםמודלים פרה-קליניים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.