מאמר שיטה

בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה

DOI:

10.3791/65844

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מפורטים לבידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן באמצעות חרוזים מגנטיים פונקציונליים. יתר על כן, הוא מקיף ניתוחים מאוחרים יותר, כולל כתמים מערביים, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מנוזלים ביולוגיים זכו לאחרונה לתשומת לב משמעותית בתחום הביופסיה הנוזלית. הם משוחררים כמעט על ידי כל סוג של תא, מספקים תמונת מצב בזמן אמת של תאים מארחים ומכילים שפע של מידע מולקולרי, כולל חלבונים, במיוחד אלה עם שינויים לאחר תרגום (PTM) כגון זרחון, כשחקן העיקרי של תפקודי התא והתפרצות המחלה והתקדמותה. עם זאת, הבידוד של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים נותר מאתגר בשל תפוקות נמוכות וזיהומים משיטות הבידוד הנוכחיות של כלי רכב חשמליים, מה שהופך את הניתוח במורד הזרם של מטעני EV, כגון פוספופרוטאינים של EV, לקשה. במאמר זה אנו מתארים שיטת בידוד מהירה ויעילה של כלי רכב חשמליים המבוססת על חרוזים מגנטיים פונקציונליים לבידוד EV מנוזלים ביולוגיים כגון שתן אנושי וניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם לאחר בידוד EV. הפרוטוקול איפשר תשואת התאוששות גבוהה של כלי רכב חשמליים בשתן ופרופילים רגישים של פרוטאום EV ופוספופרוטום. יתר על כן, הרבגוניות של פרוטוקול זה ושיקולים טכניים רלוונטיים מטופלים גם כאן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים עטופים בקרום המופרשים על ידי כל סוגי התאים ונמצאים בנוזלים ביולוגיים כגון דם, שתן, רוק וכו'.1,2,3,4. כלי רכב חשמליים נושאים מטען של מולקולות ביו-אקטיביות מגוונות המשקפות את המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התאים המארחים שלהם, ולכן מתפקדות כגורמים מכריעים בהתקדמות המחלה 4,5,6. יתר על כן, מחקרים מקיפים קבעו כי ניתן לזהות סמני מחלה מבוססי EV לפני הופעת הסימפטומים או גילוי פיזיולוגי של גידולים 5,6,7.

זרחן פועל כמנגנון מפתח באיתות ובוויסות תאי. לכן, פוספופרוטאינים מספקים מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים מכיוון שאירועי זרחן חריגים קשורים למסלולי איתות תאיים לא מווסתים ולהתפתחות מחלות גרורתיות כגון סרטן 8,9,10. למרות שיצירת פרופיל של דינמיקת זרחן מאפשרת זיהוי של חתימות פוספופרוטאין ספציפיות למחלה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים, השפע הנמוך והאופי הדינמי של פוספופרוטאינים מציבים אתגרים גדולים בפיתוח פוספופרוטאינים כסמנים ביולוגיים11,12. יש לציין כי הפוספופרוטאינים בעלי השפע הנמוך הכלולים ברכב חשמלי מוגנים מפני עיכול אנזימטי חיצוני בסביבה חוץ-תאית8. כתוצאה מכך, כלי רכב חשמליים ופוספופרוטאינים שמקורם ברכב חשמלי מציעים מקור אידיאלי לגילוי סמנים ביולוגיים בגילוי מוקדם של סרטן ומחלות אחרות.

למרות שניתוח של זרחן חלבונים בכלי רכב חשמליים מציע משאב רב ערך להבנת איתות סרטן ואבחון מחלות בשלב מוקדם, היעדר שיטות יעילות לבידוד רכב חשמלי מהווה חסם משמעותי. בידוד EV מושג בדרך כלל באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (DUC)13. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן ואינה מתאימה להשלכות קליניות בשל תפוקה נמוכה ויכולת שחזור ירודה13,14. גישות חלופיות לבידוד EV, כגון משקעים15 המושרים על ידי פולימרים, מוגבלות על ידי ספציפיות נמוכה עקב משקעים משותפים של חלבונים שאינם EV. גישות מבוססות זיקה, כולל לכידת זיקה מבוססת נוגדנים16 וסינון זיקה17, מציעות ספציפיות משופרת אך מוגבלות לשיעור התאוששות נמוך יחסית עקב נפח קטן.

כדי להתמודד עם הבעיות בחקר דינמיקת הפוספופרוטאינים בכלי רכב חשמליים, הקבוצה שלנו פיתחה טכניקת שחזור וטיהור כולל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVtrap) המבוססת על זיקה כימית ללכידת כלי רכב חשמליים על גבי חרוזים מגנטיים פונקציונליים18. תוצאות קודמות הראו כי שיטת בידוד EV מבוססת חרוזים מגנטיים זו יעילה ביותר בבידוד כלי רכב חשמליים ממגוון רחב של דגימות נוזל ביולוגי ומסוגלת להשיג תפוקת EV גבוהה בהרבה תוך מזעור הזיהום בהשוואה ל- DUC ושיטות בידוד קיימות אחרות18,19. השתמשנו בהצלחה ב-EVtrap ובשיטת העשרת פוספו-פפטידים מבוססת טיטניום שפותחה על ידי קבוצה20 שלנו כדי ליצור פרופיל של פוספופרוטאום של כלי רכב חשמליים שמקורם בנוזלים ביולוגיים מגוונים ולזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של פוספופרוטאין למחלות שונות 19,21,22.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על EVtrap לבידוד של כלי רכב חשמליים במחזור. הפרוטוקול מתמקד ברכבים חשמליים בדרכי השתן. כמו כן, אנו מדגימים אפיון של כלי רכב חשמליים מבודדים באמצעות כתם מערבי. לאחר מכן אנו מפרטים את הכנת הדגימה ורכישת ספקטרומטריית מסה (MS) הן עבור ניתוח פרוטאומיקה והן עבור ניתוח פוספופרוטאומיקה. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה וניתנת לשחזור עבור פרופיל של פרוטאום EV בשתן ופוספופרוטום, אשר יאפשר מחקרים נוספים על כלי רכב חשמליים והיישומים הקליניים שלהם23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל דגימות השתן נאספו מאנשים בריאים לאחר הסכמה מדעת. הניסויים עמדו בכל הסטנדרטים האתיים הכוללים דגימות אנושיות ותאמו את ההנחיות של תוכנית הגנת המחקר האנושי של אוניברסיטת פרדו.

1. איסוף דוגמאות

  1. צנטריפוגה 12 מ"ל של דגימת שתן בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל למשך 10 דקות ב 2,500 x גרם, 4 ° C כדי להסיר פסולת תאים וגופים אפופטוטיים גדולים.
  2. מעבירים 10 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור חדש של 15 מ"ל וממשיכים בבידוד EV.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את הדגימות ב -80 ° C ולהפשיר ב 37 ° C בעת השימוש.

2. בידוד EV בגישת EVtrap

  1. הוסף 0.5 מ"ל של מאגר העמסה (יחס של 1:10 v/v) ו- 100 μL של תמיסת חרוזי EVtrap (יחס של 1:50 v/v) לדגימה בהתאם להוראות היצרן.
  2. דגרו על הדגימה על ידי סיבוב מקצה לקצה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. גלולה את הדגימה על ידי הנחת צינור חרוטי 15 מ"ל על מדף מפריד מגנטי. הסר את supernatant.
  4. השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ"ל של חיץ כביסה ולהעביר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. פיפטה עדינה להשעיה מחדש של החרוזים הקשורים לרכב חשמלי.
  5. מניחים את הצינור על מתלה מפריד מגנטי של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ושאפו את הסופרנטנט. השתמשו בפיפטת P200 כדי לשאוף לחלוטין את הסופרנאטנט ולהימנע משאיפת החרוזים.
  6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה. מוסיפים את החיץ מיד לאחר שאיפת הסופרנאטנט כדי למנוע מהחרוזים להתייבש.
  7. שטפו את החרוזים 2x עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר.
  8. דגרו על החרוזים עם 100 מיקרוליטר של טריאתילאמין טרי 100 מילימטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואספו את התמיסה המדוללת המכילה כלי רכב חשמליים באמצעות מתלה מפריד מגנטי של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: כדי להכין 1 מ"ל של 100 mM triethylamine, לדלל 14 μL של תמיסת triethylamine במים.
  9. חזור על שלב 2.8 ושלב את הפתרונות המדוללים. יבש את הפולט באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום ב 4 ° C.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. ניתן לאחסן דגימות EV מיובשות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים ללא השפעות שליליות על השלבים הבאים או על התוצאות.

3. אפיון כלי רכב חשמליים לפי כתם מערבי

  1. יש להשהות מחדש 5% מדגימת הרכב החשמלי המיובש (שווה ערך ל-0.5 מ"ל של דגימת השתן) ב-20 מיקרוליטר של מאגר דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) 1x עם 10 mM dithiothreitol (DTT).
    הערה: כלי רכב חשמליים מ-0.5 מ"ל שתן מספיקים לזיהוי אות CD9 (סמן EV24) בכתמים מערביים.
  2. מרתיחים את הדגימה במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. טען את הדגימה על ג'ל פוליאקרילאמיד ובצע אלקטרופורזה ואימונובלוטציה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים25.
  3. לאחר העברת החלבונים לקרום פלואוריד פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) בעל פלואורסצנטיות נמוכה, חסום את הממברנה עם אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב-tris-buffered salt tween-20 (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כדי להכין 1 ליטר של מאגר TBST, הוסף בסיס Tris של 19 mM, 137 mM NaCl ו- 1 מ"ל של Tween-20; התאם את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl.
  4. דגירה על ממברנה עם נוגדן ארנב נגד CD9 ביחס של 1:5,000 ב-1% BSA ב-TBST ב-4°C למשך לילה או למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBST. לדגור על הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב IgG, HRP ביחס של 1:5000 ב-1% BSA ב-TBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  6. שטפו את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBST. הוסף את מצעי הכימילומינסנציה המשופרת (ECL) המתקבלים באופן מסחרי (יחס של 1:1) לממברנה וזהה אותות במערכת הדמיה כימילומינסנטית.

4. הכנת דגימה לניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה

  1. הכינו חיץ ליזיס טרי המכיל 12 mM נתרן deoxycholate (SDC), 12 mM נתרן lauroyl sarcosinate (SLS), 100 mM triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB), 10 mM tris-(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP), 40 mM chloroacetamide (CAA), 1x phosphatase inhibitor קוקטיילים.
    הערה: פתרונות המלאי מפורטים בתיאור של טבלת החומרים. חיץ הליזיס מוכן על ידי הוספת תמיסות המלאי להשגת הריכוזים הרצויים בהתאם לנפח הנדרש.
  2. יש להמיס את דגימת הרכב החשמלי המיובשת ב-100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ולחמם את הדגימה למשך 10 דקות ב-95°C עם טלטול ב-1,100 סל"ד.
  3. לאחר קירור הדגימה לטמפרטורת החדר, לדלל אותה פי חמישה על ידי הוספת 400 μL של 50 mM TEAB.
  4. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן. השתמש במאגר הליזיס המדולל פי חמישה עם 50 mM TEAB כריק.
  5. הוסיפו את תערובת טריפסין/Lys-C ביחס אנזים-חלבון של 1:50 ואט/וואט ודגרו על הדגימה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה עם ניעור ב-1,100 סל"ד.
  6. הוסף 50 μL של 10% חומצה trifluoroacetic (TFA) כדי להחמיץ את הדגימה.
  7. מוסיפים 600 μL של אתיל אצטט לדגימות ומערבלים את התערובת במשך 2 דקות.
  8. צנטריפוגה את הדגימה למשך 3 דקות ב 20,000 x גרם ולהסיר את השכבה העליונה (שכבה אורגנית). הימנע מלהפריע לממשק במהלך השאיפה.
  9. חזור על שלבים 4.7-4.8. יבש את הפאזה המימית באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום.
  10. יש להשהות מחדש את הדגימה המיובשת ב-200 μL של 0.1% TFA כדי להחמיץ-פפטידים ולהפיל את הדגימה באמצעות חוד התפלה C18 בהתאם להוראות היצרן. מצב את החוד עם 200 μL של 0.1% TFA ב 80% acetonitrile, ואחריו 2x עם 200 μL של 0.1% TFA. טען את דגימת הפפטיד החומצי לתוך הקצה ולאחר מכן שטוף את הקצה 3x עם 200 μL של 0.1% TFA. יש להקפיד על הפפטידים עם 200 μL של 0.1% TFA ב-80% אצטוניטריל.
  11. יבש את הפולט באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום. יבש 2% מדגימת הפפטיד (שווה ערך ל -0.2 מ"ל של דגימת השתן) בנפרד לניתוח פרוטאומיקה. השתמש בשאר (98%) של המדגם לניתוח פוספופרוטאומיקה.
  12. העשרת פוספופפטידים מהדגימה באמצעות ערכת העשרת פוספופפטידים בהתאם להוראות היצרן. בצע את השלבים המתוארים להלן להעשרה.
    1. השהה מחדש את הדגימה המיובשת ב 200 μL של מאגר העמסה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזים לדגימה ונערו נמרצות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הדגימה עם החרוזים לקצה השבור ולצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 100 x גרם.
    2. שטפו את החוד עם 200 μL של חיץ העמסה, לאחר מכן חיץ כביסה 1, ולאחר מכן חיץ כביסה 2. בצע את כל שלושת שלבי הכביסה על ידי צנטריפוגה פעם למשך 2 דקות ב- 20 x g ופעם אחת למשך דקה אחת ב- 100 x g.
    3. שים את הקצה עם חרוזים לתוך צינור חדש כדי לאסוף את phosphopeptides מדולל. הוסף 50 μL של חיץ elution לקצה וצנטריפוגה פעם אחת למשך 2 דקות ב- 20 x g. הוסף עוד 50 μL של חיץ אלוציה לקצה וצנטריפוגה פעם אחת למשך 2 דקות ב- 20 x g. צנטריפוגה פעם אחת אחרונה למשך דקה אחת ב 100 x גרם.
  13. יבשו את הפוספפטידים המדוללים באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום.

5. ניתוח LC-MS/MS

הערה: ניתן להשתמש במערכות/הגדרות LC-MS/MS שונות ובשיטות איסוף נתונים, כגון רכישה תלוית נתונים (DDA).

  1. יש להשהות מחדש את דגימות הפרוטאום/פוספופרוטאום המיובשות בחומצה פורמית 0.1% (ממס A) ולהעמיס את הדגימות בהתאם להוראות היצרן.
  2. הזריקו את הדגימות לתוך טרשת נפוצה לכודה בזמן טיסה של ניידות יונים באמצעות מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (LC) והשתמשו בשיטת Whisper 40 דגימות ליום המתוקננת שנקבעה מראש. הפפטידים מופרדים על עמוד C18 בגודל 15 ס"מ (קוטר פנימי של 75 מיקרומטר, גודל חלקיקים של 1.9 מיקרומטר) כפי שמוזכר בטבלת החומרים.
  3. לניתוח פרוטאומיקה, רכוש נתונים באמצעות פיצול מצטבר-טורי מקבילי בשילוב עם שיטת רכישה בלתי תלויה בנתונים (dia-PASEF) עם טווח מסה לכל רמפה המשתרע בין 300-1200 m/z ובין 0.6-1.50 1/K0 עם זמן מחזור של 1.38 שניות.
  4. לניתוח פוספופרוטאומיקה, קבל נתונים בשיטת רכישת dia-PASEF עם טווח מסה לכל רמפה המשתרע בין 400-1550 m/z ו- 0.6-1.50 1/K0 עם זמן מחזור של 1.38 שניות.
  5. טען את הקבצים הגולמיים לתוכנת פרוטאומיקה ובצע חילוץ, זיהוי וכימות אותות באמצעות זרימת עבודה של רכישת נתונים עצמאית ללא ספריה.
    1. להגדרות חיפוש, השתמש במסד הנתונים של הומו ספיינס , סוגי תקציר ספציפיים עם אנזימי טריפסין/P, 7 אורך פפטיד מינימלי, 52 אורך פפטיד מרבי, שני מחשופים שהוחמצו, קרבמידומתיל בציסטאין כשינוי קבוע, חלבון אצטיל מונח N, חמצון במתיונין, וזרחן בסרין, תראונין וטירוזין (לניתוח פוספופרוטאומיקה) כשינויים משתנים, ו-5 כשינויים משתנים מרביים. הגדר את FDR בקבוצת PSM, פפטיד וחלבון ל- 0.01.
      הערה: תוכנת Spectronaut שימשה בפרוטוקול זה. תוכנות אחרות לחיפוש נתוני DIA כגון DIA-NN ו- PEAKS נמצאות גם הן בשימוש נפוץ. אם הנתונים הושגו במצב DDA, תוכנות כגון MaxQuant ו- Proteome Discoverer ישימות .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה מקיפה מבידוד של כלי רכב חשמליים ועד לניתוחי פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם (איור 1). דגימות השתן המשולשות היו נתונות לבידוד EV. כלי הרכב החשמליים שבודדו התאפיינו בקרישה מערבית ולאחר מכן עובדו להכנת דגימות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטריית מסות, כולל מיצוי חלבונים, עיכול אנזימטי וניקוי פפטידים. לצורך ניתוח פוספופרוטאומיקה, הפוספו-פפטידים הועשרו עוד יותר בהתבסס על ננו-פולימרים מסיסים המתפקדים על ידי יוני מתכת. הן דגימות פפטיד והן דגימת פוספופפטיד נותחו על יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד יעיל של EV הוא תנאי מוקדם חיוני לאיתור חלבונים ופוספופרוטאינים בשפע נמוך בכלי רכב חשמליים. למרות פיתוחן של שיטות רבות למילוי צורך זה, רובן עדיין סובלות ממגבלות כגון התאוששות לקויה או יכולת שחזור נמוכה, המעכבות את השימוש בהן במחקרים רחבי היקף ובמסגרות קליניות שגרתיות. DUC נחשבת בדרך כלל לשיטה הנפוצה ביותר לבידוד רכב חשמלי, ושלבי השטיפה הנוספים מיושמים בדרך כלל כדי לסייע בהגברת הטוהר של כלי רכב חשמליים27,28. הליך זה מוביל לתהליך DUC מייגע יותר וגוזל זמן רב יו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על אינטרס כלכלי מתחרה. אנטון איליוק ואנדי טאו הם מייסדים שותפים של Tymora Analytical Operations, שפיתחה חרוזי EVtrap וערכה מסחרית להעשרת פוספופטיד PolyMAC.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקי NIH 3RF1AG064250 ו- R44CA239845.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"למוצרי מדעי החייםM-1700C-LB
1.5 מ"ל צינור מפריד מגנטי מתלהSergi Lab Supplies1005
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיCorning 
15 מ"ל צינור מגנטי מפריד מתלהסרג'י מעבדה מספקת1002
אנטי ארנב IgG, טכנולוגיית איתות תאי נוגדנים מקושרים HRP7074P2
שייקר מודגר על שולחןהשולחן BioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell ערבוב בלוק MB-101
CD9 (D3H4P) ארנב mAbטכנולוגיית איתות תאים13403S
כלורואצטמידסיגמא -אולדריץ'C0267-100Gמשמש לאלקילציה של קבוצות סולפידים מופחתות. הכינו טרי 400 מ"מ במים כתמיסת מלאי.
אתיל אצטט פישר סיינטיפיק E145-4משקע חומרי ניקוי
Evosep One מערכת כרומטוגרפיה נוזליתEvosep
EvotipsEvosepEV2013טעינת מדגם למערכת Evosep One 
EVtrapTymora אנליטיחרוזים מגנטיים פונקציונליים, מאגר טעינה ומאגר כביסה 
Immobilon-FL PVDF ממברנהסיגמא -AldrichIPFL00010קרום ספיגה 
NuPAGE 4-12% ביס-טריס ג'לInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 עד 12%, ביס-טריס, 1.0 מ"מ, מיני ג'ל חלבון, 12 בארות
NuPAGE LDS מאגר דגימה (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473טור הפרדה 
קוקטייל מעכב פוספטאז 2סיגמא -AldrichP5726-5ML100X, מעכב פוספוטאז.
קוקטייל מעכב פוספטאז 3סיגמא -AldrichP0044-1ML100X,  מעכב פוספוטאז. 
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP מצע 
ערכת העשרת פוספופפטיד PolyMACTymoraלכידת זיקה של יוני מתכת מבוססת פולימר אנליטי (PolyMAC) להעשרת פוספופפטיד
סיגמא -AldrichD6750-10Gחומר ניקוי למאגר ליזה. הכן 120 מ"מ במים כתמיסת מלאי.
נתרן לאורואיל סרקוזינאט סיגמא -AldrichL9150-50Gחומר ניקוי למאגר ליזה. הכן 120 מ"מ במים כתמיסת מלאי.
timsTOF HTBrukerספקטרומטריית מסה של זמן טיסה של ניידות יונים לכודה
TopTip C-18 (10-200 μ L) טיפים GlygenTT2C18.96שיטת התפלה
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLלפליטת EV. 
מאגר טריאתילאמוניום ביקבונאטסיגמא -אולדריץ'T7408-100 מ"ל1 M
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא -אולדריץ'302031-100 מ"ל
טריס-(2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלורידסיגמא -אולדריץ'C4706משמש להפחתת קשרי דיסולפיד. הכן 200 מ"מ במים כתמיסת מלאי. יש לצטט את תמיסת המלאי לנפח קטן ולאחסן אותה בטמפרטורה של 20 מעלות; C (הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007
352097נתרן דאוקסיכולולט 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15(2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64(2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519(2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

מאמרים קשורים