מאמר שיטה

הדמיה של מונוקרבוקסילטים ומטבוליטים רלוונטיים אחרים במוח הזחל לשעבר Vivo Drosophila באמצעות חיישנים מקודדים גנטית

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65846

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדמיין את ההובלה של מונוקרבוקסילטים, גלוקוז ו- ATP בתאי גלייה ונוירונים באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo .

תקציר

דרישות האנרגיה הגבוהות של המוח עקב פעילות חשמלית הן אחת התכונות הבולטות ביותר שלהם. דרישות אלה נפגשות על ידי ייצור ATP מגלוקוז ומטבוליטים שלו, כגון monocarboxylates לקטט ו pyruvate. עדיין לא ברור כיצד תהליך זה מוסדר או מי הם שחקני המפתח, במיוחד בדרוזופילה.

באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית, אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת ההובלה של מונוקרבוקסילטים וגלוקוז בתאי גלייה ובתאי עצב בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo . הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח ולהצמיד מוח זחל המבטא את אחד החיישנים לכיסוי זכוכית.

אנו מציגים תוצאות של ניסוי שלם שבו העברת לקטט נמדדה במוחות של זחלים על ידי הפלת טרנספורטרים מונוקרבוקסילטים שזוהו בעבר בתאי גלייה. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להגביר במהירות את הפעילות העצבית ולעקוב אחר שינויים מטבוליטים במוח הפעיל. השיטה המתוארת, המספקת את כל המידע הדרוש, יכולה לשמש לניתוח רקמות חיות אחרות של דרוזופילה .

מבוא

למוח יש דרישות אנרגיה גבוהות בשל העלות הגבוהה של שחזור שיפועי יונים בנוירונים הנגרמים על ידי ייצור ושידור אותות חשמליים עצביים, כמו גם שידור סינפטי 1,2. דרישה גבוהה זו לאנרגיה נחשבת מזה זמן רב כמסופקת על ידי חמצון מתמשך של גלוקוז לייצור ATP3. טרנספורטרים ספציפיים במחסום הדם-מוח מעבירים את הגלוקוז בדם למוח. רמות גליקמיות קבועות מבטיחות שהמוח יקבל אספקה קבועה של גלוקוז4. באופן מעניין, עדויות ניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמולקולות שמקורן במטבוליזם של גלוקוז, כגון לקטט ופירובט, ממלאות תפקיד חשוב בייצור האנרגיה של תאי המוח 5,6. עם זאת, עדיין יש ויכוח על כמה חשובות מולקולות אלה לייצור אנרגיה ואילו תאים במוח מייצרים או משתמשים בהם 7,8. היעדר כלים מולקולריים מתאימים ברזולוציה הטמפורלית והמרחבית הגבוהה הנדרשת למשימה זו הוא נושא משמעותי שמנע ממחלוקת זו להיפתר לחלוטין.

הפיתוח והיישום של מספר חיישנים מטבוליים פלואורסצנטיים מהונדסים הביאו לעלייה יוצאת דופן בהבנה שלנו היכן וכיצד מטבוליטים מיוצרים ומשמשים אותם, כמו גם כיצד השטפים המטבוליים מתרחשים במהלך פעילות עצבית בסיסית וגבוהה9. חיישנים מטבוליים מקודדים גנטית המבוססים על מיקרוסקופ Förster resonance energy transfer (FRET), כגון ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (גלוקוז), לקוני (לקטט) ופירוני (פירובט), תרמו להבנתנו את חילוף החומרים של אנרגיית המוח 10,11,12,13. עם זאת, בשל העלויות הגבוהות והציוד המשוכלל הנדרש לביצוע ניסויים בבעלי חיים או ברקמות, התוצאות במודלים של בעלי חוליות עדיין מוגבלות בעיקר לתרביות תאים (תאי גלייה ונוירונים).

השימוש המתפתח במודל דרוזופילה כדי לבטא חיישנים אלה גילה כי תכונות מטבוליות מרכזיות נשמרות בין מינים שונים וניתן לטפל בתפקודם בקלות באמצעות כלי זה. חשוב מכך, מודל דרוזופילה שפך אור על האופן שבו גלוקוז ולקטט/פירובט מועברים ועוברים מטבוליזם במוח הזבוב, על הקשר בין צריכת מונוקרבוקסילט והיווצרות זיכרון, ועל ההדגמה המדהימה של האופן שבו עלייה בפעילות העצבית ובשטף המטבולי חופפים 14,15,16,17. השיטה המוצגת כאן למדידת רמות מונוקרבוקסילט, גלוקוז ו- ATP באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית המבוטאים במוח הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד יותר על האופן שבו המוח של דרוזופילה משתמש באנרגיה, אשר יכולה להיות מיושמת במוחות של בעלי חיים אחרים.

אנו מראים כי שיטה זו יעילה לאיתור לקטט וגלוקוז בתאי גלייה ובנוירונים, וכי טרנספורטר מונוקרבוקסילט (צ'אסקי) מעורב ביבוא לקטט לתאי גלייה. אנו גם מדגימים שיטה פשוטה לחקר שינויים מטבוליטים במהלך פעילות עצבית מוגברת, אשר ניתן לגרום בקלות על ידי יישום אמבטיה של אנטגוניסט קולטן GABAA . לבסוף, אנו מראים כי מתודולוגיה זו יכולה לשמש למדידת מונוקרבוקסילט והובלת גלוקוז ברקמות משמעותיות מטבולית אחרות, כגון גופי שומן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תחזוקת זבובים וסנכרון זחלים

  1. כדי לבצע ניסויים אלה, השתמשו בתרביות זבובים שגודלו בטמפרטורה של 25°C על מזון דרוזופילה סטנדרטי המורכב מ-10% שמרים, 8% גלוקוז, 5% קמח חיטה, 1.1% אגר, 0.6% חומצה פרופיונית ו-1.5% מתילפרבן.
  2. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בשורות הבאות: w1118 (רקע בקרה ניסיונית), OK6-GAL4 (מנהל התקן עבור נוירונים מוטוריים), repo-GAL4 (מנהל התקן עבור כל תאי גלייה), CG-GAL4 (מנהל התקן עבור גופים שמנים), UAS-Pyronic (חיישן פירובט), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (חיישן גלוקוז), UAS-Laconic (חיישן לקטט), UAS-GCaMP6f (חיישן סידן), UAS-AT1.03NL (חיישן ATP) ו- UAS-Chk RNAi GD1829. כל הקווים המבטאים חיישנים או RNAi נמצאים ברקע הגנטי w1118 .
  3. כדי להשיג זחלים נודדים מסונכרנים של כוכב שלישי, הניחו 300 זבובים (בני 3-5 ימים, 100 זכרים, 200 נקבות בתולות) של הצלב הגנטי הרצוי בתא הטלת הביצים, המכיל צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכוסה באגרוז 1% בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). הניחו טיפת שמרים נוזליים/קרמיים (בקוטר 1.5 ס"מ) במרכז הפלאק כדי לעודד זבובים להטיל ביצים (איור 1).
  4. שמור את הזבובים על 25 ° C במשך 3 ימים החלפת צלחת פטרי agarose עם אחד טרי שמרים מומסים פעמיים ביום.
  5. אפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך 4 שעות ביום הרביעי לפני החלפת צלחת הפטרי. הסר לוחית זו. לאחר מכן, במשך 3 שעות, לאפשר לזבובים להטיל ביצים בלוח אגרוז חדש עם שמרים מומסים טריים. השתמשו בזחלים האלה בניסויים.
  6. לאחר 3 שעות, להסיר את הפלאק המכיל את הביצים ומניחים אותו באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
  7. אספו 50 עד 100 זחלים שזה עתה בקעו מלוח זה (0 שעות לאחר בקיעת הזחל) והניחו אותם בבקבוקון פלסטיק המכיל מזון סטנדרטי. כדי לאפשר לזחלים להאכיל כראוי, ודאו שהמזון טחון ורך. השתמש בזחלים 96 שעות לאחר ההעברה.

2. הכינו את כיסויי הזכוכית עם פולי-L-ליזין

  1. בצע שלב זה 1 שעות לפני נתיחת הזחל. בלוח תרבית תאים בן 6 בארות, מניחים כיסויי זכוכית בקוטר 25 מ"מ (קוטר הכיסויים לשימוש תלוי בתא ההקלטה הזמין במיקרוסקופ).
  2. יש להניח טיפה (300 μL) של פולי-L-ליזין במרכז כל כיסוי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. יש לשטוף כל כיסוי 3x במים מזוקקים, ולאחר מכן 2x בתמיסת מלח נטולת Ca2+ (אותה תמיסה המשמשת לניתוח הזחלים, ראה שלב 3.2). התקן את הכיסויים בתא ההקלטה ומלא אותו בתמיסת מלח ללא Ca2+.
    הערה: למרות שמוח הזחל יכול להיצמד ישירות לכיסויי הזכוכית, ההיצמדות חלשה, והמוח מדי פעם זז או זז במהלך הניסוי עקב זרימה רציפה של תמיסת מלח. הוספת שלב הפולי-ל-ליזין מפחיתה את הסיכון לתנועות או אפילו לאובדן מוחי כתוצאה מהשטיפות.

3. לנתח את חוט העצבים הגחוני (VNC) ואת גופי השומן (FBs)

  1. אספו את הזחלים הנודדים מהצלב הגנטי הרצוי (משלב 1.7) ושטפו אותם ביסודיות 3 פעמים במים מזוקקים.
  2. הניחו את הזחלים בכלי דיסקציה מזכוכית המכיל 750 מיקרוליטר של אפס נומינלי Ca2+ תמיסת מלח קרה כקרח המורכבת מ-128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES ו-35 mM סוכרוז (pH = 6.7, נמדד עם מד pH והותאם עם 1 M NaOH ו-HCl 37% v/v).
    הערה: הגדרת ה- pH ל- 6.7 היא קריטית מכיוון שכפי שנצפה בעבר, הובלת מונוקרבוקסילט תלויה מאוד ב- pH של התמיסה. בנוסף, 6.7 מתאים ל- pH בהמולימפה של זחל כוכב שלישי17,18.
  3. מניחים את הזחל מתחת לסטריאומיקרוסקופ ומבצעים חתך רוחבי לאורך החלק האחורי של הבטן עם זוג מלקחיים.
  4. דחפו את הלסת עם המלקחיים תוך כדי הפיכת הזחלים מבפנים החוצה.
  5. שימו לב לחוט העצב הגחוני (VNC) ליד הלסת. בזהירות להסיר את הדיסקים הדמיוניים ואת רקמות המוח הנותרות.
  6. להפריד את VNC עם המוח המרכזי ואת האונות האופטיות משאר הרקמה על ידי חיתוך העצבים. העבירו את ה-VNC, הרימו אותו עם מלקחיים מהעצבים הנותרים, והניחו אותו בתא ההקלטה המכיל את תמיסת ההקלטה נטולת Ca2+ (אותו פתרון משלב 3.2). ה-VNCs ידבקו מיד בכיסויים.
  7. כדי למנוע הפרעה מהעצבים הנותרים, חברו אותם בתחתית הכיסוי באמצעות מלקחיים (העצבים יהיו גם פלואורסצנטיים בהתאם לקו הנהג שבו משתמשים) (איור 2).
  8. כדי לבצע ניסויים בגופי שומן (FBs) המודדים הובלת גלוקוז או מונוקרבוקסילט בסדרה אחרת של ניסויים, המשיכו לבודד את הרקמות בעקבות שלבים 3.1-3.4. ברגע שהזחלים הופכים מבפנים החוצה, שימו לב שה-FB הוא רקמה לבנה, דו-צדדית ושטוחה.
  9. מקם את ה- FBs המבודדים המבטאים את חיישני FRET (המתקבלים מצלב גנטי באמצעות מנהלי ההתקן המתאימים) בתא ההקלטה המכיל את פתרון ההקלטה ללא Ca2+.
    הערה: ה- FB הוא הידרופובי מאוד (הוא נוטה לצוף על פני השטח של התמיסה) ופגיע מאוד למניפולציה עם מלקחיים, יש לטפל בו בזהירות. כל טיפול גס ברקמה זו יגרום לתאים מתים מאוחר יותר (עם ירידה בפלואורסצנטיות של החיישנים).
  10. הניחו את תא ההקלטה המכיל VNCs/FBs על במת המיקרוסקופ.

4. הדמיה חיה של תאים

  1. כדי לקבל תמונות של חיישני ביטוי הרקמה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף המחובר למערכת פיצול פליטה ומצלמת CCD. הפעל את מערכת התאורה של המיקרוסקופ 30 דקות לפני תחילת כל ניסוי.
    הערה: כאן אנו משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי של דיסק מסתובב המצויד במטרה של טבילת מים 20x/0.5 כדי לצפות הן ב-VNCs והן ב-FBs. איור 2 מראה גם את השימוש ביעד טבילה במים של 40x/0.8.
  2. כדי להמחיש פלואורסצנטיות GCaMP6f, הגדר את אורכי גל העירור והפליטה על 488 ננומטר ו- 540 ננומטר, בהתאמה. עבור חיישנים לקוניים/פירוניים/ATP/גלוקוז, הגדר את אורך גל העירור ל-440 ננומטר ואת אורכי גל הפליטה ל-488 ננומטר (mTFP, CFP) ו-540 ננומטר (נוגה, YFP).
  3. קבל תמונות בגודל 512 x 512 פיקסלים כל 2 שניות עבור GCaMP6f וכל 10-30 שניות עבור חיישנים לקוניים/פירוניים/ATP/גלוקוז. קבע את החשיפה האופטימלית למקור האור תוך התבוננות באיכות התמונה המתקבלת. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, ודא שהתמונות הן של חשיפה של 300 אלפיות השנייה עבור חיישנים לקוניים ופירוניים ו- 100-150 מילישניות עבור חיישני הגלוקוז וה- ATP.
    הערה: החשיפה עשויה להשתנות בהתאם לשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי או רגיל.
  4. לאחר התקנת תא ההקלטה בשלב המיקרוסקופ, מקמו בזהירות את מטרת טבילת המים וודאו שהמטרה נשארת שקועה לאורך כל הניסוי. שמור על טמפרטורת החדר על 25 °C.
  5. חבר את תא ההקלטה למערכת זילוח ושמור על הרקמות שטופות בתמיסת הקלטה המכילה 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES ו- 35 mM סוכרוז, pH 6.7 (נמדד עם מד pH והותאם עם NaOH ו- HCl).
  6. שמור על זרימה קבועה של 3 מ"ל / דקה של תמיסת הקלטה דרך הרקמה באמצעות כוח הכבידה, יחד עם משאבה פריסטלטית בשטף נמוך כדי לחלץ את הנוזל מהתא תוך שמירה על נפח קבוע. כדי להשיג את הזרימה הנדרשת, מקם את הצינורות המכילים תמיסה (צינורות פלסטיק 50 מ"ל) 25 ס"מ מעל שלב המיקרוסקופ.
    הערה: זרימה מונעת כבידה זו משמשת למניעת תנועת רקמות הנגרמת על ידי משאבות פריסטלטיות, ומאפשרת ניתוח תמונה מדויק יותר בהמשך.
  7. לפני כל גירוי, שמור על זרימת פתרון ההקלטה במשך 5-10 דקות כדי לקבל בסיס יציב של פלואורסצנטיות מהחיישנים. שנה את משך הזמן לפי הצורך כדי להשיג תוכנית בסיסית זו.
  8. החלף את התמיסה הזורמת בתמיסת הגירוי למשך 5 דקות כדי לעורר את VNC/FBs (עם גלוקוז, פירובט או לקטט בריכוז המתואר עבור כל ניסוי מומס בתמיסת מלח; ראה כל איור).
    הערה: משך הגירוי יכול להשתנות בהתאם לצרכי הניסוי (לדוגמה, ניתן להגדיל את פעימות הגלוקוז ל -10 דקות כדי להגיע לרמה בנוירונים, כפי שדווח בעבר16).
  9. כדי לשמור על אוסמולריות בתמיסת הגירוי, תקן את ריכוז הסוכרוז (פחמימה שאינה ניתנת לחילוף חומרים על ידי מוח הדרוזופילה ) על פי ריכוז המונוקרבוקסילט או הגלוקוז שנוסף.
  10. שנה את הפתרונות באמצעות מערכת פשוטה של שסתומים. היזהרו לא להזיז את שלב המיקרוסקופ.
  11. חשוף את VNC 80 מיקרומטר picrotoxin (PTX, זורם ברציפות) כדי לעורר פעילות עצבית. הליך זה מגביר את התדירות של תנודות Ca2+ , ומאפשר לצפות בשינויים במולקולות רלוונטיות מטבולית (למשל, ATP תוך תאי).
  12. בסוף כל ניסוי, שטפו היטב את מערכת הזרימה המלאה, כולל הצינורות ותא ההקלטה, למשך 10 דקות לפחות עם תמיסת המלח ועוד 10 דקות עם מים מזוקקים כדי לחסל כל זכר לתמיסות בהן נעשה שימוש.

5. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. כדי לעבד את התמונות שהתקבלו, המשיכו בשלבים המוצגים באיור 3.
  2. ייבא את התמונה (לקונית) לתוכנת ImageJ. לתמונה יש שתי תצוגות של המדגם: השמאלית היא אות mTFP וזו מימין היא אות נוגה. בחר אזור הכולל את התאים לניתוח והפרד תמונות אלה (mTFP ו- Venus) בחלון חדש. ודא שתמונות אלה כוללות בדיוק את אותו אזור.
  3. פתח את תוסף הרישום ותקן את הסחף הקטן של הרקמה שנצפה בדרך כלל בניסוי עם הגוף הנוקשה של הפונקציה. בצעו זאת בשתי התמונות (mTFP ו-Venus).
  4. בחר לפחות 10 אזורי עניין (ROIs) בציטוזול של 10 התאים המתאימים באות mTFP (488 ננומטר) והעבר את הבחירות לתמונת ונוס (540 ננומטר).
  5. בחר שניים או שלושה ROI קרוב לתאים המנותחים אך ללא אות מובחן (תמיד בתוך VNC או רקמה מנותחת, ראה איור 3). אלה הם החזרי ההשקעה ברקע.
  6. כאשר החזר ההשקעה נבחר בשתי התמונות, קבל את הערך האפור הממוצע של כל אות באמצעות מדד הפונקציה. העבר את הנתונים לגליון נתונים והפחת את ערך הרקע הממוצע עבור כל אות.
  7. קבע את יחס הפלואורסצנטיות mTFP מעל ונוס (עבור לקוני ופירוני). ערך זה מחושב באופן שונה מחיישני FRET אחרים המתוארים כאן (כאשר היחס הוא בדרך כלל YFP/CFP) מכיוון שכאשר הם קשורים למצעים המתאימים שלהם, הן לקונית והן פירונית מפחיתות את יעילות ה- FRET שלהם.
  8. נרמול הנתונים המחלקים כל ערך נרשם בקו הבסיס. בגיליון נתונים נפרד, חשב את קו הבסיס על ידי לקיחת הערך הממוצע של יחס mTFP/ונוס במהלך 2 הדקות שקדמו לגירוי.
  9. עבור מדידות הסוכר וה-ATP באמצעות חיישנים מבוססי FRET, חשב את יחס YFP/CFP ונמל את הנתונים כמתואר בשלב 5.8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במשך עד שעה אחת, הליך זה מאפשר מדידה קלה של שינויים תוך תאיים בפלואורסצנטיות של חיישני מונוקרבוקסילט וגלוקוז. כפי שניתן לראות באיור 4, חיישנים לקוניים הן בתאי גלייה והן בתאי עצב מוטוריים מגיבים ללקטט של 1 מילימטר בקצב דומה בתחילת הדופק, אולם תאי עצב מוטוריים מגיעים לעלייה גבוהה יותר מעל קו הבסיס במהלך פעימת 5 דקות, כפי שהודגם קודם לכן17. ריכוז לקטט זה נבחר מכיוון שהוא דומה לרמות הנמצאות בהמולימפה של זחלי כוכב שלישי. באופן דומה, כאשר חיישני גלוקוז המבטאים VNC נחשפו לגל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השימוש במודל דרוזופילה לחקר חילוף החומרים במוח הוא חדש יחסית26, והוכח כי הוא חולק מאפיינים רבים יותר עם מטבוליזם של יונקים מהצפוי, אשר נחקר בעיקר במבחנה בתרביות נוירונים ראשוניות או בפרוסות מוח. דרוזופילה מצטיינת בניסויי in vivo הודות לסוללת הכלים הגנטיים והחיישנים המקודדים גנטית הזמינים המאפשרים לחוקרים לדמיין בזמן אמת את השינויים המטבוליים הנגרמים על ידי פעילות מושרית או אפילו בתגובה לגירוי חושי.

הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד למדוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.

תודות

אנו מודים לכל חברי מעבדת Sierralta. עבודה זו נתמכה על ידי FONDECYT-Iniciación 11200477 (ל- AGG) ו- FONDECYT Regular 1210586 (ל- JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (חיישן סוכר) נתרם באדיבות על ידי פייר-איב פלסאיס ותומס פראט, CNRS-פריז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgaroseSigmaA9539
CaCl2SigmaC3881
CCD מצלמה ORCA-R2Hamamatsu-Cell-R
תוכנה
בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר7011נהג גוף שמן
Dumont # 5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11252-30
מערכת פיצול פליטת DV2זכוכית פוטומטריים
(קוטר 25 מ"מ)Marienfeld111650גרמניה
גלוקוזSigmaG8270
GraphPad פריזמהתוכנת GraphPadגרסה 8,0,2
תוכנת HEPESSigmaH3375
ImageJמכוני הבריאות הלאומייםגרסה 1,53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x/0.8 מטרת טבילה במיםOlympus-Methylparaben
SigmaH5501
MgCl2SigmaM1028
NaClSigmaS7653
OK6-GAL4בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטרנוירונים מוטוריים
פיקרוטוקסיןסיגמאP1675S<חזק>זהירות-קטלני אם נבלע
פולי-L-ליזיןסיגמאP4707
חומצה פרופיוניתסיגמאP1386
Repo-GAL4בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר7415נהג תאי גליה (הכל)
נתרן לקטטסיגמא71718
נתרן פירובטסיגמאP2256
מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיסק מסתובב BX61WIאולימפוס-סוכרוז
סיגמאS0389
טרהלוזארה"ב ביולוגיT8270
UAS-AT1.03NL מרכז המניות קיוטו דרוזופילה117012חיישן ATP
UAS-CHK RNAi GD1829מרכז המשאבים של וינה דרוזופילהv37139קו Chk RNAi
UAS-FLII12Pglu700md6 בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר93452חיישן גלוקוז
UAS-GCaMP6f בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר42747חיישן סידן
UAS-לקוניSierraltaLab-Lactate חיישן
UAS-פירוניפייר איב פלאקאיס/תומאס פראט-CNRS-פריז
UMPlanFl 20x/0.5 מטרת טבילה במיםאולימפוס-
אולימפוס-CG-GAL4 כיסויי

מקורות

  1. Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
  2. Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
  3. Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
  4. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  5. Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
  6. Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
  7. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
  8. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  9. Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
  10. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  11. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  12. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
  13. San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
  14. Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  15. Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
  16. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
  17. Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
  18. Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
  19. Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
  20. McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
  21. Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  22. Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
  23. Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
  24. Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
  25. Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
  26. De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
  27. Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).
  28. Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
  29. Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
  30. Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRETex vivo

מאמרים קשורים