אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
רגנרציה של תאים קולטי אור באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא טיפול מבטיח לטיפול במחלות רשתית תורשתיות והזדקנות בשלבים מתקדמים. הראינו שמטריצת איזופורם למינין ספציפית לרשתית רקומביננטית אנושית מסוגלת לתמוך בהתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לאבות קולטי אור. בנוסף, הזרקה תת-רשתית של תאים אלה הראתה גם שיקום חלקי במודלים של מכרסמים וארנבים rd10 . הזרקה תת-רשתית ידועה כשיטה מבוססת המשמשת להעברת תרכובות פרמצבטיות לתאי קולטני האור ולשכבת אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) של העין בשל קרבתה לחלל המטרה. הוא שימש גם להעברת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו לחלל התת-רשתית לטיפול במחלות רשתית. ההעברה התת-רשתית של תרכובות ותאים פרמצבטיים במודל מורין מאתגרת בשל האילוץ בגודל גלגל העין של מורין. פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט להכנת תאי אב קולטני אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (hESC) להזרקה ואת טכניקת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי רטיניטיס פיגמנטוזה גנטיים, עכברי RD10 . גישה זו מאפשרת טיפול תאי לאזור הממוקד, במיוחד לשכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית, שם מתרחשות מחלות המובילות לניוון קולטני אור.
מבוא
מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)1. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)4,5,6,7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הניסויים in vivo נעשו בהתאם להנחיות ולפרוטוקול שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של SingHealth (IACUC) והצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הגורים עברו דיכוי חיסוני מ-P17 (לפני ההשתלה) ל-P30 (לאחר ההשתלה) על ידי האכלתם במי שתייה המכילים ציקלוספורין (260 גרם לליטר).
1. הכנת יום 32 hESC אב photoreceptor נגזר לאחר cryopreservation
- מדיום התמיינות פוטורצפטור טרום חם (PRDM) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- אחזור קריוביאל המכיל תאי אב פוטורצפטור שמקורם ביום 32 hESC מחנקן נוזלי. יש לשמור על קרח יבש.
- הפשיר את cryovial ב 37 ° C באמבט ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מזרק הזכוכית בגודל 10 μL הורכב בהתאם להוראות היצרן (איור 1), והמחט הקהה ששימשה להעברת התרחיף/מדיה של התא מוצגת באיור 1B. גישות שונות להזרקה תת-רשתית מודגמות באיור 2. אנו מתארים את גישת pars plana בפרוטוקול הזה (איור 2C). המחט הקהה שהורכבה על מזרק זכוכית הוחדרה דרך פצע סקלרוטומי וניגשה לחלל התת-רשתית ברחבי העולם. כפי שניתן לראות באיור 3A, מסלול המחט, החדירה דרך הרשתית והעברת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההזרקה התת-רשתית שימשה להשתלת תרחיף תאים לטיפול ב-RPE ובמחלות רשתית 23,25,26,27,28,31,40. גישה זו חיונית ביותר במחקרי מכרסמים לא רק עבור השתלות תאים וגישות ריפוי גנטי, אלא גם כדי להעריך תרכובות טיפוליות חדשניות למחלות רשתית. כיום, שלושה מסלולים עיקריים משמשים להעברת תאים או AAVs לחלל התת-רשת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
Hwee Goon Tay הוא מייסד שותף של Alder Therapeutics AB. מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים ל-Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ו-Yingying Chung על מתן סיוע טכני להכנת 32 אבות קולטני אור שמקורם ב-HESC לאחר שימור בהקפאה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למחקר רפואי לחוקר צעיר (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ומענק תוכנית המחקר התחרותיתה-24 של הקרן הלאומית למחקר (CRP24-2020-0083) ל-H.G.T.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
36
ראה הרכב מדיה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.3% טוברמיצין | נוברטיס | NDC 0078-0813-01 | טוברקס (3.5 גרם) |
| 0.3% טוברמיצין ו-0.1% דקסמתזון | נוברטיס | NDC 0078-0876-01 | טוברדקס (3.5 גרם) |
| 0.5% פרופרקאין הידרוכלוריד | אלקון | NDC 0998-0016-15 | 0.5% אלקאין (15 מ"ל) |
| 1 מ"ל מזרק טוברקולין | טורמו | SS01T2713 | |
| 1% טרופיקמיד | אלקון | NDC 0998-0355-15 | 1% מידריאציל (15 מ"ל) |
| 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד | אלקון | NDC 0998-0342-05 | 2.5% מידפרין (5 מ"ל) |
| צלחת תרבית רקמות 24 בארות | Costar | 3526 | |
| 30 גרם מחט חד פעמית | בקטון דיקינסון (BD) | 305128 | |
| 33 גרם, מחטים קהות באורך 20 מ"מ | המילטון | 7803-05 | |
| מונה תאים אוטומטי | NanoEnTek | דגם: איב | |
| B27 ללא ויטמין A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | וטרינר וטרינרי (0.3 מ"ג/מ"ל) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 ומיקרו; M36 |
| ציקלוספורין | נוברטיס | 260 גרם/ליטר במי שתייה | |
| יום 32 תאי אב קולטני אור שמקורם ב-hESC | בית הספר לרפואה DUKE-NUS תאי | גזע עובריים אנושיים מתמיינים במשך 32 יום. ראה פרוטוקול באסמכתא 36. | |
| גזה | ווינר תעשיות בע"מ | 1SNW475-4 | |
| גלזגו מינימום חיוני בינוני | Gibco | 11710&ndash– 035 | |
| hESC קו תאים H1 | מכון המחקר WiCell | WA01 | |
| גורם נוירוטרופי שמקורו במוח אנושי (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| גורם נוירוטרופי ריסני אנושי (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 ומיקרו; g36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| מזרק זכוכית מיקרוליטר (10 מ"ל) | המילטון | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-פנילגליצין t-בוטיל אסטר (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 ומיקרו; תוסף M36 |
| N-2 | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| מיקרוסקופ הפעלה | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | עם פונקציית iOCT מובנית |
| PRDM (מדיום התמיינות קולטני אור, 50 מ"ל) | בית הספר לרפואה DUKE-NUS | בינוני בסיסי, 10 ומיקרו; M DAPT, 10 ננוגרם/מ"ל BDNF, 10 ננוגרם/מ"ל CNTF, 0.5 ומיקרו; M חומצה רטינואית, 2% B27 ו-1% N2. מדיום בסיסי: 1x GMEM, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.1 מ"מ B-מרקפטואתנול, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA). | |
| פירובט | גיבקו | 11360– 070 | 1 mM36 |
| Rd10 עכברי | מעבדת ג'קסון | B6. עכברי CXB1-Pde6brd10/J | מין: זכר/נקבה, גיל: P20 (זריקה), משקל: 3-6 גרם |
| חומצה רטינואית | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 ומיקרו; M36 |
| תלוש כיסוי עגול (12 מ"מ) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 & ג'ל M36 |
| Vidisic (10 גרם) | ד"ר גרהרד מאן | ||
| קסילזין הידרוכלוריד (20 מ"ג/מ"ל) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985– 023 | 0.1 מ"מ36 |
מקורות
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
