העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)¹. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)^2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)^4,5,6,7,8 שימשו לשחזור תאי קולטני האור הפגועים. החלל התת-רשתית, חלל מוגבל בין הרשתית ל-RPE, הוא מיקום אטרקטיבי להפקדת תאים אלה כדי להחליף תאים קולטי אור פגומים, RPE ותאי מולר בשל קרבתו ^9,10,11.

טיפולים גנטיים ותאיים מנצלים את החלל התת-רשתית לרפואה רגנרטיבית למחלות רשתית שונות במחקרים פרה-קליניים. זה כולל משלוח עותקים פונקציונליים של הגן או כלי עריכת הגנים בצורה של טיפול אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס ^12,13 או CRISPR/Cas9 או עריכה בסיסית באמצעות אסטרטגיה מבוססת וירוס הקשור לאדנו (AAV) 14,15,16, השתלת חומרים (למשל, גיליון RPE, תותבות רשתית 17,18,19) ואורגנואידים רשתית ממוינים שמקורם בתאי גזע ^20,21,22 לטיפול במחלות רשתית ו- RPE. ניסויים קליניים באמצעות hESC-RPE³¹ בחלל התת-רשתית לטיפול באמאורוזיס מולד Leber הקשור ל-RPE65 (LCA)^23,24, אכרומטופסיה^{25-מקושרת} CNGA3, רטיניטיס פיגמנטוזה²⁶ הקשורה ל-MERTK, כורואידרמיה 27,28,29,30 הוכחו כגישה יעילה. הזרקה ישירה של תאים לקרבת האזור הפגוע משפרת מאוד את הסיכוי להתיישבות תאים באזור המתאים, אינטגרציה סינפטית, ובסופו של דבר שיפור חזותי.

למרות שהזרקה תת-רשתית במודלים אנושיים ובעלי עיניים גדולות (כלומר, חזיר 32,33,34,35, ארנב 36,37,38,39,40 ופרימט לא אנושי 41,42,43) הוקמה, הזרקה כזו במודל מורין עדיין מאתגרת בשל האילוץ של גודל גלגל העין ועצום עדשה הכובשת את עין העכבר 44,45,46. עם זאת, מודלים מהונדסים גנטית זמינים רק בבעלי חיים קטנים ולא בבעלי חיים גדולים (כלומר, ארנבים ופרימטים לא אנושיים), ולכן הזרקה תת-רשתית בעכברים מפנה את תשומת הלב לחקר גישות טיפוליות חדשניות בהפרעות גנטיות ברשתית. שלוש גישות עיקריות משמשות להעברת תאים או AAV לחלל התת-רשתית, כלומר המסלול הטרנס-קרני, המסלול הטרנס-סקלרלי ומסלול הפארס פלנה (ראו איור 2). מסלולים טרנס-קרניים וטרנס-סקלרליים קשורים להיווצרות קטרקט, סינכיה, דימום כורואידי וריפלוקס מאתר ההזרקה 11,44,45,47,48,49. אימצנו את גישת pars plana כהדמיה ישירה של תהליך ההזרקה, וניתן להשיג את אתר ההזרקה בזמן אמת תחת המיקרוסקופ.

לאחרונה תיארנו שיטה שיכולה להתמיין תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) לאבות קולטי אור בתנאים נטולי קסנו, המוגדרים כימית באמצעות איזופורם למינין LN523 ספציפי לרשתית אנושית רקומביננטית. מאחר שנמצא כי LN523 נמצא ברשתית, שיערנו כי ניתן לשחזר את נישת המטריקס החוץ-תאי של הרשתית האנושית במבחנה ובכך לתמוך בהתמיינות קולטני האור מתאי גזע עובריים עובריים³⁶. ניתוח תעתיק חד-תאי הראה כי אבות קולטי אור המבטאים במשותף הומיאובוקס מוט חרוט ומחלימים נוצרו לאחר 32 יום. מודל עכבר מוטנטי של ניוון רשתית 10 (rd10) המחקה רטיניטיס פיגמנטוזה אנושית אוטוזומלית שימש להערכת היעילות של 32 hESC שמקורם באבות פוטורצפטור in-vivo. תאי האב של קולטני האור שמקורם ב-hESC הוזרקו לחלל התת-רשתית של עכברי RD10 ב-P20, שם תפקוד לקוי של קולטני האור והתנוונותו נמשכים³⁶. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת אבות קולטי אור שמקורם ב- hESC לאחר הקפאה והעברה לחלל התת-רשתית של עכברי rd10 . שיטה זו יכולה לשמש גם למתן AAVs, תרחיפים תאים, פפטידים או כימיקלים לתוך החלל התת-רשתית בעכברים.

הניסויים in vivo נעשו בהתאם להנחיות ולפרוטוקול שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של SingHealth (IACUC) והצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הגורים עברו דיכוי חיסוני מ-P17 (לפני ההשתלה) ל-P30 (לאחר ההשתלה) על ידי האכלתם במי שתייה המכילים ציקלוספורין (260 גרם לליטר).

1. הכנת יום 32 hESC אב photoreceptor נגזר לאחר cryopreservation

1. מדיום התמיינות פוטורצפטור טרום חם (PRDM) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
2. אחזור קריוביאל המכיל תאי אב פוטורצפטור שמקורם ביום 32 hESC מחנקן נוזלי. יש לשמור על קרח יבש.
3. הפשיר את cryovial ב 37 ° C באמבט מים במשך 3-5 דקות. השהה מחדש את היום 32 תאים ב 1 מ"ל של PRDM וצנטריפוגה ב 130 x גרם במשך 4 דקות.
4. הסר את supernatant ו resuspend תאים ב 1 מ"ל של PRDM.
5. מוציאים 10 μL מהתערובת לספירת תאים. יש לערבב תאים באמצעות 0.2% טריפאן כחול בהתאם להוראות היצרן. תערובת תאי פיפטה לתוך תא ספירת התאים מחליק. קבע את מספר התא ואת הכדאיות על-ידי מונה תאים אוטומטי.
6. המשך לשלב הבא כאשר כדאיות התא היא מעל 70%. צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 130 x גרם במשך 4 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב PRDM בריכוז של 3 x 10⁵ תאים / μL להשתלה.
7. שימו לב לגושי תאים גלויים. יש להשהות מחדש גושי תאים שוב ושוב באמצעות קצה פיפטה של 10 μL בצינור המיקרופוגה עד שלא נצפה גוש תאים נראה לעין. טען לתוך מזרק הזרקת 33G כדי לצפות עבור אקסטרוזיה של תמיסת התא דרך המחט.

2. העברה תת-רשתית של תאי גזע עובריים עובריים בעכברי RD10

1. הכנת בעלי החיים
   1. מרדימים את העכבר (P20, זכר/נקבה, 3-6 גרם) באמצעות שילוב של קטמין (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף) במזרק שחפת 1 מ"ל המחובר למחט 27G בגישה תוך צפקית. מתן זריקה תת עורית של buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) לעכבר כמו משכך כאבים מונע.
   2. לאחר מתן ההרדמה, להחדיר טיפה כל אחד של 1% tropicamide ו 2.5% phenylephrine להרחבת האישון. החל ג'ל עיניים על הקרנית כדי למנוע מהעין יובש וקטרקט הקשור להרדמה.
   3. הניחו את העכבר בכלוב ריק עד להרדמה מלאה. להעריך את רמת ההרדמה הנכונה על ידי צביטת כרית הכף ולאשר אם החיה אינה מגיבה לצביטה הקשה.
   4. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, הניחו את בעל החיים על כרית חמה שנקבעה ב 38 מעלות צלזיוס.
2. העברה תת-רשתית של התאים
   1. כדי להשתמש בגישה trans-vitreal pars plana עם יציאה אחת, כפי שנעשה כאן, בצע הזרקה תת-רשתית בסביבה סטרילית. השתמש במיקרוסקופ הפעלה זקוף עם נתיב אור ישיר כדי לבצע את ההזרקה.
   2. הכינו את מזרק הזכוכית 10 μL על ידי הסרת רכזת המחט. הרכיבו את המחט הקהה 33G על מזרק הזכוכית. קח את מכסה רכזת המתכת וחבר בזהירות את המחט על המזרק.
   3. יש לשטוף במים מזוקקים כדי לבדוק אם יש סימני דליפה ופטנט של המחט. רוקנו את המזרק והניחו אותו בצד בזהירות.
   4. הניחו את העכבר המרדים על כרית, כאשר העין המטפלת מביטה היישר אל מטרת המיקרוסקופ. החל את 0.5% proparacaine hydrochloride ולחכות 30 שניות. החל 150 μL של ג'ל עיניים על העין ומניחים כיסוי עגול להחליק על זה.
   5. בצע בדיקה גסה של העין על ידי התבוננות בקרנית, הקשתית, האישון, העדשה והלחמית. דרך האישון, דמיינו את הפונדוס של עין העכבר על ידי התאמת מישור המוקד. כוונן את הראש עד שראש הראייה ממוקם במרכז האישון וצמצם את תנועת הראש על ידי מיקום נכון על הכרית.
   6. הקש בעדינות על בסיס הצינור עם תאי גזע עובריים מספר פעמים כדי לקבל מתלה תאים אחיד. על ידי שימוש מזרק מיקרוליטר זכוכית 10 μL עם מחט קהה 33G, למשוך 2 μL של תאים/מדיה. משכו את התאים ממש לפני ההזרקה כדי למנוע התיישבות תאים/גושים במזרק.
   7. באמצעות מחט חד פעמית 30G, לעשות פצע סקלרקטומיה 2 מ"מ מאחורי הלימבוס. שמור על זווית המחט על ~ 45° כדי למנוע נגיעה בעדשה. לאחר קצה המחט הוא דמיינו בעין, בעדינות למשוך את המחט. יש להשליך את המחט לפח החד לאחר השימוש כדי למנוע פגיעה בדקירת המחט.
   8. קח את מזרק הזכוכית והכנס את המחט הקהה לתוך פצע סקלרקטומיה. מבלי לגעת בעדשה, מקדמים את המחט הקהה עד שהיא מגיעה לרשתית הנגדית של פצע הכניסה. ודא שאזור ההזרקה נקי מכלי דם מרכזיים ברשתית כדי למנוע דימום.
   9. חודרים בעדינות לרשתית עד שנראה ענף לחץ על לובן העין. שמור את הקצה הקהה של המחט במקביל לובן העין כדי למנוע דליפה של התאים לתוך חלל הזגוגית.
   10. הזריקו באיטיות 2 מיקרוליטר של תרחיף תאים או מדיה PRDM (בקרה) לחלל התת-רשתית תוך שמירה על לחץ עדין על המזרק. עם זריקה מוצלחת, bleb גלוי (כלומר, רשתית מוגבהת עם מתלה התא / מדיה בתוכה) צריך להיווצר במקום ההזרקה.
       הערה: יש להשתמש רק בלחץ עדין במהלך ההזרקה כדי למנוע קריעה ברשתית וחסימה של התאים בקצה המחט.
   11. לאחר אישור bleb, לחכות 10 שניות כדי לתת לתאים להתיישב. משכו בעדינות את המחט מהעין.
3. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית תוך ניתוחית (OCT) סריקה של bleb (אופציונלי)
   1. מקם את עין העכבר כדי לדמיין את הפצע מתחת למיקרוסקופ על ידי הזזת הראש באיטיות. אבטח את התנוחה על ידי החזקת הראש בעדינות. אין צורך בהרחבת אישונים נוספת. אין להסיר את החלקת הכיסוי ואת הג'ל על העין. זה נותן מדיה אופטית ברורה כדי לדמיין את bleb.
   2. בצע OCT תוך ניתוחי באמצעות פונקציית iOCT המובנית של מיקרוסקופ ההפעלה.
   3. לחץ על האפשרות קוביה במסך OCT ומקם את אזור הסריקה על ה- bleb על ידי לחיצה על לחצני החץ . התאם את ה-OCT על-ידי הזזה מרכוז ומיקוד לקבלת איכות OCT מיטבית. לחץ על לכידה/סריקה כדי לקבל את סריקת OCT של אזור ה-bleb. סקור את התמונות כדי לבדוק את איכות הסריקות.
4. שחזור
   1. הסר את הכיסוי להחליק ולנקות את הג'ל מן העין עם גזה. יש למרוח משחה אנטיביוטית פעם אחת לאחר ההזרקה כדי למנוע זיהום.
   2. לאפשר לבעל החיים להתאושש מהרדמה תחת אור חם עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולחזור לכלוב הביתי. יש לעקוב אחר בעל החיים במשך 3 ימים לפחות לאחר ההזרקה לאיתור סימני דלקת, זיהום ומצוקה.
      הערה: האור החם של 150 ואט צריך להיות במרחק של לפחות 30 ס"מ מכלוב בעלי החיים, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה בכוויה.
   3. יש לבצע זריקה תת עורית של בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) 8 שעות למשך יום אחד או לפי המלצת הווטרינר. אם נצפתה דלקת או זיהום בעין, יש להתייעץ עם וטרינרי מקצועי לקבלת טיפול מתאים.
5. ניקוי ועיקור המכשירים
   1. שטפו את מזרק המיקרוליטר מזכוכית 10 μL ואת המחט הקהה 33G באתנול 100% 10x. שטפו את האתנול על ידי הבהוב המזרק במים מזוקקים.
   2. מפרקים את מזרק הזכוכית ואת המחט. יבש את המזרק לאחסון.

מזרק הזכוכית בגודל 10 μL הורכב בהתאם להוראות היצרן (איור 1), והמחט הקהה ששימשה להעברת התרחיף/מדיה של התא מוצגת באיור 1B. גישות שונות להזרקה תת-רשתית מודגמות באיור 2. אנו מתארים את גישת pars plana בפרוטוקול הזה (איור 2C). המחט הקהה שהורכבה על מזרק זכוכית הוחדרה דרך פצע סקלרוטומי וניגשה לחלל התת-רשתית ברחבי העולם. כפי שניתן לראות באיור 3A, מסלול המחט, החדירה דרך הרשתית והעברת התאים נוטרו ישירות מתחת למיקרוסקופ בעת ביצוע ההזרקה. העברה מוצלחת של תאים/מדיה אושרה על-ידי התבוננות בבלב באתר ההזרקה (איור 3B). ניתן לזהות כלב מוצלח כצבע לבנבן בהיר הדומה לבלון מים. לידה כושלת נצפית על ידי דליפה של התאים / מדיה לתוך חלל הזגוגית באתר ההזרקה ואי יצירת bleb. סריקת OCT בוצעה באזור המוזרק, והסריקה הראתה תאי גזע עובריים עובריים בודדים צפים בעין שטופלה בתאים (איור 4A), בעוד שהעין שטופלה במדיה הראתה נוזל צלול ללא תאים בחלל התת-רשתית (איור 4B). תאי גזע עובריים (hESC) אינדיבידואליים מזוהים כחומרים היפררפלקטיביים המפוזרים בחלל התת-רשתית (איור 4A). שיעור ההצלחה של הזריקה חושב על ידי ציון מספר העיניים עם היווצרות מוצלחת של bleb. כללנו במעבדה שלנו את היישומים שאימצו גישה זו ואת אחוזי ההצלחה של הזריקות (טבלה 1).

איור 1: מכשירים שבהם נעשה שימוש במהלך ההזרקה. (A) מזרק זכוכית 10 μL מורכב עם מחט קהה 33G. (B) תמונת זום אין של המחט הקהה 33G. (ג) כרית שעליה יוכל להניח את ראשו של בעל החיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מסלולים שונים של הזרקה תת-רשתית. (A) מסלול טרנס-קרני: מחט ההזרקה עוברת דרך הקרנית והאישון כדי להיכנס לחלל התת-רשתית. (B) מסלול טרנס-סקלרלי: המרחב התת-רשתית נגיש ישירות דרך הסקלרה. (C) מסלול Pars plana: מחט ההזרקה מוחדרת לחלל הזגוגית דרך חתך בלימבוס. המחט מגיעה לחלל התת רשתית על ידי חדירה לרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות פונדוס של העין במהלך ההזרקה התת-רשתית. (A) לפני ביצוע ההזרקה התת-רשתית, ניתן היה לראות את קצה המחט בחלל הזגוגית נוגע ברשתית, תוך הימנעות מכלי הדם העיקריים ברשתית. (B) לאחר ההזרקה התת-רשתית, נוצר כתם גלוי במקום ההזרקה (קו צהוב מקווקו). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סריקות OCT תוך ניתוחיות של העיניים המוזרקות. הסריקות נעשו מיד לאחר ההזרקה. (A) תאי גזע עובריים שטופלו בעין: הפאנל העליון הראה את מיקום סריקת OCT (קווי חתך ציאן וורודים) על העין; תאי גזע עובריים נצפו בעין המטופלת בחלל התת-רשתית (קו מקווקו צהוב, פאנל אמצעי ותחתון). (B) עין שטופלה במדיה: הפאנל העליון הראה את מיקום סריקת OCT (קווי חתך ציאן וורודים) על העין; נוזל צלול ללא תאים נצפה בחלל התת-רשתית בעין המוזרק במדיה (קו מקווקו צהוב, פאנל אמצעי ותחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שיעור ההצלחה של הזרקה תת-רשתית ביישומים שונים.

Hwee Goon Tay הוא מייסד שותף של Alder Therapeutics AB. מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.