ניתוח מרחבי ברזולוציה גבוהה של רמות ביטוי גנים בגידים

Steffany Villaseñor; Mor Grinstein

doi:10.3791/65852

מאמר שיטה

ניתוח מרחבי ברזולוציה גבוהה של רמות ביטוי גנים בגידים

737 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65852

⸱

8 במרץ 2024

Steffany Villaseñor¹ , Mor Grinstein¹^,²^,³

¹Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Harvard Stem Cell Institute, ³Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר כיצד לבצע פרוטוקול אופטימלי באתרו עבור גידים. שיטה זו דנה בהכנת רקמות, חדירות חתך, תכנון בדיקה ושיטות הגברת אותות.

תקציר

בשנים האחרונות פותחו פרוטוקולים רבים לתעתיק ברזולוציה גבוהה בתחומים רבים ושונים של רפואה וביולוגיה. עם זאת, רקמות עשירות במטריצה, ובמיוחד גידים, נותרו מאחור בשל מספר התאים הנמוך שלהם, כמות ה-RNA הנמוכה לתא ותכולת המטריצה הגבוהה, מה שהפך אותם למסובכים לניתוח. אחד הכלים האחרונים והחשובים ביותר של תא בודד הוא ניתוח מרחבי של רמות ביטוי גנים בגידים. לכלים מרחביים אלה של RNA יש חשיבות גבוהה במיוחד בגידים לאיתור תאים ספציפיים של אוכלוסיות חדשות ולא ידועות, לאמת תוצאות RNA-seq של תא בודד ולהוסיף הקשר היסטולוגי לנתוני ה-RNA-seq של תא בודד. שיטות חדשות אלו יאפשרו ניתוח RNA בתאים בעלי רגישות יוצאת דופן וזיהוי מטרות RNA של מולקולה בודדת ברמת התא הבודד, מה שיסייע לאפיין מולקולרית גידים ולקדם את חקר הגידים.

במאמר שיטה זה, נתמקד בשיטות הזמינות לניתוח רמות ביטוי גנים מרחביות בחתכים היסטולוגיים על ידי שימוש במבחני הכלאה חדשניים באתרם כדי לזהות RNA מטרה בתוך תאים שלמים ברמות תא בודד. ראשית, נתמקד כיצד להכין את רקמת הגיד לבדיקות השונות הזמינות וכיצד להגביר אותות ספציפיים למטרה ללא רעשי רקע אך עם רגישות גבוהה וסגוליות גבוהה. לאחר מכן, המאמר יתאר שיטות חדירה ספציפיות, עיצובי הבדיקה השונים ואסטרטגיות הגברת האותות הקיימות כיום. שיטות ייחודיות אלו לניתוח רמות שעתוק של גנים שונים ברזולוציה של תא בודד יאפשרו זיהוי ואפיון של תאי רקמת הגיד באוכלוסיות צעירות ומבוגרות של מודלים שונים של בעלי חיים ורקמות גידים אנושיות. שיטה זו תסייע גם בניתוח רמות ביטוי גנים ברקמות עשירות במטריצות אחרות כגון עצמות, סחוס ורצועות.

מבוא

גידים הם רקמות חיבור המאפשרות העברת כוח בין שריר לעצם¹. מבחינה התפתחותית, טנוציטים ציריים נגזרים מתאים מזנכימליים בתוך הסקלרוטום של הסומיטים²; גידי הגפיים נובעים מהמזודרם של הצלחת הרוחבית; וגידים גולגולתיים נובעים משושלת הפסגה העצבית הגולגולתית ^3,4. ניתן לאפיין את הגיד על ידי ביטוי של גורם השעתוק של סקלרקסיס⁵, אם כי מספר סמנים ממלאים גם תפקיד מפתח בהתפתחות הגידים, כולל טנומודולין, מוהוק ותגובת גדילה מוקדמת 1/2 6,7,8,9.

למרות הסמנים המעטים הידועים של הגיד, באופן כללי, אפיון מעמיק יותר נותר מאתגר מכיוון שהגיד מכיל תאים המשתרעים על פני שיפוע של תכונות ביומכניות. מהצומת המיוטנדינית, אמצע הגיד באמצע הגוף והאנטזה המסוידת יותר, תאי הגיד שוכנים במטריצות חוץ-תאיות הנעות בתכונות מתיחה. מכיוון שהגיד חייב לעמוד במתח מתיחה המוטל על ידי ההבדל בחוזק המכני בין רקמה רכה וקשה, הארגון המרחבי של התאים בגיד חשוב במיוחד לתפקודו. עם זאת, מעט ידוע על תת-אוכלוסיות גידים אלה.

ניתן להשתמש בכלים טרנסקריפטומיים מרחביים רבים ברזולוציה גבוהה כדי להתחיל להבהיר תת-אוכלוסיות תאים, כולל אך לא רק, RNA Seq של תא בודד או הכלאה באתר . עם זאת, בעוד שמבחני פרופיל מרחבי אלה עוזרים לחשוף ביטוי RNA על פני רקמה לאחר מיקרו-דיסקציה או חתך, שיטות אלו יכולות להיות מאתגרות כאשר הן מבוצעות על רקמת הגיד. גידים הם רקמות עשירות במטריקס המורכבות מכמעט 86% קולגן במסה יבשה¹⁰, מה שמקשה על חילוץ התאים לריצוף. בשל הסיבוכים בבידוד תאים מהמטריצה, האופי ההיפו-תאי של גיד¹¹ וספירת ה-RNA הנמוכה יחסית, הגיד הוא רקמה קשה לניתוח.

במאמר זה, אנו מציגים שיטה לאופטימיזציה של מבחני הכלאה חדשניים באתרם כדי למנף אותם לגידים על ידי מתן שיטות הכנת רקמות, חדירות ותכנון בדיקה. בשילוב עם טכנולוגיות ריצוף קיימות, זה עשוי לעזור לחוקרים לאפיין מרחבית תת-אוכלוסיות של גידים על פני גידים מתפתחים, בוגרים או פצועים עם רגישות וספציפיות מוגברת לבדיקה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ו-AAALAC. הניסויים בוצעו תחת פרוטוקול #2013N000062 מאושר בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/J6 (בני 5 שבועות ו-P0). עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה וקיבוע לדוגמא

המתת חסד של עכברים בתא CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית להמתת חסד. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הגפיים האחוריות של העכבר לאורך מפרק הירך¹². בבקבוקון נצנוץ, טבלו את הגפה האחורית של העכבר בתמיסת פרפורמלדהיד (PFA) מספקת כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, וקבעו את הרקמה למשך 24 שעות.
הערה: במקום 4% PFA, ניתן להשתמש גם ב-10% פורמלין לקיבוע. לאחר הקיבוע, ניתן לאחסן את הדגימה במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עד לעיבוד נוסף. על ידי קיבוע כל הגפה האחורית, אנו מסוגלים לשמר את המתח על הגיד ויש לנו הזדמנות לבחון את האנתזה, את גוף האמצע של הגיד או את הצומת המיוטנדיני.
לאחר הוצאת ה-PFA מבקבוקון הנצנוץ, שטפו את הדגימה למשך 3 x 10 דקות עם 1x PBS על ידי הוספת מספיק PBS כדי לכסות את הדגימה. לאחר מכן, טבלו את הגפיים האחוריות ב-0.5 מ' EDTA ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך 1-2 שבועות, והחליפו ב-EDTA טרי כל 2-3 ימים.
לאחר הסרת ה-EDTA, שטפו את הדגימה למשך 3 x 10 דקות עם 1x PBS, ייבשו את הדגימות ב-70% EtOH והטמיעו אותן בפרפין בכיוון הרצוי. השתמש בטכניקות חיתוך FFPE קונבנציונליות כדי לחתוך את הרקמה בעובי של 3 מיקרומטר ולהעביר את החלקים לשקופית מיקרוסקופ מטופלת וטעונה (ראה טבלת חומרים)¹³.
הערה: ניתן לאחסן חלקים ב-4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
דה-פאראפיניזציה
1. אופים את השקופיות על פלטה חמה בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה ואז מניחים לשקופיות להגיע לטמפרטורת החדר (RT). כדי להסיר את שעוות הפרפין מהשקופיות, הניחו את השקופיות על מתלה שקופיות והורידו אותן לכלי מכתים מלא בקסילן. חזור על הפעולה בקסילן טרי למשך 3 x 5 דקות.
  זהירות: קסילן מסוכן; טפל בזהירות.
2. כדי להחזיר לחות לחלקים, טבלו את השקופיות בדברים הבאים למשך 5 דקות לכל שטיפה, הכל ב-RT: שטפו 2x ב-100% EtOH, 1x ב-75% EtOH מדולל ב-dH₂O, 1x ב-50% EtOH מדולל ב-PBS, 1x ב-25% EtOH מדולל ב-PBS ו-2x ב-PBS.
  הערה: כל שלבי ההתייבשות נעשים עם השקופיות על מתלה שקופיות ועם פתרונות EtOH השונים בכתמת כלים.

2. התאמת פרוטוקול RNAscope (ISH ממוסחר)¹⁴

הכנת פתרונות ובדיקות
1. הכן תמיסת TEG לטיפול מקדים בדגימות חתוכות על ידי שילוב של 25 מ"מ של Tris-HCl ב-pH 8, 10 מ"מ של EDTA ו-50 מ"מ של גלוקוז. הכינו נפח מספיק כדי לטפל בכל הדגימות או להכין עודפים; לעקר מסנן ולאחסן ב-RT; מערבבים את התמיסה כראוי לפני השימוש בה.
2. הכן מספיק מאגר כביסה 1x (ראה טבלת החומרים) עבור כל השטיפות ואחסן אותו ב-RT.
3. באמבט מים או חממה של 40 מעלות צלזיוס, יש לחמם את הבדיקות המעניינות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכינו את הבדיקות לפי פרוטוקול ISH¹⁴.
טיפול מקדים בדגימות
1. במקום להשתמש בתמיסת הטיפול המומלצת, טבלו את השקופיות בכלי מכתים המכיל מאגר TEG למשך 4 שעות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
  הערה: ניתן להאריך את הדגירה של מאגר TEG עד 6 שעות אם הרקמה צפופה במיוחד או אם אחזור אנטיגן של מוטיב קשירת ה-RNA המעניין מאתגר. במקרה כזה ניתן להוסיף כאן נקודת עצירה, את המגלשות לייבש ולשמור במקרר 4 מעלות למשך הלילה.
2. מוציאים את הדגימות מהמאגר ונותנים להן להתייבש. לאחר מכן, צייר סביב הדגימות בעזרת עט מחסום הידרופובי, טבל אותן בכלי מכתים אחר המכיל פרוטאז IV, ודגר אותן בתנור למשך 45 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס.
  הערה: אנו ממליצים על פרוטאז IV לעכברים בוגרים. אם משתמשים בעכברים צעירים יותר, כגון P0, אנו ממליצים להשתמש באנזים עדין יותר, כגון פרוטאז III, למשך 30 דקות. בעת פתרון בעיות לגילאים שונים, יש להקפיד על תקינות הגיד ולבדוק אם יש השפלה. אם הרקמה מתנתקת או מתפרקת, צמצם את זמן הדגירה או שנה את הפרוטאז בו משתמשים.
3. שטפו דגימות שוב במאגר TEG למשך 30 דקות ולאחר מכן הכלאו את הבדיקות בהתאם לפרוטוקול ISH¹⁴.
4. הוסף 50-100 מיקרוליטר של מגיב הרכבה על גבי הדגימה. הניחו כיסוי על גבי הדגימות למיקרוסקופיה. בעת הדמיה, השתמש בהגדלה גבוהה (אובייקט פי 40 ומעלה) כדי view האות.

3. התאמת פרוטוקול HCR ISH¹⁵

פוסט קיבוע
1. הכן 4% PFA (ב-PBS), תמיסת PBT (0.1% Tween-20 ב-PBS) ו-Proteinase K ב-PBS (ריכוז מלאי של 10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל).
2. כדי להתחיל את שלב התיקון הראשון, טבלו את השקופיות בכלי מכתים המכיל 4% PFA למשך 5 דקות; לאחר מכן, הסר את תמיסת ה-4% PFA ואחסן אותה לשימוש בשלבים מאוחרים יותר. שטפו את השקופיות למשך 2 x 5 דקות בתמיסת PBT והסירו את תמיסת ה-PBT. מניחים את השקופיות בכלי מכתים המכיל תמיסת Proteinase K (5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות ושוטפים אותן בתמיסת PBT 2 x 5 דקות.
3. התחל את שלב ה-postfix השני וטבול את השקופיות ב-4% PFA למשך 5 דקות.
  הערה: זהו אותו 4% PFA שנשמר משלב 3.1.2.
4. שטפו את השקופיות למשך 3 x 5 דקות בתמיסת PBT.
  הערה: כל שלבי הפוסט-קיבוע נעשים עם השקופיות על מתלה שקופיות ובכלים מכתימים המכילים את הפתרונות המתאימים.
אצטילציה
1. הכן את תמיסת האצטילציה המכילה 625 מיקרוליטר של אנהידריד אצטי, 3.3 מ"ל של מאגר טריאתנולמין (TEA) של 1 M ו-246 מ"ל של ddH₂O. הקפידו לערבב היטב ולהשתמש מיד לאחר ההכנה.
2. הנח את השקופיות בתמיסת האצטילציה למשך 10 דקות ולאחר מכן שטוף 3 x 5 דקות בתמיסת PBT. שטפו את השקופיות ב-ddH₂O ותנו להן להתייבש באוויר למשך 30 דקות. לאחר מכן, צייר סביב הדגימות בעזרת עט מחסום הידרופובי.
  הערה: כל שלבי האצטילציה נעשים עם השקופיות על מתלה שקופיות ובכלים מכתימים המכילים את התמיסות המתאימות
הכלאה
1. מחממים מראש את מאגר ההכלאה ל-37 מעלות צלזיוס ומחממים תא לח ל-37 מעלות צלזיוס.
  זהירות: המאגר מכיל פורממיד, חומר מסוכן. אם השקופיות אינן יבשות מספיק, כתם את הקצוות במגבון מעבדה כדי להסיר עודפי dH₂O.
2. הכן פתרונות בדיקה על ידי הוספת 0.4 pmol מכל תערובת בדיקה ל-100 מיקרוליטר של מאגר הכלאה.
  הערה: אם אתה משתמש בהדמיית dHCR, השתמש בריכוז גבוה יותר של בדיקה כדי לשפר את יעילות הכלאת הבדיקה.
3. הכן 4 ליטר של מאגר נתרן ציטראט נתרן כלורי (20x SSC) על ידי שילוב של 3 M NaCl (701.1 גרם NaCl בנפח סופי של 4 ליטר) ו-0.3 מ' של Na₃CH₆H₅O₇•2H₂O (352.8 גרם) ולאחר מכן התאמת ה-pH הסופי ל-7 על ידי הוספת HCl או 10 N NaOH. הוסף מספיק H₂O כדי להגיע ל-4 L. הכן 5x SSCT על ידי דילול 20x SSC ל-5x והוספת מספיק 10% Tween 20 כך שהוא יהיה 0.1% מהנפח הכולל.
4. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לדגימה, הנח את השקופיות בתא לח ותן לשקופיות לדגור למשך 10 דקות. הסר את תמיסת ההכלאה ונקז את המאגר העודף על המגלשה על ידי ספיגת הקצוות במגבון מעבדה.
5. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הבדיקה המוכנה על גבי הדגימה והנח כיסוי על הדגימה. יש לדגור בתנור למשך הלילה או למשך כ-12-16 שעות בתא עם לחות בתמיסה המכילה 5x SSC ו-50% פורממיד. הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.
  הערה: מכיוון שהדגירה היא לילה, הוספת הכיסוי היא כדי למזער את האידוי.
6. השאירו מינון של תמיסת SSCT פי 5 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ותוספת שנייה ב-RT. צפו את נפחי הכמות הנדרשות על סמך מספר המדגם ומספר השטיפות בשלב הבא.
כביסה
1. באמצעות תמיסת 5x SSCT שחוממה מראש בעבר, הכינו 75% מאגר כביסה/25% 5x SSCT, 50% מאגר כביסה/50% 5x SSCT, ו-25% מאגר כביסה/75% 5x SSCT.
2. כדי להסיר בדיקות עודפות, טבלו את השקופיות בסדרה למשך 15 דקות לכביסה ב-37 מעלות צלזיוס ב-75% מאגר כביסה/25% 5x SSCT, 50% מאגר כביסה/50% 5x SSCT, ו-25% מאגר כביסה/75% 5x SSCT. אפשר לכיסויים לצוף מהדגימות.
3. דגרו את השקופיות 2 x 15 דקות עם 100% 5x SSCT ולאחר מכן טבלו אותן ב-5x SSCT למשך 5 דקות ב-RT.
  הערה: ניתן לבצע את שלבי הכביסה באמצעות השקופיות על מתלה שקופיות ובכלים מכתימים המכילים את התמיסות המתאימות או עם התמיסות שנוספו כטיפות.
הגברה
1. הכן 6 pmol של סיכת ראש h1 ו-6 pmol של סיכת ראש h2 על ידי קירור מהיר של 2 מיקרוליטר של ציר של 3 מיקרומטר (מחממים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ומצננים ל-RT). הגן על סיכות השיער מפני אור במהלך תהליך זה.
  הערה: סיכות שיער HCR h1 ו-h2 מסופקות במאגר אחסון סיכת ראש ומוכנות לקירור בהצמדה. הצמד סיכות שיער מגניבות h1 ו-h2 בצינורות נפרדים.
2. יבש את השקופיות על ידי ספיגת הקצוות שלהן במגבון מעבדה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הגברה על גבי הדגימה והנח אותו בתא לח למשך 30 דקות ב-RT. הכן את תערובת סיכת הראש על ידי הוספת סיכות שיער h1 מקוררות וסיכות שיער h2 מקוררות ל-100 מיקרוליטר של מאגר הגברה ב-RT.
3. הסר את מאגר ההגברה ונקז את עודפי הנוזל על השקופית על ידי ספיגת הקצוות במגבון מעבדה. מוסיפים 100 מיקרוליטר מתערובת סיכות הראש שהוכנה קודם לכן ומניחים פרפילם על גבי הדגימה. דגרו את המגלשות למשך 4 שעות לפחות או לילה בתא חשוך ולח ב-RT.
4. כדי להסיר סיכות שיער עודפות, טבלו את השקופיות ב-5x SSCT בכלי מכתים ודגרו ב-RT למשך 30 דקות. חזור על הכביסה ב-SSCT טרי פי 5 למשך 30 דקות, ובפעם השלישית למשך 5 דקות.
5. יבש את השקופיות על ידי ספיגת הקצוות במגבון מעבדה והוסף 50-100 מיקרוליטר של מגיב הרכבה על גבי הדגימה. הניחו כיסוי על גבי הדגימות למיקרוסקופיה. בעת הדמיה, השתמש בהגדלה גבוהה (אובייקט פי 40 ומעלה) כדי view האות.

תוצאות

figure-results-1
איור 1: ביטוי רנ"א פולי A בגיד אכילס של עכבר בוגר באמצעות RNAScope. תמונה מייצגת של תיוג Poly A מוצלח בגיד אכילס של עכבר (פאנל שמאלי) באמצעות בדיקת ISH הממוסחרת. לוקליזציה עם DAPI מאשרת את הספציפיות של הגשושית (פאנלים אמצעיים וימניים), ומאפשרת שליטה ברעשי רקע. התמונות צולמו ב-63x עם מיקרוסקופ קונפוקלי של Leica SPE. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: ISH = הכלאה באתר; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ביטוי RNA Poly A בגיד אכילס של עכבר P0 באמצעות RNAScope. תמונה מייצגת של תיוג Poly A מוצלח בקלקנאוס עכבר P0 (פאנל שמאלי) באמצעות מבחן ISH הממוסחר. לוקליזציה עם DAPI ורעשי רקע מינימליים מאשרים את הספציפיות של הגשושית (פאנלים אמצעיים וימניים). הגיד מסומן בקו מקווקו. התמונות צולמו במיקרוסקופ ZEISS Axio Imager. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: ISH = הכלאה באתר; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה יעזור לחוקרים להשתמש בכלי הכלאה זמינים מסחרית באתרם ולהתאים אותם לשימוש ברקמת גיד בוגר. זה בסופו של דבר מאפשר לנו לנתח את רמות השעתוק של גנים שונים ברזולוציה של תא בודד מושכל מרחבית. הפעלה מוצלחת של בדיקת ISH תהיה ספציפית גבוהה עבור המטרות המעניינות ורעשי רקע מינימליים. הפרוטוקול יכול לשמש גם בגידי אכילס בוגרים וגם בילודים (איור 1, איור 2, איור 3 ואיור 4). Poly A יכול לשמש כבקרה כדי לעזור לאמת ריצה מוצלחת על ידי אישור איכותי שישנן רמות צפויות של RNA בדגימה.

עם זאת, ישנן מספר דרכים שבהן פרוטוקולי ISH עשויים להזדקק לפתרון בעיות. לדוגמה, איור 5 מראה הכלאה לא מספקת של בדיקה של Poly A בגיד, כך שלמספר אזורים בגיד לא היה אות Poly A, למרות שכתם הנגד של DAPI הראה כי תאים אכן היו קיימים. יתר על כן, אם הרקמה מתעכלת יתר על המידה בשלבי הפוסטפיקס ב-HCR באמצעות זמן דגירה ממושך של פרוטאינאז K (איור 6) או בשלבי הטיפול המקדים ב-RNAScope באמצעות דגירה מורחבת של פרוטאז IV, אז המורפולוגיה של הרקמה עלולה להשתבש. לבסוף, איור 7 הוא דוגמה לאיך תיראה בקרה שלילית אם לא יתווסף בדיקת הכלאת הרנ"א, אך עדיין נעשה שימוש בכתם נגדי גרעיני.

figure-results-3
איור 3: ביטוי רנ"א של סקלרסיס בגיד אכילס של עכבר בוגר באמצעות HCR. תמונה מייצגת של תיוג RNA סקלרקסי מוצלח בגיד אכילס של עכבר בוגר (פאנל שמאלי) באמצעות HCR. DAPI משמש ככתם נגד גרעיני (פאנל אמצעי). לוקליזציה עם DAPI מאשרת את הספציפיות של הגשושית (פאנל ימני). התמונות צולמו ב-63x עם מיקרוסקופ קונפוקלי של Leica SPE. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: HCR = תגובת שרשרת הכלאה; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ביטוי Poly A RNA בגיד אכילס של עכבר P0 באמצעות HCR. תמונה מייצגת של תיוג Poly A RNA בגיד אכילס של עכבר P0 באמצעות HCR. DAPI ו-Poly A מסמנים הן את העצם והן את גיד אכילס בקלקנאוס (הפאנל השמאלי והימני, בהתאמה). קולוקליזציה של בדיקות DAPI ו-Poly A על פני שתי הרקמות ורעשי רקע מינימליים מאשרים ריצת HCR מוצלחת (פאנל ימני). התמונות צולמו במיקרוסקופ ZEISS Axio Imager. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: HCR = תגובת שרשרת הכלאה; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ריצת HCR לא מוצלחת עם בדיקות Poly A RNA בגיד אכילס של עכבר P0. תמונה מייצגת של תיוג לא מוצלח של Poly A RNA בגיד אכילס של עכבר P0 באמצעות HCR. DAPI סימן גרעינים בעצם ובגיד של הקלקנאוס (הפאנל השמאלי), אך בדיקת Poly A HCR לא חלחלה לכל הגיד (הפאנל האמצעי והימני, ראה ראשי חץ לבנים). עם זאת, Poly A תייג בהצלחה את רוב העצם. התמונות צולמו במיקרוסקופ ZEISS Axio Imager. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: HCR = תגובת שרשרת הכלאה; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: דוגמה לתיוג HCR Poly-A בגיד אכילס של עכבר בוגר מעוכל יתר על המידה. תמונה מייצגת של תיוג Poly A RNA בגיד אכילס של עכבר בוגר מעוכל יתר על המידה באמצעות HCR. Poly A ו-DAPI מתמקמים בצורה נכונה בדגימה זו (פאנל ימני), אך המורפולוגיה החד-צירית האופיינית של הגיד מופרעת (ראשי חץ לבנים). התמונות צולמו במיקרוסקופ ZEISS Axio Imager. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: HCR = תגובת שרשרת הכלאה; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: בקרה שלילית עבור Poly A RNAscope בגיד אכילס של עכבר בוגר. תמונה מייצגת של בקרה שלילית לתיוג Poly A RNA שבו לא נוספה בדיקת Poly A, אך בדיקות ההגברה כן. כצפוי, DAPI תייג בהצלחה את הגרעין (הפאנל השמאלי), אך לא היה אות עבור Poly A (פאנל אמצעי). התמונות צולמו במיקרוסקופ ZEISS Axio Imager. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצור: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במאמר זה, אנו מתארים שינויים שנעשו כדי למנף את כלי ה-ISH הקיימים כך שניתן להשתמש בהם ברקמת גיד עם רמה גבוהה של ספציפיות ורגישות. מכיוון שהגיד הוא רקמה צפופה מאוד, לעתים קרובות יש לבצע התאמות פרוטוקול כדי להשיג דרגות דומות של חדירת בדיקה וספציפיות. שיטות חדירה ספציפיות אלה ואסטרטגיות הגברת אותות של רקמת הגיד הן חלק בלתי נפרד משיפור היעילות של פרוטוקולי ISH הנדונים. ללא שלבים אלה, מאתגר לבדיקות לקיים אינטראקציה חזקה וספציפית עם ה-RNA בגיד.

ב-RNAscope¹⁴, יש לבצע התאמות למאגר הטיפול המקדים המשמש כך שהפרוטוקול יעבוד בצורה יעילה יותר ברקמת הגיד. ליתר דיוק, השימוש ב-TEG Buffer כטיפול מקדים משפר את הגישה של בדיקות ל-RNA ממוקד. בנוסף ל-TEG Buffer, הטיפול בפרוטאז IV מתארך מעבר לזמן הסטנדרטי, כך שאורכו 45 דקות עד שעה. ב-HCR¹⁵, אורך השטיפות הוגדל, ונוספו שלבי פוסט-קידומת לפני תחילת בדיקת RNA-FISH. שלבי הפוסט-קידומת כללו תוספת של שלבי דגירה ב-4% PFA, PBT, Proteinase K ותמיסת אצטילציה. באופן קולקטיבי, שינויים אלה עוזרים לשפר את הגישה של הגשושית ל-RNA של הגיד ולהפחית רעשי רקע^16,17. עם זאת, למרות ששינויים אלה בפרוטוקול עוזרים להגביר את הספציפיות והרגישות של הבדיקות המשמשות ב-ISH על ידי שינוי פתרונות טרום טיפול המשמשים והוספת שלבי פוסט-קיבוע כדי להגביר את הנגישות לקשירת בדיקה ל-RNA, ישנן מגבלות שנוצרו על ידי תכנון בדיקה.

כדי לשפר את האתגרים שמציבה נגישות RNA לבדיקות, ניתן לבצע שינויים נוספים כדי לייעל את מבחני ה-ISH. אם ייעשה שימוש בהדמיית dHCR - שיטה לכימות אבסולוטי דיגיטלי של mRNA¹⁵, מומלץ להגדיל את ריכוז הגשושית כדי לשפר את יעילות הכלאת הבדיקה. יתר על כן, שימוש בתקופה קצרה יותר בשלבי ההגברה מבטיח שנקודות של מולקולה בודדת מוגבלות בעקיפה. תקופות דגירה ארוכות יותר עלולות לגרום לאוטופלואורסצנטיות גבוהה יותר מהשריר בעת ההדמיה. אם הגיד שנבחר צפוף יותר ו/או גדול יותר מגיד אכילס העכברי הבוגר, אנו ממליצים להגדיל את משך שלב קיבוע ה-PFA של 4%.

שינויים אלה בפרוטוקולי ה-ISH המסחריים שהוזכרו לעיל מועילים ביותר לרקמת עכברים בוגרת או לרקמות צפופות יותר הדורשות שלבי טיפול מקדים או קיבוע ארוכים יותר. למרות ששינויים אלה בפרוטוקולים הקיימים עוזרים לשפר את הנגישות של הבדיקות ל-RNA, בדיקות מסוימות עשויות לדרוש ריכוז גבוה יותר או זמן דגירה ארוך יותר בעכברים מבוגרים יותר מאשר בעכברים צעירים יותר או בילודים, בהתאם לנגישות של מוטיבים של RNA המטרה שאליהם ייקשרו הגשושיות בקבוצות הגיל השונות. בכל הנוגע לשימוש בפרוטאז בשלבי הטיפול המקדים של RNAscope, אנו ממליצים להשתמש בפרוטאז IV למשך 45 דקות לגידים של עכברים בוגרים אך בפרוטאז III למשך 30 דקות לגידים יילודים. כדי להעריך את יעילות הבדיקה, להעריך התאמות כלשהן לפרוטוקול, או באופן כללי להשוות ביטוי בין דגימות, ניתן להשתמש במספר בקרות. לדוגמה, ניתן להשוות בדיקה Poly A עם כתם נגד גרעיני המשמש להערכת הספציפיות של הריצה, כדי להעריך את התפלגות ה-RNA / פירוק הדגימה, וכדי לאשר שה-RNA היה נגיש לבדיקות. באופן דומה, בדיקות לגנים של משק בית יכולות לשמש גם כבקרות לגישה לנגישות RNA. בקרות חיוביות עם יעדים בעלי דפוסי ביטוי ידועים עוזרות לאשר את הספציפיות, ובקרות שליליות יעזרו להעריך כל כריכה פוטנציאלית לא ספציפית.

בסך הכל, מכיוון שמספר טכניקות מפותחות כדי להבין טוב יותר את פרופיל ביטוי הגנים המרחבי של רקמות, יש צורך בשיטות נוספות כדי לאמת את התוצאות. בפרט, מבחנים כגון RNA Seq של תא בודד מתגלים ככלים פופולריים להערכת ביטוי גנים, אך יש לבחון את תוצאותיהם מרחבית ברזולוציה גבוהה יותר. כדי לעזור בכך, ניתן להשתמש במבחני ISH כדי להבין טוב יותר ולאמת את ההקשר המרחבי של נתוני התעתיק המופקים על ידי מבחנים כמותיים יותר. בגידים, זיווג מבחנים כאלה יעזור לאפיין עוד יותר את התאים השוכנים על פני האנתזה, גוף האמצע של הגיד והצומת המיוטנדיני על ידי אימות מרחבי של סמנים ספציפיים לאוכלוסיות תאים ייחודיות.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים מודים לג'נה גאלוויי ולחברי מעבדת גאלוויי על תמיכתם ועידודם בפיתוח ובפתרון בעיות של פרוטוקולים אלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 M triethanolamine buffer
10% תמיסת
10% Tween-20
20x מי מלח נתרן ציטראט מאגר
4% PFA
ACD RNAscope פלואורסצנטי מולטיפלקס פלואורסצנטי ערכת ריאגנט V2	ACD	323100
אצטי מיקרוסקופ צילום אנהידריד
Axio ZEISS
C57BL/J6 עכברים		מזהה JAX: 000664
Coverslips	Fisher	12-541-042
ddH₂O
ETDA	Thermofisher	AM9262
EtOH
גלוקוז	VWR כימיקלים BDH	BDH9230-500G
HCR RNA-FISH Bundle	Molecular Instruments Inc.
HybEZ II מערכת היברידיזציה	ACD
Immedge מחסום עט	וקטור מעבדות	H4000
Leica SPE מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica
Parafilm	פישר
פוספט חוצץ מלח (PBS, 1x)	Invitrogen	AM9625	לדלל 10x PBS במים מילי-Q כדי לקבל תמיסה 1x
פרוטאז IV
פרוטאינאז K	Roche	3115836001
RNAscope H₂O₂ וריאגנטים פרוטאז	ACD	PN 322381	כלולים ב-ACD RNAscope ערכת ריאגנטים פלואורסצנטיים מולטיפלקס פלואורסצנטי V3
ערכת זיהוי פלואורסצנטי מולטיפלקס RNAscope	ACD	PN 323110	כלול ב-ACD RNAscope פלואורסצנטי מולטיפלקס פלואורסצנטי ערכת ריאגנטים פלואורסצנטיים V2
RNAscope ריאגנטים לאחזור יעד	ACD	322000	כלול ב-ACD RNAscope פלואורסצנטי מולטיפלקס פלואורסצנטי ערכת ריאגנטים פלואורסצנטיים V4
RNAscope מאגר שטיפה	ACD	PN 310091	כלול ב-ACD RNAscope פלואורסצנטי מולטיפלקס פלואורסצנטי ערכת ריאגנט V5
RNAscope בדיקה מדלל	ACD	300041
מחזיק שקופיות	StatLab	4465A
צלחת מכתים עם מכסה	StatLab	LWS20WH
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות	פישר	1255015	מטופל, שקופיות טעונות
Tris-HCl
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L

פורמלין

מקורות

Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Situ Hybridization RNA