מאמר שיטה

מיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר גידים

DOI:

10.3791/65853

⸱

29 במרץ 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את תהליך ההכנה, ההגדרה וההדמיה של גידים באמצעות מיקרוסקופיה מרובת פוטונים. בנוסף, הוא מכסה את היישום של SHG לניתוח יישור סיבי קולגן ויצירת ייצוג תלת מימדי של גידים. מתודולוגיה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב באפיון תאי הגיד וה-ECM שלהם במהלך פציעה והתפתחות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה דו-פוטונית התגלתה ככלי רב עוצמה להערכת תאי רקמות עמוקות ולאפיון יישור המטריצה החוץ-תאית (ECM) במערכות ביולוגיות שונות. טכניקה זו מסתמכת על אינטראקציות אור-חומר לא ליניאריות כדי לזהות שני אותות נפרדים: אות הדיפוזיה השני שנוצר בהרמוניה (SHG), המאפשר הדמיה של סיבי קולגן וכיוונם, ואות העירור הקרוב לאינפרא אדום להדמיית אוטופלואורסצנציה נרגשת אולטרה סגול.

הדמיית SHG הוכיחה את עצמה כיעילה במיוחד בהדמיית סיבי קולגן בשל המבנה הגבישי הלא צנטרו-סימטרי של קולגן סיבי I. בהתחשב בכך שהגידים הם רקמות עשירות במטריקס עם מספר מוגבל של תאים, תכולת הקולגן הגבוהה שלהם הופכת אותם למועמדים אידיאליים לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. כתוצאה מכך, מיקרוסקופיה דו-פוטונית מציעה אמצעי רב ערך לניתוח ואפיון חריגות קולגן בגידים. יישומו משתרע על חקר התפתחות גידים, פציעות, ריפוי והזדקנות, ומאפשר אפיון מקיף של תאי גידים והאינטראקציות שלהם עם ה-ECM בתנאים שונים באמצעות כלי מיקרוסקופיה דו-פוטונית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית בביולוגיה של הגידים ומציג מתודולוגיה מותאמת להשגת הדמיה ואפיון יעילים של תאי גידים במהלך ההתפתחות ולאחר הפציעה. השיטה מאפשרת שימוש בחתכים מיקרוסקופיים דקים ליצירת תמונה מקיפה של ה-ECM בתוך הגידים והתאים המקיימים אינטראקציה עם מטריצה זו. בעיקר, המאמר מציג טכניקה ליצירת תמונות תלת מימד באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודלים של בעלי חיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לתפקד כראוי ולהעביר כוח מהשריר לעצם1, הגידים מסתמכים על הקשרים הבין-מולקולריים והתוך-מולקולריים בין סיבי הקולגן. ההרכבה העצמית המורכבת, ההצלבה והיישור של סיבי הקולגן מביאים להקמת מטריצה מאורגנת ביותר התורמת לחוזק ולגמישות הביומכנית של רקמת הגיד 2,3,4. למרות שחלבוני ECM אחרים תורמים גם הם ליציבות הרשת הסיבית בגידים5, המסה היבשה של הגיד היא כ-86% קולגן6, כאשר קולגן I מהווה עד 96% מכלל תכולת הקולגן 7,8. זה בסופו של דבר הופך את מבנה הקולגן לתפוקה מרכזית של בריאות ותפקוד תקינים של הגידים.

כמה שיטות הדמיה קליניות המשמשות לגידים הן MRI ו/או אולטרסאונד. בעוד שטכנולוגיית אולטרסאונד מספקת תמונות של המבנה הפאסיקולרי של הגיד וחושפת חלק מהמבנה הסיבי ברקמה9, הרזולוציה אינה אידיאלית לכימות. ל-MRI יש רזולוציה מרחבית טובה יותר מאשר הדמיית אולטרסאונד, אך היא עדיין מוגבלת. עם זאת, שיטות אלו מוגבלות גם בעומק ההדמיה הפוטנציאלי שלהן דרך רקמה. בקנה מידה מיקרו יותר, ניתן להשתמש בפיזור אור בזווית קטנה ורחבה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את מבנה סיבי הקולגן וכל חריגה פוטנציאלית.

לעומת זאת, מיקרוסקופ דור הרמוני שני (SHG) שונה משיטות הדמיה אחרות מכיוון שהוא יכול ללכוד את המעטפת החיצונית של סיבי הקולגן. סיבי קולגן I בגידים מאורגנים בצורה מקבילה חד-צירית דרך הגיד ECM והם לא צנטרו-סימטריים באופיים 4,10. ניתן למנף את המאפיינים הללו להדמיה באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני, שיכול לייצר תמונות ברורות עמוקות עד פי 2-3 מהדמיה קונפוקלית11. זה גם מאפשר לנו לייצר חלקים אופטיים באיכות טובה יותר של הגיד. כאשר אור מוקרן לתוך הדגימה המעניינת, נוצר אות SHG, וניתן ללכוד את פיזור האור הזה. בגידים, זה מייצר תמונה של מבנה הקולגן והיישור, ובכך מאפשר לנו להעריך את ההשלכות המורפולוגיות והפתולוגיות הפוטנציאליות של גידים, פציעות וכו '.

מכיוון שקולגן מהווה את רוב המסה היבשה של הגידים ותורם לתפקוד הגידים 6,12, הפרעה במבנה הקולגן יכולה להשפיע על התכונות הביומכניות של הגידים. לפיכך, ניתוח מבנהו יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את ההשפעה והחומרה של פציעות, כמו גם ליצור מדד ליעילות ריפוי. מאמר זה סוקר שיטה המשתמשת במיקרוסקופ מולטיפוטון ו-SHG כדי לנתח כיצד התפתחות ופציעות משפיעות על המבנה והיישור של סיבי קולגן I וליצור תמונות תלת מימד של ECM בגידים במודלים של בעלי חיים. לכן, השיטה שלנו להדמיית גידים עשויה לסייע לחוקרים לאפיין תאי גידים ו-ECM במהלך ההתפתחות או לאחר פציעה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (פרוטוקול #2013N0000062) ו-AAALAC בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. BHLHE40 עכברי נוקאאוט אפסיים או הטרוזיגוטיים על רקע Scx-GFP, בני 30 יום, שימשו למחקר הנוכחי. בעלי החיים הושגו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת רקמות וקיבוע

  1. כדי להכין את הרקמה, המתת חסד של עכברים בתא CO2 (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) ואחריו פריקת צוואר הרחם.
  2. כדי לסייע בהפחתת כמות הפרווה שעלולה להידבק לדגימת הרקמה, רססו את העכבר ב-70% EtOH עד שהפרווה רוויה. עור את הגפיים האחוריות, ולאחר מכן בעזרת מספריים, הסר את שתי הגפיים האחוריות על ידי חיתוך במפרק הירך.
  3. הניחו את שתי הגפיים האחוריות בבקבוקון נצנוץ של 20 מ"ל, וטבלו אותן ב-4% PFA כך שהבקבוקון יתמלא. מניחים את הבקבוקונים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב למשך הלילה.
  4. שטפו את הגפיים האחוריות ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה למשך 10 דקות וחזרו על הפעולה בסך הכל 3 פעמים. טבלו את הגפיים האחוריות ב-0.5 מ' EDTA (pH 8.0) ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עד שבועיים, והחליפו ב-EDTA טרי כל 2-3 ימים.
  5. שטפו את הגפיים האחוריות ב-1x PBS ב-RT עם תסיסה למשך 10 דקות, וחזרו על השטיפות בסך הכל 3 פעמים.
  6. טבלו את הגפיים ב-PBS טרי 1x ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שישמשו להדמיה.

2. דיסקציה של הגיד והכנת רקמה להדמיה

  1. תוך כדי החזקת כף הרגל עם מלקחיים, החלק קצה אחד של להב המספריים הקפיץ (ראה טבלת חומרים) מתחת לגיד אכילס והקפד לחתוך קרוב ככל האפשר לצומת המיוטנדיני.
  2. החזק את הקצה המיוטנדיני הקטוע של הגיד בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים הקפיציים כדי לחתוך את הגיד קרוב ככל האפשר לעצם.
    הערה: במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לעזור להרחיק את גיד אכילס משאר הגפה האחורית במהלך החתך הראשון. הקפד לא לרסק או לפגוע ברקמה, מכיוון שזה ישפיע על יישור הקולגן במהלך ההדמיה.
  3. כדי לחלחל ולקבל כתם נגד גרעיני, טבלו את הגיד המנותח ב-PBT (1% Triton-X ב-PBS) עם 0.1% Draq5 (ריכוז מלאי, 5 מ"מ, ראה טבלת חומרים). הנח את הגיד בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, והוסף 1 uL של Draq5 ל-1 מ"ל PBT. דגירה למשך הלילה ב-RT על נדנדה. מכיוון ש-Draq5 רגיש לאור, כסו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בנייר אלומיניום והגנו על הדגימות מפני אור.
  4. לפני ההדמיה, הסר את תמיסת Draq5 והחלף אותה ב-dPBS. הקפד להמשיך להגן על הדגימה מפני אור.
    זהירות: ל-Draq5 יש רעילות בקטגוריה שלוש והוא נחשב למסוכן על פי תקן OSHA Hazard Communication Standard. הימנע ממגע והשליך אותו למיכל פסולת מסומן.
  5. בעזרת כלי ניקוב ביופסיה בקוטר פנימי של 6 מ"מ, חותכים חתיכת קצף ג'ל (ראו טבלת חומרים) ומניחים אותה בצלחת פטרי קטנה בגודל 60X15 מ"מ. הוסיפו ddH2O לתבשיל כדי לאפשר לקצף הג'ל להתרחב.
  6. מניחים את גיד אכילס המנותח על קצף ג'ל. בעזרת כיסוי המודבק למכונת כביסה, הניחו בזהירות את מכונת הכביסה מעל הגיד עד שהכיסוי יוצר מגע עם הרקמה. כדי למנוע בעיות בעת הדמיה, ודא שאין בועות אוויר בין הדגימה לכיסוי. במידת הצורך, הוסף עוד ddH2O לכלי כדי לכסות את הדגימה ואת מכונת הכביסה עם הכיסוי.

3. הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון

  1. באמצעות מיקרוסקופ לייזר רב-פוטוני FVMPE-RS, אובייקט פי 25 שניתן לטבול במים, לייזר פועם HPDS-O IR ולייזר פועם IR (ראה טבלת חומרים), אתר את הדגימה ואזור העניין שיצולמו באמצעות נתיב האור של EPI. לאחר איתור הדגימה, כוון את המצלמה על הקצה המיוטנדיני או האנתזאלי של גיד אכילס.
  2. העבר את נתיב האור ל-LSH, כוונן את הגדרת לייזר ה-IR של לייזר 2 ל-840 ננומטר ויישר באופן פעיל. התאם את עוצמת ה-HV כדי שתוכל לראות את הרקמה ואת אות ה-SHG, מבלי לחרוג מ-20%. אל תתאים את הרווח ותשמור על ההיסט שווה ל-0.
  3. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים של z-stack כדי לרכוש את התמונות לדוגמה. השתמש בגודל סריקה של 1024 x 1024 והגדר את גודל המדרגה ל-0.4 מיקרון. ערימות Z הן, בממוצע בסביבות 150 פרוסות, והן מתחילות מהמעטפת החיצונית ונעות לכיוון מרכז הגיד עד שאות ה-SHG כבר לא ברור, ומייצרות קטעים אופטיים סגיטליים13.
  4. כוונן את עוצמת הלייזר למצב Bright Z כדי לאפשר סטנדרטיזציה של זיהוי אותות. לאחר קביעת פרמטרי ההתחלה/עצירה של Z-stack, הגדר את עוצמת הלייזר מ-4 בתחילת ההדמיה ו-6 בסוף ההדמיה. זה עוזר לשמור על עקביות באיתות SHG כאשר הסקופ מצלם עמוק יותר לתוך הרקמה.
  5. לאחר יצירת ערימות ה-z, עבד אותן עוד יותר ב-ImageJ/FIJI כדי ליצור סרט של מקטעים אופטיים בכיוון רוחבי. לשם כך, פתח את תוכנת ImageJ/FIJI14 ולחץ על Image > Stacks > Reslice. זה יאפשר לנו לקבל מבט רוחבי על גיד אכילס, ולחשוף את המורפולוגיה הכוכבית של הטנוציטים ואת אוריינטציה שלהם במטריצת הקולגן.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימושי לאפיון תאי גיד והמטריצה החוץ-תאית שלהם (ECM) לאחר פציעה, במהלך ההתפתחות או במצב מוטנטי. עם חיתוך והכנה קפדנית של הדגימה, ניתן ליצור סרטוני z-stack דרך הרקמה בכיוון סגיטלי (וידאו 1 ווידאו 2). על ידי שימוש ב-ImageJ/FIJI כדי לעבד ולפרוס מחדש את התמונות, נוצרת תצוגה רוחבית של גיד אכילס (סרטונים 3 ווידאו 4). זה חושף את המורפולוגיה הכוכבית של הטנוציטים ומאפשר לנו להתבונן בארכיטקטורה הייחודית שלהם בתוך מטריצת הקולגן הצפופה.

על ידי שימוש במיקרוסקופיה מרובת פוטונים ומינוף התכונות הגבישיות הלא-צנטרו-סימטריות של קולגן סיבי I, נוצרו תמונות חתך אופטי ברזולוציה גבוהה הלוכדות הן את תאי הגיד והן את המטריצה שלהם. מקטעים אופטיים אלה מבודדים מערימות ה-z עבור BHLHE40 +/-; Scx-GFP ו-BHLHE40 -/-; עכברי Scx-GFP (איור 1A,B, בהתאמה). החלקים נלקחים ממחסנית ה-z הסגיטלית המקורית שנוצרה על ידי הדמיית 2-P ומערימת ה-z הפרוסה מחדש שנוצרה באמצעות ImageJ/FIJI. בנוסף לכך, אנו יכולים גם להשתמש בשיטת הדמיה זו כדי לנתח הבדלים פוטנציאליים בארגון הקולגן, המורפולוגיה התאית וכו', בין שני העכברים.

figure-results-1
איור 1: חתך אופטי של BHLHE40 +/-; Scx-GFP ו-BHLHE40 -/-; גיד עכבר Scx-GFP. מחסנית Z נלכדה באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני. (A) החלקים האופטיים שנרכשו מ-Z-stack מציגים את אות ה-SHG ואת תאי GFP+/Draq5+ ב-BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, נקבה, 14.68 גרם) ו-(B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, נקבה, 12.16 גרם). בחתכים קשתיים כלולים אות SHG בעוד שבחתכים רוחביים אין. הדגימות הוכתמו ב-Draq5. SHG לוכד את מטריצת הקולגן ברקמה. סרגל קנה המידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: סרטוני Z-stack של התצוגה הסגיטלית של BHLHE40 +/-; גיד עכבר Scx-GFP. מחסנית Z נלכדה באמצעות מיקרוסקופ בעל שני פוטונים. הסרטון מציג את המבט הסגיטלי של גיד אכילס. הדגימות הוכתמו ב-Draq5. SHG לוכד את מטריצת הקולגן ברקמה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 2: סרטוני Z-stack של התצוגה הסגיטלית של BHLHE40 -/-; עכבר Scx-GFP גיד אכילס. מחסנית Z נלכדה באמצעות מיקרוסקופ בעל שני פוטונים. הסרטון מציג את המבט הסגיטלי של גיד אכילס בעכבר KO אפס BHLHE40. הדגימות הוכתמו ב-Draq5. SHG לוכד את מטריצת הקולגן ברקמה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 3: סרטוני Z-stack של התצוגה הרוחבית של BHLHE40 +/-; גיד עכבר Scx-GFP. מחסנית Z נלכדה באמצעות מיקרוסקופ בעל שני פוטונים. הסרטון מציג את המבט הרוחבי של גיד אכילס. הדגימות הוכתמו ב-Draq5. SHG לוכד את מטריצת הקולגן ברקמה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 4: סרטוני Z-stack של התצוגה הרוחבית של BHLHE40 -/-; עכבר Scx-GFP גיד אכילס. מחסנית Z נלכדה באמצעות מיקרוסקופ בעל שני פוטונים. הסרטון מציג את המבט הרוחבי של גיד אכילס בעכבר KO אפס BHLHE40. הדגימות הוכתמו ב-Draq5. SHG לוכד את מטריצת הקולגן ברקמה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטה להכנה, ניתוח והדמיה של גיד אכילס של העכבר, תוך שימוש בתכונות הגבישיות הלא-צנטרו-סימטריות של ה-ECM של הגיד. השלבים העיקריים בהכנת רקמות כוללים חדירה לכתמים נגדיים והבטחת מיקום נכון של רקמות בצלחת פטרי במהלך ההדמיה. במקום Draq5, ניתן להשתמש ב-Hoechst 33258 בדילול של 1:100,00013, אך Draq5 מועדף בשל החדירות הגבוהה, היציבות הפוטו-יציבה וההלבנה המינימלית שלו. מיקום נכון של רקמות הוא חיוני כדי למנוע בועות בין הכיסוי לגיד, שכן כיוון שגוי יכול להשפיע על התמונות המתקבלות.

בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיה אחרות, מיקרוסקופיה של דור הרמוני שני (SHG) מאפשרת לכידת סיבי קולגן ותאי גידים בתוך המטריצה10. בשילוב עם כתמי נגד, נתונים אלה מאפשרים ניתוח של האופן שבו התפתחות, פציעות או מוטציות משפיעות על מבנה הגידים. יצירת תמונות תלת מימד של ECM בגיד מאפשרת התבוננות בקטעים אופטיים כשהם עוברים דרך הגיד. בעוד שטכנולוגיית מולטיפוטון מספקת חדירה מעולה לרקמות, עדיין יש לה מגבלות בהדמיה דרך כל גיד אכילס, מה שמחייב טכניקות נוספות כמו חתך. עם זאת, שיטה זו מאפשרת לייצר כ-150 חתכים אופטיים של 0.4 מיקרון בבהירות, תוך הימנעות מהפרעות רקמות באמצעות חתך.

לסיכום, שיטה זו מציעה תובנות חשובות לאפיון התפתחות גידים, פציעות, ריפוי והזדקנות, על ידי הדמיית תאי גיד ו-ECM באמצעות מיקרוסקופיה מולטיפוטון. שימוש בהדמיה מרובת פוטונים עבור חתכים אופטיים וסרטוני z-stack ברחבי הרקמה מספק הבנה טובה יותר של שינויים במורפולוגיה של הגידים בתנאי ניסוי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לג'נה גאלוויי ולחברי מעבדת גאלוויי על תמיכתם ועידודם בפיתוח ובפתרון בעיות של פרוטוקולים אלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 מ' EDTA pH 8.0InvitrogenAM9262
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהארה"ב סיינטיפיק1620-2700
בקבוקון נצנוץ 20 מ"לסיגמא-אולדריץ'Z190527-1PAK
4% פרפורמלדהידמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי50-980-487השתמש באמפואול PFA ליצירת תמיסת PFA
4% כלי ניקוב ביופסיה 6 מ"מטד פלה בע"מ. 15111-60
פטרי בגודל 60 x 15 מ"מ
BHLHE40 נוקאאוט אפס או עכברים הטרוזיגוטיים ברקע Scx-GFP מעבדת ג'קסוןJAX ID #029732MGI ID #3717419
CoverslipsFisher12-544-Fיכול להשתמש בכל כיסוי המשתרע על שטח מכונת הכביסה M20
dPBSGibco14190144
Draq5ABCAMab108410
מספריים עדינים 21 מ"מ קצה חיתוךFine Science Tools14060-10
FVMPE-RS לייזר מולטיפוטון מיקרוסקופ סורקאולימפוס
ג'לקצף ספוג סטרילי גודל 50 פייזר00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR לייזר פועםאולימפוס
MaiTai HPDS-O IR לייזר פועםאולימפוס
פוספט מלוח (1x)InvitrogenAM9625לדלל 10x PBS במים מילי-Q כדי לקבל פתרון 1x
מכונת כביסה שטוחה מנירוסטה M20 McMaster-Carr
Triton X-100MP Biomedicals807426לדלל Triton X-100 ב-dPBS כדי לקבל פתרון 1%
Vannas מספריים קפיציים 4 מ"מ חוד החניתFine Science Tools15018-10
XLPlan N 25X WMP עדשה
צלחת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Kadler, K. E., Holmes, D. F., Trotter, J. A., Chapman, J. A. Collagen fibril formation. The Biochemical Journal. 316 (Pt 1), 1-11 (1996).
  3. Butler, D. L., Grood, E. S., Noyes, F. R., Zernicke, R. F. Biomechanics of ligaments and tendons. Exercise And Sport Sciences Reviews. 6, 125-181 (1978).
  4. Tsai, S. L., Nödl, M. T., Galloway, J. L. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 250 (3), 393-413 (2020).
  5. Subramanian, A., Schilling, T. F. Tendon development and musculoskeletal assembly: emerging roles for the extracellular matrix. Development (Cambridge, England). 142 (24), 4191-4204 (2015).
  6. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  7. Riley, G. P., Harrall, R. L., Constant, C. R., Chard, M. D., Cawston, T. E., Hazleman, B. L. Tendon degeneration and chronic shoulder pain: changes in the collagen composition of the human rotator cuff tendons in rotator cuff tendinitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 53 (6), 359-366 (1994).
  8. Bobzin, L., Roberts, R. R., Chen, H. J., Crump, J. G., Merrill, A. E. Development and maintenance of tendons and ligaments. Development (Cambridge, England). 148 (8), dev186916(2021).
  9. Hodgson, R. J., O'Connor, P. J., Grainger, A. J. Tendon and ligament imaging. The British Journal of Radiology. 85 (1016), 1157-1172 (2012).
  10. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophysical Journal. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  11. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophysical Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  12. Franchi, M., Trirè, A., Quaranta, M., Orsini, E., Ottani, V. Collagen structure of tendon relates to function. The Scientific World Journal. 7, 404-420 (2007).
  13. Grinstein, M., Dingwall, H. L., O'Connor, L. D., Zou, K., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  14. Rueden, C. T., Schindelin, J., Hiner, M. C., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SHG
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים