מאמר שיטה

הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65867

⸱

26 בינואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

תקציר

סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.

מבוא

כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי 1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח 3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית5. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.

מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית בין רקמות ואיברים, כולל אינטראקציה אימהית-שליה6. בנוסף לחלבונים ושומנים על פני השטח החיצוניים, כלי רכב חשמליים נושאים מטען פנימי (חלבונים, רנ"א ושומנים). ניתן לסווג כלי רכב חשמליים ל-(1) אקסוזומים (קוטר ~50-150 ננומטר, המכונים גם כלי רכב חשמליים קטנים (sEVs)), (2) רכבים חשמליים בינוניים/גדולים, ו-(3) גופים אפופטוטיים, הנבדלים זה מזה בגודל, בביוגנזה, בתוכן ובפונקציית האיתות הפוטנציאלית. הרכב כלי הרכב החשמליים נקבע על פי התאים שמהם הם מגיעים וסוג המחלה7. EVs שמקורם ב-Syncytiotrophoblast מבטאים phosphatase אלקליין שליה (PLAP)8,9, אשר מזהה EVs קטנים שמקורם בשליה (PDsEVs) בהריון. כמו כן, PLAP מסייע להבחין בשינויים במטען PDsEVs והשפעתם ברעלת הריון לעומת הריונות נורמוטנסיים 10,11,12,13,14,15.

השליה הוכרה כמרכיב הכרחי בפתופיזיולוגיה של רעלת הריון16 או סיבוכים מוחיים הקשורים למחלה זו 17,18,19. אולם לא ידוע כיצד איבר מרוחק זה עשוי לגרום לשינויים במחזור המוח. מאחר שכלי רכב חשמליים ממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין תאים בשל יכולתם להעביר רכיבים ביו-אקטיביים מתאים מתורם לתאמקבל 6,20,21, מספר גדל והולך של מחקרים קשרו sEV שליה עם יצירת תפקוד לקוי של אנדותל אימהי 21,22,23,24, כולל תאי אנדותל במוח 25,26אצל נשים עם רעלת הריון. לפיכך, הפגיעה בתפקוד האנדותל במוח עלולה להוביל להפרעה במחסום הדם-מוח (BBB), מרכיב קריטי בסיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון 3,27.

עם זאת, ממצאים פרה-קליניים שהשתמשו בכלי דם מוחיים של חולדות שנחשפו לסרום של נשים עם רעלת הריון28 או תאי אנדותל במוח אנושי שנחשפו לפלזמה של נשים עם רעלת הריון29 דיווחו כי גורמים במחזור הדם גורמים להפרעה ב- BBB. למרות מספר מועמדים בעלי פוטנציאל לפגוע ב- BBB הקיים במחזור הדם האימהי במהלך רעלת הריון, כגון רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, גורם נמק גידולי)18,28 או מווסתי כלי דם (כלומר, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF))29,30,31, או מולקולות חמצון כגון ליפופרוטאינים מחומצנים (oxo-LDL)32,33, בין היתר34אף אחד מהם לא יוצר קשר ישיר בין השליה לבין BBB., לאחרונה, sEV שבודדו משליות היפוקסיביות הראו את היכולת לשבש את BBB בעכברות לא הרות25. מכיוון שכלי שליה חשמליים עשויים לשאת את רוב הגורמים המחזוריים המפורטים עם היכולת לשבש את BBB, sEV נחשבים מועמדים מתאימים לחבר את השליה הפגועה, להיות נשא של גורמים מזיקים במחזור הדם, ולשבש את BBB ברעלת הריון.

פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אם sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים יכולים לשבש את מחסום הדם-מוח בעכברות שאינן הרות כפרוקסי להבנת הפתופיזיולוגיה של סיבוכים מוחיים במהלך רעלת הריון.

פרוטוקול

המחקר בוצע בהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי ובאישור ועדות הביקורת האתית המתאימות. כל המשתתפים האנושיים נתנו את הסכמתם מדעת לפני איסוף הדגימה, כפי שדווח קודם לכן25. בנוסף, ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Bío-Bío אישרה פרויקט זה (מענק Fondecyt 1200250). העבודה בבעלי חיים נעשתה בהתאם לעקרונות הקרדינליים של שלושת ה-R בשימוש בבעלי חיים בניסויים35, ובהתאם להמלצות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. בעלי חיים הוחזקו בסביבות מתאימות בויבריום של אוניברסיטת ביו-ביו. שליות טריות (n = 4) התקבלו תוך שעה לאחר ניתוח קיסרי אלקטיבי מאמהות (גילאי 28-31) עם הריונות רגילים במועד (38 עד 41 שבועות הריון). ניתוחים קיסריים בוצעו בבית החולים הקליני הרמינדה מרטין, צ'ילאן, צ'ילה, כפי שדווח בעבר25. כדי ליישם את מודל in vivo השתמשו בעכברות לא הרות בנות 4-6 חודשים (זן C57BLACK/6). הם חולקו לשלוש קבוצות ניסוי: (1) בקרה (ללא טיפול), (2) טופלו ב-sEVs מנורמוקסיה (sEVs-Nor), ו-(3) טופלו ב-sEVs משליות תרבית היפוקסיות (sEVs-Hyp), ששימשו להערכת ההפרעה של BBB in vivo25. כל התמיסות שהוזרקו היו סטריליות. כמו כן, הכנת sEV בוצעה בתנאים אספטיים ותחת מכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II כדי למנוע זיהום.

1. עציצים בתרבות השליה

  1. כדי לחלץ צמחים של שליות הריון נורמליות, לבדוק את השיטה שפורסמה על ידי מילר et al. 200536.
  2. בזהירות להסיר את הקרישים מן הצלחת הבסיסית של השליה האנושית באמצעות מלקחיים מעוקרים. לחלץ צמחים קטנים כדי להשיג מיצוי רקמות סופי של 10 גרם.
  3. ודא כי חצילי השליה מוסרים מארבעת הרבעים של החלק האימהי של השליה. ודא כי רקמות devitalized ואזורים מסוידים אינם נכללים.
  4. כדי לתפעל את רקמת השליה, עשו זאת על קרח, בתנאים סטריליים ובתוך ארון בטיחות ביולוגית.
  5. שטפו את הצמחים (לפחות שלוש פעמים) עם כמויות גדולות (חמישה כרכים של הצמחים) של תמיסת חיץ פוספט קרה (4 מעלות צלזיוס) (PBS 1x, pH 7.4) כדי להסיר כמה שיותר דם. צנטריפוגה (252 x גרם למשך 10 דקות) בטמפרטורת החדר בין כביסה.
  6. יש להשהות מחדש 10 גרם של צמחים שטופים ב-20 מ"ל של מדיום תרבית בתוספת סרום בקר עוברי 2%, 100 IU/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים).
  7. שים את המתלה בצלחת תרבית 100 מ"מ. השאירו את הצמחים למשך שעתיים באינקובטור ב 37 °C עם 21% חמצן ו 5% CO2.
  8. לאחר מכן, לשטוף מחדש את explants עם 1x PBS ב 37 ° C (שלוש פעמים). צנטריפוגה (252 x גרם למשך 10 דקות) בטמפרטורת החדר בין כביסה.
  9. יתר על כן, להשעות מחדש את הרקמה ב 20 מ"ל של מדיום תרבית שהתרוקן בעבר מננו-חלקיקים.
    הערה: לדלדול ננו-חלקיקים, בצע אולטרה-צנטריפוגה (120,000 x גרם במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר) ומיקרו-סינון (מסנן 0.22 מיקרומטר).
  10. מחלקים את החצילים המרחפים לשתי תרביות (100 מ"מ). כל צלחת תרבית חייבת לכלול 10 מ"ל של צמחים מרחפים מחדש.
  11. לאחר מכן, מניחים את אחת הצלחות המכילות חצילי שליה בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס עם 8% חמצן ו -5% CO2), תוך הנחת השנייה בתא היפוקסי עם 1% O2.
    הערה: (אופציונלי) ניתוח של כדאיות רקמות יכול להתבצע באמצעות אותם מיצוי רקמות 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay (MTT assay) כמתואר במקום אחר37,38. השתמש בריכוז החלבון הכולל שנמדד בהומוגנאטים של explants כדי לנרמל ערכי MTT.
  12. לאחר 18 שעות בתרבית, קצרו את המדיה המותנית של הצמחים לתוך צינור חדש של 15 מ"ל.
    הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא מדיה מותנית (-80 °C) לתקופה ממושכת (שבועות).

2. בידוד sEV שמקורו בשליה

  1. בודד sEV מהתווך המותנה באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה דיפרנציאלית ומיקרו-סינון בעקבות דוחות שפורסמו בעבר25,39.
  2. בצע צנטריפוגה רציפה עבור המדיום המותנה שנקטף. השלבים הרציפים של הצנטריפוגות הם: (1) 300 x גרם למשך 10 דקות, (2) 2000 x גרם למשך 10 דקות, (3) 10,000 x גרם למשך 30 דקות, ו-(4) 120,000 x גרם למשך שעתיים. בצע את הצנטריפוגות בטמפרטורת החדר.
  3. בכל הצנטריפוגות הללו, באמצעות פיפטה של 20-100 מיקרוליטר, אוספים בזהירות את הסופרנאטנט ומשליכים את הכדורית.
  4. לאחר שתסיים, העבר את הסופרנאטנט האחרון שנאסף דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, בצע צנטריפוגה אחת נוספת ב 120,000 x גרם במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. לאחר מכן, יש להשליך את הסופרנאטנט תוך כדי השעיה מחדש של הגלולה (המכילה שליית שליה) ב-500 מיקרוליטר של PBS (pH 7.4) ושוב לעבור דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. לבסוף, בצע צנטריפוגה אחרונה ב 120,000 x גרם במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר מכן, השהה מחדש את הגלולה (המכילה sEV שליה) ב 500 μL של PBS (pH 7.4, שהתרוקן בעבר מ- sEVs) ועבור דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
  7. תייג את הדגימות כמלאי של sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) או sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    הערה: הכינו אליציטוטים של 50-100 μL של כלי הרכב החשמליים המבודדים לניסויים נוספים. ניתן לאחסן כלי רכב חשמליים קטנים בטמפרטורה של -80°C לתקופה ממושכת (חודשים).
  8. אפיינו את ה-sEV השליה לפי גודל, ספירה וסמן חלבון sEVs, כפי שדווח קודם לכן25. קוטר החלקיקים הממוצע האידיאלי של sEV הוא 50-150 ננומטר.
    הערה: אפיון sEV כולל זיהוי חיובי של CD63, Tsg101, Alix ו-HSP70 (כלומר, כדי לאפיין אוכלוסיית sEV מועשרת באקסוזומים). כמו כן, השתמש PLAP כסמן של מקור שליה25.
  9. מדוד את כמות החלבון הכוללת בתמיסת sEVs באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    הערה: איור 1 מראה סקירה כללית של תרבית השליה ובידוד שלפוחית חוץ-תאית.

3. הזרקת עכברים

  1. מרדימים את בעל החיים בתא השראת הרדמה עם פיזור איזופלורן של 5% (ראה טבלת חומרים). ודא את רמת ההרדמה באמצעות צביטת בוהן.
  2. לאחר ~40 שניות, הכניסו את העכבר למערכת ההרדמה באמצעות מסכת פנים ושמרו על רמת הרדמה של 2% איזופלורן.
  3. לאחר מכן, מקם את החיה על פלטפורמת חימום (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר של 28 °C (75 °F). שמרו על העיניים משומנות בדמעות מלאכותיות.
  4. לפני ההזרקה, לדלל sEV שליה (200 מיקרוגרם של חלבון כולל) עם חיץ פוספט (pH, 7.4) עד להגיע נפח סופי של 70 μL.
  5. יש לחטא את אזור ההזרקה באמצעות 70% אתנול וצמר גפן. הקפד להשתמש במזרק אינסולין עם מחט 30 גרם כדי להזריק את תמיסת sEVs.
    הערה: ניתן למקם את המזרק על פלטפורמת החימום למשך 5 דקות כדי להשיג טמפרטורה פיזיולוגית.
  6. לאחר מכן, להזריק את הפתרון לתוך וריד jugular חיצוני. שלב זה דורש הכשרה מיוחדת.
    הערה: יש לבצע את ההליך בזהירות, תוך נסיגה איטית של המחט ושאיפה עדינה לעדות לריפלוקס דם.
  7. לאחר ההזרקה, יש להפעיל לחץ קל על האזור המוזרק למשך ~15 שניות בעזרת צמר גפן יבש. לאחר מכן, להחזיר את החיות לכלובים שלהם.
  8. הקפד להעריך את התודעה וההתנהגות במשך 15 דקות. אינדיקטור להישג תודעתי הוא התאוששות בעלי החיים של הפעילות המוטורית הכוללת.
    הערה: הקפידו לשמור על טמפרטורה חמה בכלובי בעלי החיים.

4. תרדמת מורין מהירה וסולם התנהגות (RMCBS)

  1. השתמש RMCBS כדי להעריך את הפרמטרים נוירולוגיים ורווחה של בעלי חיים40.
    הערה: RMCBS מאפשר הערכה מהירה (~ 3 דקות) עם לחץ מינימלי על בעלי חיים עקב התערבות המפעיל. RMCBS יש עשרה פרמטרים (כל ציון הוא 0-2).
  2. הערך את רווחת העכבר עם סולם RMCBS ב- 0 שעות (לפני הזרקת sEVs) ו- 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות לאחר ההזרקה.
    הערה: בצעו ניתוח של claudin-5 (ב-6 שעות לאחר הזרקת sEVs) והאקסטרווסציה הכחולה של אוון (ב-24 שעות לאחר הזרקת sEVs) כדי להעריך את ההפרעה של BBB (איור 2).

5. ניתוח האקסטרווסציה הכחולה של אוון

  1. לאחר הזרקת שליה (24 שעות), מרדימים את העכברים כמתואר בשלב 3.1.
  2. הכינו את התמיסה הכחולה של אוון (2%, מדוללת בתמיסת חיץ פוספט, 1x) (ראו טבלת חומרים).
  3. באמצעות גישה רטרו-מסלולית25, להזריק את הפתרון הכחול של אוון ב 2 מ"ל / ק"ג.
  4. אפשר לתמיסה הכחולה של אוון לזרום במשך 20 דקות תחת תחזוקה של הרדמה.
  5. לאחר מכן, בצע זילוח תוך לבבי בעקבות פרוטוקול41 שתואר קודם לכן עם תמיסת מלח (~ 3 מ"ל, 0.9%, w / v) כדי להסיר את הצבע הכחול של אוון ממחזור הדם. שלב זה הוא חובה.
    הערה: עבור הליך זה, הגדל את ההרדמה ל -5% וודא מישור עמוק של הרדמה (כלומר, ירידה דרסטית בקצב הנשימה).
  6. חשוף את הלב באמצעות בית החזה המדיאלי41 (איור 3).
  7. לאחר מכן, לתקן את כל החיה עם עירוי intracardial של פתרון paraformaldehyde (4% ב PBS, v/v).
    הערה: בדוק את קשיחות הזנב לניטור הקיבוע המתאים.
  8. יתר על כן, לאחר השלמת הקיבוע, בזהירות לחלץ את המוח, לשקול אותו, ולצלם אותו41. צלם תמונות כשכל המוח קרוב לסרגל42.
  9. לאחר מכן, הכניסו את המוח לכלי פריסה של עכבר המוח (ראו טבלת חומרים).
  10. נתחו את המוח לתשעה חלקים, עגורן-קאודלי, כולל המוח הקטן (100 מיקרומטר כל קטע).
  11. לאחר הנתיחה, דמיינו ולכדו תמונות של פרוסות המוח במיקרוסקופ סטריאו-זום (ראו טבלת חומרים).
  12. השתמש בתמונות שצולמו כדי לכמת את האקסטרווסציה הכחולה של אוון באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כדי לנתח את נוכחות הצבע הכחול של אוון, קבע את הערכים הכחולים של אוון באמצעות בקרה חיובית של אזור המוח (מחיית ביקורת בעלי חיים המוזרקת עם צבע אך ללא זילוח תוך לבבי). הערכים הכחולים של אוון המתקבלים מבקרה חיובית הם בדרך כלל בין 75 ל-110 בהיסטוגרמה האינטנסיבית של הערוץ הכחול (איור 4).
  13. ודא שתמונות המוח מנותחות באופן עיוור על-ידי קבוצת הניסוי המתאימה כדי למנוע הטיית צופה. לחלופין, כמת את האקסטרווסציה הכחולה של אוון על ידי הומוגניזציה מוחית ואחריה ספקטרוסקופיה43.
    הערה: בניסויים נפרדים, תוך שימוש במוחות שבודדו לאחרונה מעכברים שהזריקו sEV (6 שעות), נתחו את רמות החלבון של קלודין 5 (CLND-5) (ראו טבלת חומרים), צומת הדוק קריטי המעורב בהידוק של BBB44 (איור 5).

תוצאות

פרוטוקול זה מעריך את היכולת של sEVs שמקורם בשליות שגודלו בתרבית בהיפוקסיה לשבש את BBB בעכברות שאינן הרות. שיטה זו מאפשרת להבין טוב יותר את הקשר הפוטנציאלי בין השליה למוח בתנאים נורמליים ופתולוגיים. בפרט, שיטה זו עשויה להוות פרוקסי לניתוח השתתפות sEV שליה בהופעת סיבוכים מוחיים ברעלת הריון.

בניגוד לעכברים שקיבלו sEVs-Nor, עכברים שקיבלו sEVs-Hyp מראים ירידה הדרגתית בניקוד הנוירולוגי עד 24 שעות (טבלה 1), מה שמרמז על יכולת sEVs-Hyp לפגוע בתפקוד המוח.

כמו כן, מוחות עכברים מקבוצת ההזרקות sEVs-Hyp הם בעלי משקל טרי גבוה יותר מאלה שבודדו מעכברים שבודדו עם sEVs-Nor או עכברי ביקורת (0.51 ± 0.008; 0.46 ± 0.008; 0.47 ± 0.01 גרם, בהתאמה), אשר עשויים להוות אינדיקטור גס של בצקת מוחית45.

בהתאם לממצא זה, פרוטוקול זה מאפשר לזהות את האקסטרווסציה הכחולה של אוון כאינדיקטור לשיבוש BBB. בהקשר זה, למוחות של עכברים שהוזרקו להם sEVs-Hyp יש אקסטרווציה כחולה גבוהה יותר של אוון מאשר למוחות מקבוצת sEVs-Nor (איור 5A).

אף על פי שהמנגנון הבסיסי של הפרעה ל-BBB המושרה על-ידי sEVs-Hyp לא נותח באמצעות פרוטוקול זה, התוצאות מצביעות גם על כך שעכברים שהזריקו sEVs-Hyp הראו כמויות חלבון נמוכות יותר של CLND-5 באזורים שבהם BBB היה מושפע ביותר (כלומר, אזורים אחוריים) (איור 5B). לכן, ייתכן ש-sEVs-hyp פוגע בביטוי התפקוד של חלבון הצומת ההדוק האנדותל הקריטי הזה.

figure-results-1
איור 1: תרבית חציל שליה ופרוטוקול בידוד שלפוחית חוץ-תאית. (A) תרביות שליה רגילות. (B) צמחים מחולקים לשני תנאים לביוגנזה של שלפוחיות שליה קטנות חוץ-תאיות (sEVs). נורמוקסיה (sEVs-Nor, 8% O2) או היפוקסיה (sEVs-Hyp, 1% O2) במשך 18 שעות. (C) מדיה מותנית נקצרת, מסוננת וצנטריפוגה כדי לסלק פסולת תאים. (D) כלי רכב חשמליים מבודדים על ידי אולטרה-צנטריפוגציות. (E) כלי רכב חשמליים מאופיינים באמצעות ניתוח ננו-מעקב וכתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הערכה In vivo של פרוטוקול הפרעה במחסום דם-מוח. עכברי C57BL6/J לא בהריון, בני 4-6 חודשים, משמשים. (A) באמצעות וריד הצוואר החיצוני, בעלי חיים קיבלו sEV (200 מיקרוגרם של חלבון כולל) שבודדו מתרביות שליה נורמוקסיות (sEVs-Nor, 8% O2) או היפוקסיות (sEVs-Hyp, 1% O2). RMCBS מנוטר ב 0-24 שעות לאחר ההזרקה. (B) 6 שעות לאחר הזרקת sEV, המוח מופק ומחולק לתשעה מקטעים לצורך מיצוי חלבונים. קלודין 5 (CLDN5) מנותח בהומוגנאטים של אותם תשעה חלקים. (C) ניתוח האקסטרווסציה הכחולה של אוון (24 שעות לאחר הזרקת sEVs) נותח לאחר הזרקת ניקוב רטרו-מסלולית בכל אחד מתשעת המקטעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צילומים תיעודיים של הצבע הכחול של אוון ופרוטוקול זילוח תוך לבבי. (A) העכבר קיבל את הכחול של אוון באמצעות הזרקה רטרו-מסלולית. (משמאל) חיה לפני ו(ימין) אחרי הזרקה (15 שניות) של הכחול של אוון. (B) Thoracotomy לביצוע זילוח תוך לבבי של תמיסת חיץ פוספט (1x PBS) ופרפורמלדהיד (4% PFA). החדר השמאלי מחודד עם קצה המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח האקסטרווסציה הכחולה של אוון לאחר הזרקת sEVs. (A) תמונה מייצגת של המוח כולו המראה את האקסטרווסציה הכחולה של אוון. הקו המקווקו מייצג תשעה מקטעים המתקבלים מהמוח כולו. (B) מוח מנותח באמצעות כלי פריסה של עכברי מוח. (C) תמונות מייצגות של פרוסות מוח ב-24 שעות לאחר הזרקת sEV. בקרה (CTL), שליה בתנאים נורמוקסיים (sEVs-Nor) או היפוקסיים (sEVs-Hyp). סרגל קנה מידה = 0.4 ס"מ. (D) מתאר דיגיטלי של פרוסת המוח באמצעות ImageJ. (E) היסטוגרמה בערוץ הכחול. ערכים בין 75-110 משויכים לאקסטרווסציה הכחולה של אוון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: האקסטרווסציה הכחולה של אוון ורמות קלודין-5 בעכברים שהוזרקו להם sEV שבודדו מצמחי שליה. (A) אחוז האקסטרווציה הכחולה (EB) של אוון בהתחשב בכל חלקי המוח. בקרה (CTL, כחול), שליה במצב נורמוקסי (sEVs-Nor, אדום) או היפוקסי (sEVs-Hyp, ירוק). (B) רמות יחסיות של קלודין 5 (CLDN5) בתשעת חלקי המוח התקבלו משלוש קבוצות הניסוי. β-אקטין משמש כבקרת טעינה. הערכים הם ממוצע ± טווח בין-רבעוני. כל נקודה מייצגת נבדק ניסוי בודד. *p < 0.05, **p < 0.005. עמ' < 0.0001. עמ' < 0.001; מבחן ANOVA ואחריו Bonferroni לאחר המבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זמן (ח)לשלוטsEVs-נורמוקסיהsEVs-היפוקסיהאנונימי
018.75 ± 0.25019.5 ± 0.28818.75 ± 0.250נ.ס.
319.5 ± 0.86617 ± 0.70713.25 ± 1.750*α0.006
619.25 ± 0.75017 ± 0.57711.75 ± 1.250*α0.002
1219.5 ± 0.64516.75 ± 1.10913 ± 0.816*α0.001
2419.4 ± 0.28817.75 ± 0.25010.25 ± 0.853*α<0.0001
*P < 0.01 לעומת שליטה. αp < 0.01 לעומת sEVs-Normoxia

טבלה 1: תרדמת מורין מהירה וסולם התנהגות (RMCBS) לאחר הזרקת sEV של 24 שעות. הציון מבוטא כממוצע ± SEM. ציוני בעלי החיים הקרובים ביותר ל -20 הם סטנדרטיים, בעוד שככל שהציון נמוך יותר, כך תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית גבוה יותר.

דיון

מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי25.

מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד לקוי של האנדותל באיברים שונים באמצעות מודלים במבחנה 46,47. מחקר זה בחן במיוחד את מחסום הדם-מוח, והציע נקודת מבט חדשה על כלי רכב חשמליים שבודדו משליה בתרבית היפוקסיה, המשבשת מחסום חיוני זה. תגליות אלה מציגות תחום מחקר חדש שבו כלי רכב חשמליים עשויים לשמש כערוץ תקשורת בין השליה למוח בתרחישים נורמליים ופתולוגיים כאחד, כמו רעלת הריון.

הפרוטוקול המוצג הוא פשוט, אך מספר צעדים קריטיים מצדיקים אזכור. פרוטוקול זה מחייב שליות טריות תוך שעה לאחר הלידה. כמו כן, אנו ממליצים לא להאריך את תקופת התרבית מעבר ל-24 שעות כדי למנוע התפרקות רקמות. פרוטוקול זה מפחית זיהום פוטנציאלי מכלי רכב חשמליים המיוצרים על ידי שליות עכבר. ניתוח דיגיטלי של האקסטרווסציה הכחולה של אוון גוזל זמן. יתר על כן, הכתם הכחול של אוון פחות בולט לאחר חתך המוח. לכן, מומלץ לבצע הגדרה ראשונית לזיהוי הטווח הכחול באמצעות בקרה חיובית. ניתן להשתמש גם בשליטה שלילית, כגון מוח מעכבר שאינו נתון לזריקה הכחולה של אוון. ניתוח עיוור של קבוצות ניסוי הוא הכרחי כדי למנוע הטיית צופים פוטנציאלית.

מספר אתגרים עשויים להתעורר במהלך פרוטוקול זה. מגבלה משמעותית טמונה בשונות ביולוגית שמקורה הן בשליות אנושיות והן בעכברים מוזרקים. כדי להבטיח את יכולת השחזור של ניסויי האקסטרווזיה הכחולה של אוון, מוצע לקבוע מנות sEV שבודדו משליות אנושיות. בחרנו במינון של 200 מיקרוגרם של חלבון כולל; עם זאת, כמות זו עשויה להשתנות בהתאם לטוהר השלפוחית, יעילות הזרקת הצוואר, הממשל הכחול של אוון, הפינוי שלה ממערכת הדם, ולא פחות מכך, ההשפעה הביולוגית של כלי רכב חשמליים בהתחשב בתכולתם.

המנגנונים התאיים שבאמצעותם כלי רכב חשמליים מהשליה האנושית יכולים לשבש את מחסום הדם-מוח מחייבים ניסויים נוספים. עם זאת, שיטה זו היא רלוונטית, רומזת על תקשורת פוטנציאלית בין השליה למוח, המצדיקה חקירה נוספת. לכן, מחקרים עתידיים מעודדים, להתרכז sEVs ואת האינטראקציות שלהם עם מחסום הדם-מוח, כמו גם את ההשפעה של המטען שלהם על רקמות עצביות. השאלה אם פגיעה במחסום הדם-מוח מובילה להשלכות מתמשכות על המוח האימהי מצדיקה בדיקה נוספת.

גילויים

למחברים אין שום ניגוד עניינים להצהיר.

תודות

המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health על תרומתם רבת הערך. כמו כן, מיילדות וצוות קליני משירות המיילדות והגינקולוגיה שייכים לבית החולים דה צ'ילאן, צ'ילה. נוסדה על ידי Fondecyt Regular 1200250.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים בוגרים מטריצת מוח מודפסת בתלת מימדקובץ גישה פתוחהעכברים בוגריםפורס מוח עכברים בוגרים. מודפס בחוט PLA.
נוגדן ראשוני אנטי &בטא;-אקטיןסיגמא-אולדריץ'קלון AC-74נוגדן לבקרת העמסה (כתם מערבי)
אנטי-קלודין5 נוגדן ראשוניסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-374221נוגדן ראשוני לחלבון צומת הדוק CLDN5 של עכברים BBB (כתם מערבי)
ערכת חלבון BCAThermo Scientific23225ערכה למדידת ריכוז חלבון
מדיה תרבית #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500אמצעי תרבית לצמחי שליה
D180 חממת CO2RWD Life scienceD180חממה סטנדרטית לייצוב צמחים ותרביות sEVs-Nor
Evans צבע כחול  > 75% 10 גרםSigma-AldrichE2129.10Gצבע לניתוח הפרעה במחסום הדם המוח IN VIVO
סרום בקר עוברי 500 מ"לתרמו Fisher Scientific16000044 גורם גדילה תוסף למצע תרבית 200
Himac Ultracentrifuge CP100NXHimac eppendorfgroup 5720410101אולטרה-צנטריפוגה למדיה מצומצמת > 1,20,000 x
g תוכנת ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 מ"לUSP Baxter212-094חומר הרדמה באינהלציה נדיף לעכברים
ערכת CellTiter 96 לא רדיואקטיבית Promega0000105232In vitro בדיקה לכדאיות צמחי שליה
עכבר IgG נוגדן משניThermo Fisher ScientificMO 63103נוגדן משני ל-CLDN5 (כתם מערבי)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090ניתוח ננו-מעקב של חלקיקים מאקספלנטים של שליה מדיה מצומצמת
Paraformaldehide E 97% תמיסה 500 מ"לThermo Fisher ScientificA11313.22תמיסה מקבעת לפרוסות רקמת מוח וזלוף תוך קרדיאלי (פעם מדוללת)
PBS 1 X pH 7.4 500 מ"לThermo Fisher Scientific10010023Wash לאקספלנטות
שליה Peniciline-Streptomicine 100x 20 מ"לThermo Fisher Scientific10378016 אנטיביוטיקה לחומרי
תרבית צמחי שליהProOX C21 Cytocentric O2 ו-CO2 בקר תת-תאBioSpherixSCR_021131ווסת CO2 לגרימת היפוקסיה בתא אטום עבור sEVs-Hyp
נתרן תיופנטל 1 גרםChemie7061סוכן המתת חסד הומניטרי
Somnosuite מערכת הרדמה בזרימה נמוכהKent ScientificsSS-01Isoflurane וופורייזר למכרסמים קטנים
פלטפורמת התחממות כירורגיתKent ScientificsA41166פלטפורמת חימום להרדמה תחזוקתית בעכברים
מסנני מזרק, פוליטטרפלואורואתילן (PTFE), הידרופובי, 0.22 ומיקרו; m, סטרילי, 25 מ"מSouthern labware10026סינון של חומר מצומצם שנקטף מצמחי שליה 
מיקרו צנטריפוגות שולחניות במהירות גבוהה  HITACHI HIMAC CT15E/CT15REהיטאצ'י מערכות רפואיות6020צנטריפוגות טוריות של מדיה מורכבת < 1,20, 000 x g
סטריאומיקרוסקופ טרינוקולרי מועבר ואור רפלקטיבי 10x-160x Center Medical2597סטריאומיקרוסקופ לרישום פרוסות מוח
תמיסת

מקורות

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64(2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000(2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670(2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68(2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451(2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2(2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22(2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124(2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Evans Blue
הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.