הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הטכניקה הכירורגית להשתלת מערך אלקטרודות על עצב הואגוס הבטני בחולדות, יחד עם שיטות לבדיקה וגירוי אלקטרופיזיולוגיים כרוניים באמצעות המכשיר המושתל.
מאמר שיטה
ניתוח השתלה לגירוי עצב הואגוס בטני ותיעוד מחקרים בחולדות ערות
במאמר זה
סיכום
תקציר
גירוי עצבי הואגוס בטני (VNS) יכול להיות מיושם על הענף התת-סרעפתי של העצב התועה של חולדות. בשל מיקומו האנטומי, אין לו השפעות נשימתיות ולבביות מחוץ למטרה הקשורות בדרך כלל VNS צוואר הרחם. היעדר השפעות נשימתיות ולבביות מחוץ למטרה פירושו שאין צורך להוריד את עוצמת הגירוי כדי להפחית את תופעות הלוואי הנפוצות במהלך VNS צוואר הרחם. מחקרים מעטים שנעשו לאחרונה הדגימו את ההשפעות האנטי-דלקתיות של VNS בטני במודלים של חולדות של מחלות מעי דלקתיות, דלקת מפרקים שגרונית והפחתת גליקמיה במודל חולדות של סוכרת מסוג 2. חולדה היא מודל נהדר לחקור את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו בגלל האנטומיה המבוססת היטב של העצב התועה, גודלו הגדול של העצב המאפשר טיפול קל, והזמינות של מודלים רבים של מחלות. במאמר זה אנו מתארים את השיטות לניקוי ועיקור מערך אלקטרודות VNS בטני ופרוטוקול כירורגי בחולדות. אנו גם מתארים את הטכנולוגיה הדרושה לאישור גירוי על-ידי רישום פוטנציאלי פעולה מורכבים מעוררים. ל-VNS בטני יש פוטנציאל להציע טיפול סלקטיבי ויעיל למגוון מצבים, כולל מחלות דלקתיות, והיישום צפוי להתרחב בדומה ל-VNS צוואר הרחם.
מבוא
גירוי עצבי הואגוס (VNS) המועבר באתר צוואר הרחם בצוואר הוא טיפול שאושר על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לאפילפסיה עקשנית, דיכאון עקשן ושיקום שבץ לאחר איסכמי1, ואושר על ידי הנציבות האירופית לאי ספיקת לב באירופה2. VNS צוואר הרחם לא פולשני מאושר על ידי ה- FDA למיגרנה וכאב ראש1. היישום שלה צפוי להתרחב, עם ניסויים קליניים אחרונים המראים יעילות של VNS באינדיקציות אחרות כגון מחלת קרוהן3, דלקת מפרקים שגרונית 4,5 ופגיעה בסבילות גלוקוז וסוכרת מסוג 2 6,7. למרות שהוא מבטיח, VNS צוואר הרחם יכול לגרום לברדיקרדיה ודום נשימה עקב הפעלה מחוץ למטרה של סיבי העצב המעצבבים את הריאות והלב 8,9,10. תופעות לוואי כגון שיעול, כאב, שינוי קול, כאבי ראש ועלייה במדד דום נשימה-היפופניאה מדווחות בדרך כלל בחולים שקיבלו VNSצוואר הרחם 11,12. הפחתת כוח הגירוי היא אסטרטגיה נפוצה להפחתת תופעות לוואי אלה, אולם מטען מופחת עלול להגביל את יעילות הטיפול VNS על ידי כישלון להפעיל סיבים טיפוליים11. לתמיכה בהשערה זו, שיעור המגיבים של חולים שקיבלו גירוי בעוצמה גבוהה לטיפול באפילפסיה היה גבוה מזה של חולים שקיבלו גירוי בעוצמה נמוכה13.
VNS בטני מוחל על העצב התועה התת-סרעפתי, מעל ענפי הכבד והצליאק14 (איור 1). המחקר הקודם שלנו הראה כי בחולדות VNS בטני אינו גורם לתופעות לוואי לבביות או נשימתיות הקשורות ל- VNS10 בצוואר הרחם. מחקרים קודמים הדגימו גם השפעות אנטי דלקתיות של VNS בטני במודל חולדות של מחלות מעי דלקתיות ודלקת מפרקים שגרונית10,15, כמו גם ירידה בגליקמיה במודל חולדות של סוכרת מסוג 216. לאחרונה, טכנולוגיית VNS בטני תורגמה לניסוי קליני ראשון בבני אדם לטיפול במחלות מעי דלקתיות (NCT05469607).
מערך אלקטרודות העצבים ההיקפיים המשמש להעברת גירוי לעצב הואגוס הבטני (WO201909502017) פותח במיוחד לשימוש בחולדות, והוא מורכב משניים עד שלושה זוגות אלקטרודות פלטינה הממוקמים במרחק של 4.7 מ"מ זה מזה, הנתמכים על-ידי שרוול אלסטומר סיליקון ברמה רפואית, לשונית תפירה לעיגון המערך לוושט, חוט עופרת ומחבר מלעורי שיותקן באזור המותני (איור 2)). חוט העופרת מנהור מתחת לעור בצד שמאל של החיה. תכנון זוגות אלקטרודות מרובות מאפשר גירוי חשמלי של העצב, כמו גם רישום פוטנציאלי פעולה מורכבים מעוררים חשמלית (ECAPs), אשר מאשר מיקום נכון של השתל על העצב ועוצמות גירוי suprathreshold. VNS בטני נסבל היטב בחולדות הנעות בחופשיות במשך חודשים 10,15,16. זה מאפשר להעריך את יעילותו על מודלים של מחלות.
כתב יד זה מתאר את השיטות לעיקור מערך האלקטרודות, ניתוח השתלת עצב הואגוס בטני, גירוי כרוני ורישום של ECAPs בחולדות ערות לחקר היעילות של VNS בטני במגוון מודלים של מחלות. שיטות אלה פותחו במקור לחקר היעילות של VNS בטני במודל חולדה של מחלות מעי דלקתיות10 ושימשו בהצלחה גם עבור מודל חולדה של דלקת מפרקים שגרונית15 וסוכרת16.
פרוטוקול
כל הנהלים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים סנט וינסנט (מלבורן) ועמדו בקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה) וחוק צער בעלי חיים (1986). בסך הכל, 24 נקבות חולדות אגוטי כהות (בנות 8-9 שבועות) שימשו למחקר זה. קבוצות הניסוי כללו: עוקבה רגילה (n = 8) שלא קיבלה זריקת קולגן או שתל VNS; עוקבת מחלה לא מגורה (n = 8) שקיבלה שתל וזריקת קולגן (לא נערכו בדיקות אלקטרופיזיולוגיות); וקבוצת מחלה מגורה (n = 8) שקיבלה שתל, זריקת קולגן, בדיקות אלקטרופיזיולוגיות וטיפול VNS. ניתוח ההשתלה התרחש 5 ימים לפני הזרקת קולגן, וההתרגלות לטיפול VNS החלה 4 ימים לאחר הזרקת הקולגן והתרחשה במשך 7 ימים. טיפול VNS יושם מהיום ה-11 עד ה-17 (כולל) לאחר הזרקת קולגן15. עבור קבוצת המחלה המגורה, הבדיקה האלקטרופיזיולוגית בוצעה מיד לאחר ניתוח ההשתלה בהרדמה, ביום הזרקת הקולגן, 10 ימים לאחר הזרקת הקולגן וביום הפסקת ההזרקה (17 יום לאחר הזרקת הקולגן).
1. סוניקציה ועיקור של מערך האלקטרודות
- הגדר את השואב הקולי לתדר של 80 קילוהרץ ומלא את המיכל הקולי במי ברז. השקיעו את מערך האלקטרודות בתמיסת הניקוי במיכל פלסטיק נקי והניחו אותו במיכל האולטרסוני.
הערה: פתרון הניקוי וזמן הניקוי שישמשו עבור כל שלב מסוכמים בטבלה 1. השתמש במיכל נקי עבור כל שלב. - הכניסו את מערך האלקטרודות הסוניות לשקית עיקור באמצעות מלקחיים נקיים עם תמיסת ניקוי נוזלית 0.5% במים מזוקקים ושטפו במים מזוקקים. בצע Autoclave מערך האלקטרודות במשך 45 דקות עם טמפרטורה מקסימלית של 130 ° C, ולתת לו להתייבש על ספסל נקי.
2. השתלת מערך אלקטרודות על עצב הואגוס הבטני
הערה: במחקר זה השתמשנו בנקבות חולדות אגוטי כהות (גילן 8-9 שבועות)15. כמו כן, השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי להשתיל באופן כרוני חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים (בגילאי 10-14 שבועות)10,16. הניתוח מתבצע בתנאים אספטיים, וכל המכשירים, מערך האלקטרודות והחומרים המתכלים כגון גזה וקצות כותנה מעוקרים על ידי אוטוקלאבינג.
- מרדימים את החולדה בתא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה חמצן. ברגע שאין רפלקס דוושה לצביטת בהונות, העבירו את החולדה למזרן החום עם תרמוסטט על שולחן הניתוחים והניחו מסכת איזופלורן על האף.
- עקוב אחר קצב הנשימה וטמפרטורת פי הטבעת לאורך כל הניתוח והתאם את רמת האיזופלורן בין 1.5% ל -2.5% כדי לשמור על קצב הנשימה בין 40 ל -62 נשימות בדקה. התאימו את הגדרת שטיחון החימום במידת הצורך, כדי לשמור על טווח טמפרטורות פי הטבעת בין 35.9 ל-37.5 מעלות צלזיוס.
- מתן משככי כאבים לפני תרופות תת עורית באמצעות מזרקים 1 מ"ל עם מחטים 25G (קרפרופן 5 מ"ג / ק"ג ובופרנורפין 0.03 מ"ג / ק"ג תת עורית) לפני תחילת הניתוח.
- יש לגלח בנדיבות סביב אזור החתך, כולל האזור לאורך קו האמצע הגחוני מתהליך הקסיפואיד ועד סוף כלוב הצלעות, האספקט המותני של הגב לאורך קו האמצע הגבי, והצד השמאלי של הגוף בין הגפה הקדמית לגפה האחורית כדי לאפשר מנהור תת עורי של המערך.
- נקו את אתרי הניתוח בתנועה מעגלית שלוש פעמים עם סבבים מתחלפים של בטאדין ואלכוהול והניחו וילון כירורגי על החיה. מתן bupivacaine (1-2 מ"ג / ק"ג) תת עורית באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G באתרי החתך הגבי והגחוני.
- מניחים את בעל החיים בשכיבה גחונית ומבצעים חתך באורך 2 ס"מ בגב, שם יעוגן הכן המלעורי באמצעות להב אזמל.
- סובבו את החולדה לשכיבה גבית ובצעו חתך של 3 ס"מ בעור לאורך קו האמצע ממש מתחת לתהליך הקסיפואיד באמצעות להב אזמל. החזיקו את העור בסמוך למקום החתך, ובעזרת מספריים מנתחים את שכבת העור משכבת השריר סביב החתך.
- כדי לאפשר מנהור תת עורי של המערך מהכן לאתר ההשתלה, מניחים את בעל החיים על צדו הימני, מכניסים המוסטאט מהחתך הגחוני וחותכים קהה לכיוון אתר החתך הגבי. חתכו את השפה של מכסה המחט והכניסו את מערך האלקטרודות כדי להגן עליו בזמן המעבר (איור 1B). בעזרת הידיים (יש ללבוש כפפות סטריליות), מנתבים את מערך האלקטרודות מתחת לעור לכיוון החתך הגחוני.
- כדי לגשת לוושט ולעצב התועה, הניחו את בעל החיים שוב בשכיבה גבית. בצע חתך של 3 ס"מ על שכבת השריר לאורך קו האמצע מתחת לתהליך xyphoid, גדול מספיק כדי לחשוף את כל אורך הכבד. הימנע מפגיעה בכבד במהלך שלב זה.
- בצע חתך קטן יותר (פחות מ 1 ס"מ) על שכבת השריר לרוחב (הצד השמאלי של החיה) לחתך הגחון הראשי. מנהרו את מערך האלקטרודות דרך חתך קטן זה באמצעות מכסה המחט המשמש בשלב 2.8 כדי להחדיר את המערך לחלל הבטן.
הערה: שלב זה מפחית את המתח המופעל על אתר החתך הראשי ומקטין את הסיכון להתפוצצות התפרים. - הסירו את שכבות העור והשרירים כדי להחזיק את חלל הבטן פתוח. הקפידו לשמור על לחות הרקמות על ידי שימוש בקצוות כותנה וגזה ספוגה במי מלח סטריליים לטיפול ברקמה.
- משכו בעדינות את הכבד על ידי חיתוך רקמת החיבור סביבו באמצעות מספריים של Vannas והנחת משחזר על פיסת גזה קטנה ספוגה במי מלח להגנה. משכו בעדינות את הקיבה, כדי לאפשר יישור של הוושט והעצב התועה שמעליו, על ידי הנחת נסוג בין הוושט לקיבה.
הערה: Retractors מיוצרים על ידי עיגול הקצה המחודד של קרסי דגים. - לאחר חשיפה של פני השטח הגחונים של הוושט, זהו את עצב הואגוס הבטני ואת ענפי המשנה שלו, כולל עצב הכבד, עצב הצליאק ושני ענפי קיבה (איור 1D).
- חותכים את רקמת החיבור המבטיחה את עצב הואגוס הבטני לוושט באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים של Vannas ומנתחים את אורך העצב ממש מעל ענפי הכבד והצליאק לכיוון הסרעפת. הקפד לא לקרוע, למתוח או לצבוט את העצב. הניחו מערך אלקטרודות ליד העצב כדי לוודא שאורך מספיק של העצב מופרד מרקמת החיבור כדי להתאים למערך.
- לאחר ניקוי רקמת החיבור סביב העצב, העבירו את תפרי המשי (7-0) בצד האלקטרודה של שרוול המערך מתחת לעצב העצב. פתחו את השרוול של המערך והכניסו את העצב בזהירות לתוך תעלת המערך.
- ודא שכל אורך העצב יושב בתוך תעלת המערך. קשרו את התפרים סביב השרוול יחד כדי לסגור היטב את השרוול כדי להבטיח שהעצב לא יחליק מהתעלה. חותכים את התפרים.
- באמצעות תפר משי 7-0, תפרו את לשונית המערך על הוושט כדי לאבטח את המערך במקומו ולמנוע ממנו להתפתל. הימנע מפגיעה בענפים האחרים של עצב הואגוס או החדרת מחט עמוק מדי לתוך השריר החלק של הוושט.
- הסר בעדינות retractors ולוודא שכל הגזה הוסרה מחלל הבטן. לנהל 1-2 מ"ל של מלוחים סטריליים חמים באמצעות מזרק 1 מ"ל בחלל הבטן ולמקם מחדש את הכבד למיקום הנכון.
- סגרו את שכבת השריר עם תפר משי 3-0 בטכניקת תפר ריצה פשוטה, וצרו קשרים מרובעים בטוחים עם לפחות 3 זריקות בשני הקצוות. החלל נתפר היטב זה לזה (במרחק של כ-3 מ"מ זה מזה) למניעת סיבוכים כגון בקע/בליטה של תהליך הקסיפואידים.
- השתמש בתפר כדי לסגור את החתך של הצפק יחד עם החתך של שכבת השריר, כדי להפחית את הסיכוי להידבקות רקמות.
- בעזרת חומר תפר נספג (Vicryl 4-0), סוגרים את חתך העור. השתמש בטכניקת תפירה קבורה כגון תפר המזרן האנכי הקבור בריצה, או התפר העורי הקבור כדי למנוע מבעל החיים להסיר את התפר.
- סובבו את החיה לשכיבה גחון, ובעזרת מספריים האריכו את החתך הגבי ל-4-5 ס"מ, וחתכו עוד יותר בין השריר לשכבת העור כך שבסיס המחבר של המחבר המלעורי יוכל לשבת שטוח על שכבת השריר.
- באמצעות תפר משי 3-0, בצע 6 עד 8 תפרים פשוטים וקטועים סביב בסיס המחבר כדי לאבטח אותו לשכבת השריר שמתחת. סגרו את חתך העור בתפר משי 3-0, בטכניקת תפר מזרן אופקי, תוך הבטחת קשרים מרובעים בטוחים עם לפחות 3 זריקות.
הערה: בשלב זה, תפרי משי קלועים מועדפים בשל קלות הטיפול שלהם ויכולתם ליצור קשרים בטוחים יותר בהשוואה לתפרי מונופילמנט. - בסיום הניתוח יש לתת את התמיסה של הרטמן באופן תת עורי (1 מ"ל/100 גרם/שעה). כבו את האיזופלורן ותנו לבעל החיים להתאושש על משטח חום תוך כדי הפעלת חמצן (1.5 ליטר לדקה). לאחר שהחולדה בהכרה מלאה ובניידות מלאה, החזירו את החולדה לכלוב הביתי שלה, מונח על כרית חום, עד להחלמה מלאה מהרדמה.
- התבונן מקרוב בהתאוששות של בעל החיים מאיזופלורן וודא כי בעל החיים מסוגל לגשת למזון ולשתייה. ביומיים הקרובים, לספק מתן תת עורי של שיכוך כאבים לאחר הניתוח (carprofen 5 מ"ג / ק"ג, מדי יום) כדי להקל על הכאב. יש לעקוב אחר בעל החיים לפחות פעמיים ביום ולבדוק אם יש עדויות לעשיית צרכים, איכות הפרווה, רמת הפעילות ונוכחות של נפיחות או הפרשות מפצעי הניתוח.
- משקל שיא של החיה, ובמקרה נדיר בעל החיים מאבד 10% או יותר, להתחיל טיפול אינטנסיבי. הטיפול האינטנסיבי כולל מתן נוזלים תת עוריים (תמיסה של הרטמן, 2X10 מ"ל) בכל יום, מתן מזון נוסף כגון ירקות טריים ותוסף ג'ל תזונתי, והנחת מחצית הכלוב על כרית חום עם תרמוסטט לתוספת חום. הגדל את תדירות הניטור עד שבעל החיים יתאושש. המשך עם מתן משככי כאבים (carprofen 5 מ"ג / ק"ג, SQ, מדי יום) במידת הצורך על בסיס סולם Grimace.
3. בדיקות אלקטרופיזיולוגיות
הערה: רישום פוטנציאלי פעולה מורכבים מעוררים (ECAPs) מאשר מיקום מתאים של מערך האלקטרודות על העצב התועה. בנוסף, הקלטה של ECAPs באמצעות מערך האלקטרודות שתואר לעיל מספקת אישור סביר להפעלה חשמלית של סיבי C ווגליים ו- suprathreshold VNS10,15.
- מדוד את עכבת הקרקע המשותפת של אלקטרודות כדי להעריך את שלמותן ולזהות כל מעגלים פתוחים או קצרים של חוטים לפני הקלטת ECAPs. אלקטרודות עצב הואגוס בטני מתפקדות in vivo צריכות להיות בעלות ערכי עכבה בין 4 - 20 kΩ.
- בדקו בעלי חיים בזמן הרדמה, כלומר מיד לאחר הניתוח, או ערים ונעים בחופשיות. יש לבצע בדיקות ערות לפחות 2-3 ימים לאחר הניתוח כדי לאפשר לפצעי העור הכירורגיים להחלים ולהתייצב. אסוף את הציוד הדרוש לעכבה ולבדיקות אלקטרופיזיולוגיות הכוללות ממריץ בהתאמה אישית, מכשיר לאיסוף נתונים, מגבר דיפרנציאל מבודד ותוכנה לאיסוף וניתוח נתונים כמפורט בטבלת החומרים.
- עטפו את בעל החיים במגבת במידת הצורך, חברו כבל למחבר המלעורי האחורי וחברו את הקצה השני של הכבל למגרה. כדי לבדוק את עכבת הקרקע המשותפת של אלקטרודות, הפעילו פולסי זרם דו-פאזי (100 מיקרו-שניות לפאזה וזרם של 107 מיקרו-אמפר) בין האלקטרודה המעניינת לבין כל שאר האלקטרודות במערך.
- למדוד את מתח השיא בסוף השלב הראשון של צורת גל המתח (Vסה"כ) ולחשב עכבה כוללת (Zסה"כ) באמצעות חוק אוהם (Z = מתח/זרם).
- חבר זוג אלקטרודות לממריץ וזוג אלקטרודות לציוד ההקלטה והפעל גירוי דו קוטבי כדי ליצור ECAPs באמצעות אלקטרודת הייחוס של שתל VNS הממוקמת מתחת לעור כהפניה להקלטה דיפרנציאלית של ECAPs. בצע שני סטים של הקלטות בממוצע מתוך סך של 50 חזרות באמצעות תוכנת איסוף הנתונים וניתוחם.
- השתמש בהגדרות הבאות עבור מדידות.
זרמים: 0 עד 2 mA במרווחים של 0.1 mA;
רוחב פולס: 25 - 200 μs;
פער בין פאזות: 8 - 50 μs;
קצב גירוי: 10 - 30 פולסים לשנייה;
קצב דגימה: 100 קילוהרץ;
מסנן: מעבר גבוה 200 הרץ, מעבר נמוך 2000 הרץ, רווח מתח 1 x 102. - באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים, נתחו את תגובת ה-ECAP על-ידי מדידת מתח השיא לשיא של צורות הגל בחלון הניתוח (4-10 אלפיות השנייה לאחר הגירוי, מסומן על-ידי הצללה באיור 3A,B). סף ECAP מוגדר כעוצמת זרם הגירוי המינימלית המייצרת משרעת תגובה של לפחות 0.1 μVשיא שיא בשתי הקבוצות של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ממוצעות. תשובה תקפה תחזור על עצמה לפחות בשתי רמות נוכחיות מעל הסף, ולא תהיה קיימת לפחות בשתי רמות נוכחיות מתחת לסף10,15.
4. VNS בטן כרונית בחולדות ערות
הערה: VNS בטני יכול להיות מיושם על בעלי חיים ערים לאחר הפצע הניתוחי סביב המחבר מלעורי נרפא והתייצב. כדי להפחית כל תגובת לחץ ולאפשר איסוף נתונים טוב יותר, בעלי חיים מורגלים לסביבת הטיפול והגירוי של הבודקים, שעה אחת ביום במשך שבעה ימים לפני ניתוח ההשתלה ותחילת הטיפול ב- VNS.
- מדוד את העכבה של כל אלקטרודה כמתואר בשלב 3.4, לפני החלת VNS כלשהו. ודא כי העכבה של אלקטרודות גירוי הוא מתחת 20 kΩ.
- חבר כבל למחבר המלעורי האחורי וחבר את הקצה השני של הכבל למגרה המתוכנת להפעיל גירוי מתאים (לדוגמה, 27 הרץ, 1.6 מיליאמפר, רוחב פולס של 200 מיקרוס עם מרווח בין פאזות של 50 מיקרוגרם, 30 שניות הפעלה, 2.5 דקות מחוץל-15), והפעל את הגירוי.
הערה: למרות שבעלי חיים נצפים לעתים קרובות נרדמים במהלך גירוי אם הם מורגלים כראוי, השתמש בכבל עם חומר חיצוני מגן כגון סלילי פלדה במידת האפשר כדי למנוע ממנו להילעס. - התבונן בבעל החיים בתחילת כל מפגש טיפול VNS כדי לוודא שאין תגובה שלילית כגון טיפוח מוגזם או עלייה / ירידה פתאומית ברמת הפעילות בסנכרון עם תזמון הגירוי.
- נטר כל 30 דקות כדי לבדוק אם יש פיתול או ניתוק של הכבל. כדי להחיל VNS באופן כרוני (למשל, 3 שעות ביום במשך 7 ימים15), חזור על שלבים 4.1-4.3 בתחילת כל הפעלה.
הערה: השימוש בקומוטטור עשוי להפחית את הסיכוי שהכבלים יתעוותו ועשוי לדרוש ניטור בתדירות נמוכה יותר.
תוצאות
רישום פוטנציאלי פעולה מורכבים מעוררים (ECAPs, איור 3A,B) מיד לאחר הניתוח היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לעזור לאשר מיקום נכון של העצב בתוך ערוץ המערך, וגירוי זה יעיל בהפעלת העצב התועה.
באיור 3, נקבות חולדות אגוטי כהות (גילן 8-9 שבועות) הושתלו במערך האלקטרודות VNS. בחולדות שנבחרו באופן אקראי לקבל גירוי טיפולי, ECAPs תועדו מיד לאחר הניתוח (יום 0, איור 3A) ובסוף הטיפול ב-VNS (יום 23, איור 3B). הנוכחות של ECAPs (איור 3B) הצביעה על כך שעוצמת הגירוי הייתה מעל הסף העצבי ושהעצב הופעל בהצלחה. בעלי חיים בקבוצת הטיפול VNS לא נכללו אם ECAPs לא תועדו מכיוון שלא הייתה ערובה לכך שהגירוי הועבר בהצלחה15. ההשהיה של התגובה העצבית (איור 3A,B, מסומנת על-ידי חץ ירוק) יכולה לשמש כדי להעריך איזה סוג של סיבים הופעלו.
במחקרים קודמים ראינו שרוב התגובות העצביות מתרחשות בדרך כלל בין 4 מילישניות ל-10 מילישניות10,15. בהינתן שהמרחק בין זוגות גירוי והקלטה הוא 4.7 מ"מ, מהירות ההולכה המשוערת של חלון תגובה זה היא 0.47 - 1.2 מטר לשנייה, התואמת את מהירות ההולכה של סיבי C18.
ישנה עלייה בסף העצבי בין יום 0 (377 μA, איור 3A) ליום 23 (1335 μA, איור 3B), אשר מתרחשת לאורך זמן, ככל הנראה עקב פיברוזיס שפיר קל שנוצר סביב ממשק רקמות-אלקטרודות10,15.
איור 3C הצביע על מערך הבדיקות הניסיוני ועל מיקום המחבר האחורי, שנותר יציב למשך תקופת הבדיקה בת 3 השבועות15.
איור 1: אתרים עבור VNS צוואר הרחם ו-VNS בטני. (A) VNS צוואר הרחם מוחל מעל הענפים אל הלב ודרכי הנשימה, ו-VNS בטני מוחל מתחת לענפים האלה. (B) מערך האלקטרודות מוכנס למכסה מחט (כשהשפה מוסרת) כדי להגן עליו במהלך המנהור מתחת לעור. (C) מערך VNS בטני של חולדה מושתל ומאובטח באמצעות תפרים (D) מעל ענפי הצליאק והכבד מתחת לסרעפת. קיצורים: VN = עצב התועה, b. = ענף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערך VNS של חולדות. (A) מערך VNS של חולדות מורכב ממחבר מלעורי וממערך אלקטרודות המחוברים באמצעות חוט עופרת. (B) ניתן לתפור לשונית ליד מערך האלקטרודות לוושט כדי לסייע בייצוב מיקום המערך. מערך העצבים התועה הבטני הסטנדרטי של חולדה מגיע עם שני זוגות אלקטרודות (E1 ו-E2, ו-E3 ו-E4). ניתן להשתמש בשני זוגות האלקטרודות לגירוי או להקלטה. המחבר המלעורי מותקן על אזור העץ של החיה, וחוט העופרת מנהור מתחת לעור בצד שמאל של החיה. אלקטרודת הייחוס לאורך חוט העופרת ממוקמת מתחת לעור בצד שמאל של החיה לאחר השתלת מערך האלקטרודות. מערך האלקטרודות מושתל על העצב התועה לאורך הוושט מעל הקיבה וממש מתחת לסרעפת. (C) האורך הנוסף של חוט העופרת בצד שמאל של החיה מתחת לעור מספק הקלה במתח. קיצורים: E = אלקטרודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקבות אלקטרופיזיולוגיים אופייניים שתועדו לעצב התועה הבטני במהלך השתלה כרונית וחולדה שקיבלה טיפול VNS. (A) כל עקבות אלקטרופיזיולוגיות הן בממוצע 25 חזרות. הקופסאות הירוקות מציינות את ההשהיה האופיינית של תגובת סיבי C בעצב התועה הבטני של החולדה, בין 4 מילישניות ל-10 מילישניות (באמצעות מערך אלקטרודות עם מרחק של 4.7 מ"מ בין זוגות אלקטרודות מעוררות ורשומות, ממרכז למרכז). ECAPs מסומנים בראשי חץ ירוקים. (B) חולדה המקבלת טיפול VNS באמצעות המחבר המלעורי שעל גבה בכלוב הביתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון ניקוי | זמן סוניקציה |
| 1. 0.5% פירונג במים טהורים במיוחד | 15 דק' |
| 2. מים טהורים במיוחד | 5 דקות |
| 3. מים טהורים במיוחד | 5 דקות |
| 4. 96% אתנול | 10 דק' |
| 5. מים טהורים במיוחד | 5 דקות |
| 6. מים טהורים במיוחד | 5 דקות |
טבלה 1: שלבי סוניקציה. הטבלה מספקת פרטים על הסוניקציה שבוצעה כאן.
דיון
שיטה זו של ניתוח השתלת VNS בטני וגירוי כרוני של העצב התועה ורישום של ECAPs שימשו בהצלחה ונסבלים היטב במשך 5 שבועות בחולדות לאחר ההשתלה 10,15,16. נסיגה של הקיבה, הכבד והמעיים כדי לקבל תצוגה טובה של הוושט והעצב התועה היא אחד השלבים המרכזיים בניתוח. ברגע שאיברים אלה נסוגים, העצב התועה הופך לנגיש. נסיגה של הבטן מסתכנת בפגיעה בנשימה, ובמקרה זה הנסיגה משוחררת. בנוסף, בעת חיתוך רקמת החיבור המקיפה את הוושט כדי לגשת לעצב התועה, יש להקפיד להימנע מנזק לסרעפת, אשר יכול להוביל להפרעה בלחץ תוך חזי, דיכוי נשימתי חמור, ומוות של בעל החיים במהלך הניתוח. מומלץ לנקות את רקמת החיבור המקיפה את הוושט בדיוק מספיק כדי להתאים למערך האלקטרודות מעל ענפי הכבד והצליאק.
סיבוכים אפשריים לאחר הניתוח כוללים הידבקות רקמות סביב הוושט, בקע ואילאוס לאחר הניתוח. ניתן למזער את הידבקות הרקמה על ידי מריחה חופשית של מי מלח סטריליים בחלל הבטן במהלך הניתוח ולפני סגירת חלל הבטן. תפר סגירת שכבת הצפק יחד עם שכבת השריר אמור גם לסייע בהגנה על האיברים הפנימיים ולהפחית את הידבקות הרקמות. מכיוון שהכבד נחבל בקלות ומניפולציה של המעי עלולה לגרום לאילאוס שלאחר הניתוח, טיפול מינימלי ועדין באיברים אלה חשוב. לבסוף, במיוחד בבעלי חיים כבדים יותר, קריטי שתפרי ריצה ימוקמו קרוב זה לזה או שתפרים קטועים משמשים במקום זאת בעת סגירת חלל הבטן כדי למנוע בקע ובליט תהליך קסיפואידים.
כטיפול סטנדרטי לאחר הניתוח, יש לבדוק בעלי חיים באופן קבוע לאחר הניתוח לעדות לעשיית צרכים, שינוי במשקל, פרווה, רמת פעילות ונוכחות של נפיחות או הפרשות מפצעי הניתוח. במקרים נדירים, הפרשות מוגזמות, אדמומיות ונפיחות סביב פצעים כירורגיים עלולים להתרחש, דבר המצביע על זיהום. במקרים כאלה, אנטיביוטיקה כגון Baytril (0.2 מ"ג / מ"ל, במי שתייה במשך 3-5 ימים) ניתנים עד הזיהום נפתר. בעוד חולדות רגילות בדרך כלל מתאוששות היטב מהניתוח, חולדות עם מצבים בריאותיים פגומים (כלומר, מודלים של מחלות) עשויות לדרוש זמן רב יותר לפני שניתן יהיה להתחיל בבדיקות ובגירוי לאחר הניתוח. טיפול מתאים לאחר הניתוח (כפי שסוכם בשלב 2.26) לבעלי חיים כאלה חיוני לרווחת בעלי החיים.
אחת המגבלות של פרוטוקול זה היא שבעוד שהתכנון של מערך האלקטרודות VNS של חולדה מצוין להקלטת תגובה איטית יותר של סיבי C, המרווח בין זוגות האלקטרודות (4.7 מ"מ) עשוי שלא להתאים ללכידת פעילות של חלק מסוגי הסיבים המהירים יותר. למרות שהאורך הכולל של המערך מוגבל על ידי האורך הזמין של העצב התועה התת-סרעפתי מעל ענפי הכבד והצליאק, ניתן לרכוש מערכי VNS אלה עם זוגות אלקטרודות נוספים. מערכים כאלה עשויים לשמש כדי לחקור את היישום של גירוי חסימת שיכול לתפעל את הכיוון של VNS16,19, הרחבת השימוש האפשרי של מודל זה.
ניתן להשתמש ברישום ECAPs כדי להעריך את מיקום המערך סביב העצב, את איכות ממשק האלקטרודות ואת היכולת של המכשיר להפעיל סיבים ווגאליים. הואגוס הוא עצב אוטונומי, המורכב מ-97%-99% סיבי C18,20, כאשר 1%-3% הנותרים של הסיבים הם סיבים מיאליניים (תפקוד לא ידוע), כפי שאושר במחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת20. התגובות באיור 3 הן ככל הנראה מפעילות חשמלית של העצב התועה, ולא מפעילות מיוגנית, שכן הן מתאימות לצורה ולצורה של פוטנציאל הפעולה המורכב עבור עצב היקפי21,22. יתר על כן, מהירות ההולכה האופיינית של ECAPs עצב הואגוס בטני של חולדה היא 0.47 - 1.2 מטר לשנייה, התואמת את מהירות ההולכה של סיבי C18. במחקרי פיילוט ראשוניים לפיתוח מכשירים, ההקלטות אומתו במחקרי חולדות מורדמות על ידי חיתוך העצב התועה בין האלקטרודה המגרה לאלקטרודת ההקלטה, וכתוצאה מכך בוטלו כל התגובות המתעוררות (הנתונים לא הוצגו). מערך האלקטרודות תוכנן כך שהעצב התועה יושב בתוך תעלת פלטינה-סיליקון, ולמעשה מבודד אותו חשמלית ממבני המבנה הסובבים אותו (למשל, הוושט). גירוי והקלטה מבוצעים שניהם גם באמצעות תצורות דו קוטביות המשתמשות באלקטרודות סמוכות, מה שממזער עוד יותר את ההזדמנויות להתפשטות גירוי וזיהום של הקלטה. דיווחנו באופן עקבי על צורות גל דומות בעקבות גירוי חשמלי של עצב הואגוס הבטני בתכשירים מורדמים וערים 10,15,16,19,23, כולל מחקרים שבהם השפעות פיזיולוגיות של גירוי אישרו את הפעלת העצב הווגאלי 10,15,16. למרות שאי אפשר לשלול זיהום של ההקלטה על ידי פעילות מיוגנית, תגובות מיוגניות בדרך כלל נבדלות מתגובה עצבית בשל פרופיל משרעת הצמיחה המהיר והגדול שלהן24 בניגוד לפרופילי הגדילה המדורגים והקטנים יותר שנצפו במחקרים שלנו10,15 ובאיור 3A,B: יום 0: השהיה ברמה הנוכחית 377 μA: 7.24 אלפיות השנייה > רמה נוכחית 1750 μA: 6.74 מטר/שניה.
בעוד שהפעלת העצב התועה התת-סרעפתי המורכב כמעט כולו מסיבי C 20,25 הוכחה כיעילה לטיפול במודלים פרה-קליניים של מחלות מעי דלקתיות10, דלקת מפרקים שגרונית15 וסוכרת16, הפרמטרים האופטימליים של VNS בטני כדי למקסם את השפעתו הטיפולית לא נחקרו במלואם14. מחקר נוסף בנושא זה יועיל מאוד, שכן יישום VNS בטני לטיפול במחלות מעי דלקתיות נחקר כעת בניסוי קליני ראשון בבני אדם. כמו ההשפעה האנטי דלקתית של VNS הבטן נחשב מערכתי26, קיים פוטנציאל גדול כי טיפול זה יעיל גם עבור מצבים דלקתיים אחרים כגון זאבת אדמנתית מערכתית27 ומחלת כליות כרונית28.
מחקרי החולדות שלנו מראים של-VNS בטני יש יתרון ייחודי על פני VNS צוואר הרחם בכך שהוא אינו גורם להשפעות לבביות או נשימתיות מחוץ למטרה10. גירוי בעוצמה גבוהה יותר יכול להיות מיושם לפרקי זמן ארוכים יותר מבלי לפגוע בנשימה או בקצב הלב של החיה. בשילוב עם היכולת לעקוב אחר התגובה העצבית המעוררת המאשרת עוצמות גירוי על-טבעיות, שיטה זו מספקת מודל נהדר לחקר היעילות של VNS בטני לטיפול במגוון מחלות. ככל שהיישום של VNS ממשיך להתרחב, היישום של שיטה זו של VNS צפוי להתרחב גם כן.
גילויים
מחקר זה נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
תודות
פיתוח שתל VNS בטני של חולדה מומן על ידי הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים להגנה (DARPA) BTO, בחסות ד"ר דאג ובר וד"ר אריק ואן גיסון באמצעות המרכז למערכות לוחמה בחלל ובים (חוזה מס' N66001-15-2-4060). המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי קרן הדגירה של מכון ביוניקס. מכון ביוניקס מכיר בתמיכה שהם מקבלים מהממשלה הוויקטוריאנית באמצעות תוכנית התמיכה התשתיתית התפעולית שלה. ברצוננו להודות למר אוון ברנס על התכנון המכאני, לפרופ' ג'ון ב' פרנס על מומחיות אנטומית, לפרופ' רוברט ק' שפרד על מומחיות בממשק היקפי, נוירומודולציה והקלטה, לגב' פיליפה קמרר וגב' איימי מורלי על גידול וניסויים בבעלי חיים, לגב' פנלה מונץ וד"ר פטה גריגסבי על עצותיהן בטיפול בבעלי חיים לאחר ניתוח, ולגב' ג'ני ג'ואו ולצוות ייצור האלקטרודות מ-NeoBionica על ייצור מערכי VNS.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.9% מי מלח | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (בופרנורפין) | Jurox | ||
| מכשיר לרכישת נתונים | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (תוסף ג'ל תזונה) | ClearH2O | ||
| פינצטה Dumont, סגנון 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| פינצטה Dumont, סגנון N7, סגירה עצמית | ProSciTech | EMS72864-D | |
| סוניקטור Elmasonic P הפתרון | בקסטר | ||
| AHB2323 | |||
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA לחות ג'ל עיניים | Alcon | ||
| Igor Pro-8 תוכנה | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| מגבר דיפרנציאלי מבודד | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| פירונג נוזלי | Diversey | תמיסת ניקוי | |
| HH12291 מרקאין (Bupivacaine) | אספן | ||
| וילון פלסטיק | Multigate | 22-203 | |
| שתל עצב תועה עכברוש | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (קרפרופן) | תפר משי Zoetis | ||
| 3-0 | תפר משי Ethicon | ||
| 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| חלוק כירורגי חד פעמי סטרילי | Zebravet | DSG-S | |
| התאבדות ניקל ווים | ג'רוויס ווקר | ||
| מים טהורים | במיוחד Merck Millipre Milli-Q | רפידות תחתונות ישירות | |
| Zebravet | UP10SM | ||
| מספריים Vannas ProSciTech | EMS72933-01 | ||
| תפר Vicryl 4-0 | Ethicon |
מקורות
- Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987(2023).
- Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
- Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911(2020).
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
- Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
- Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662(2023).
- Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203(2014).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
- Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418(2019).
- Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
- Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
- Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
- Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
- Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133(2022).
- Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257(2022).
- Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
- Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
- Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479(2020).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
- Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
- Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
- Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16(2023).
- Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5(2023).
- Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
- Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
- Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149(2021).
- Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).
הדפסות חוזרות והרשאות
