טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי בתיווך כורכומינואיד על מודל מורין של קנדידאזיס פומי

קנדידה אוראלית (OC) היא הזיהום הפטרייתי העיקרי של חלל הפה; זה נגרם על ידי צמיחת יתר של קנדידה spp. גורמים מקדימים לOC כוללים תפקוד אנדוקריני, שימוש באנטיביוטיקה רחבת טווח, רדיותרפיה וכימותרפיה, חסרים תזונתיים, קסרוסטומיה (זרימת רוק נמוכה), שימוש בשיניים תותבות, היגיינה לקויה, ובמיוחד, דיכוי חיסוני¹. מבין מיני הקנדידה , קנדידה אלביקנס היא הנפוצה והארסית ביותר; הוא נמצא כמין קומנסלי בגוף האדם וכפתוגן אופורטוניסטי. ל-C. albicans יש את היכולת לשנות את המורפולוגיה שלו משמרים קומנסליים (blastopores) לחוטים פתוגניים (hyphae ו-pseudohyphae)². צורות נימה, במיוחד hyphae, יכול לפלוש אפיתל המארח על ידי אנדוציטוזה או חדירה פעילה, גרימת זיהום³. גורמי אלימות אחרים של C. albicans כוללים הידבקות, היווצרות ביופילם והפרשת אנזימים ורעלים ליפוליטיים והידרוליטיים, כגון ליפאזות, פוספוליפאזות, פרוטאינאזות וקנדידליזין⁴.

טיפולי OC כוללים שימוש בחומרים אנטי פטרייתיים, במיוחד פוליאנים ואזולים מקומיים (ניסטטין ומיקונזול)⁵. עם זאת, הם מראים יעילות רק לטווח קצר, והישנות היא תכופה. בנוסף, שימוש יתר של antifungals הוליד את הבעיה של התפתחות עמידות אנטי פטרייתית והתפשטות⁶. לכן, יש צורך בטיפולים אלטרנטיביים, כגון טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT), המשלב פוטו-נסיטייזר (PS) ואור באורך גל מתאים (זהה לזה של ספיגת PS) בנוכחות חמצן. PSS קשורים לתאים או נקלטים בהם, וכאשר הם מופעלים על ידי אור, הם מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS) שהם רעילים לתאים רגישים⁷.

ב-aPDT, אחד הפוטונסיטייזרים (PSs) שבהם נעשה שימוש הוא כורכומין (CUR), תרכובת טבעית המופקת מקני השורש של צמח הכורכום (Curcuma longa L.). יש לכורכומין תכונות טיפוליות רבות, כולל יכולות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון, אנטי-סרטניות ונוגדות חיידקים ^8,9. מחקר קודם מצא כי aPDT באמצעות CUR הפחית ביעילות C. albicans במודל murine של קנדידה אוראלית מבלי לגרום נזק לרקמות המארח¹⁰. CUR הוא הכורכומינואיד העיקרי המופק מכורכום, אבל גם פוליפנולים אחרים, כמו דמתוקסיכורכומין וביס-דמתוקסיכורכומין, נמצאים בצמח זה. aPDT בתיווך כורכומינואיד הדגים פעילות אנטיבקטריאלית נגד ביופילמים של סטפילוקוקוס זהוב שגודלו בצנתרים¹¹. עם זאת, למיטב ידיעתנו, פעילותו האנטי פטרייתית נגד C. albicans עדיין אינה ברורה. לכן, במחקר זה, הערכנו aPDT בתיווך מלח כורכומינואיד כנגד C. albicans במודל מורין של OC.

פרוטוקול המחקר לשימוש בעכברים אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (מספרי תיקים 05/2008 ו-09/2020) בבית הספר לרפואת שיניים, ארארקוארה, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) שימש כזן הייחוס. נקבות עכברים שוויצריות בנות שישה שבועות (n = 45), עם טווח מסת גוף של 20-30 גרם, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים סופקו על ידי אוניברסיטת סאו פאולו, UNESP, Botucatu.

1. הכנת PS ובחירת מקור האור עבור aPDT

1. הכינו את ה-PS בהתאם למפרט של החומר שייבדק.
   הערה: במחקר זה, תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים (תערובת מלח מסיסה במים¹² על בסיס CUR) שימשה כ-PS (ראו טבלת חומרים ואיור 1). דילולים ב-20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר ו-80 מיקרומטר (15.6, 29.2 ו-58.4 מ"ג/ליטר, בהתאמה) הוכנו במים טהורים במיוחד מיד לפני השימוש ונשמרו בטמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס.
2. בחר ציוד קל בעל אורך גל מתאים (זהה לזה של בליעת PS) המסוגל להאיר את כל המטרה הפוטונסיטית באופן אחיד ובו זמנית מבלי לחמם את הרקמה.
   הערה: במחקר זה נעשה שימוש בפריט המכיל דיודה פולטת אור (LED, ראה טבלת חומרים), שתוכננה במכון פיסיקה דה סאו קרלוס (אוניברסיטת סאו פאולו, סאו קרלוס, SP, ברזיל). הספק היציאה שסיפק האור היה 89.2 mW/cm² באורך גל כחול של כ-455 ננומטר.

2. הכנת חיסון C. albicans

1. יש לשמור את זן הייחוס C. albicans (ATCC 90028) בשמרים-פפטון-גלוקוז (YEPD, ראו טבלת חומרים) עם 50% גליצרול בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
2. מפשירים את הזן הקפוא בטמפרטורת החדר, מורחים אליקוט של 100 מיקרוליטר על צלחת פטרי עם אגר דקסטרוז סאבורו (SDA) עם כלוראמפניקול (ראו טבלת חומרים), ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות.
3. מעבירים חמש מושבות לתוך 10 מ"ל של ציר חנקן שמרים עם 2% גלוקוז (YNBg) בינוני וגדלים באופן אירובי ב 37 ° C במשך 16 שעות.
4. לדלל את תרבית השמרים ב- YNBg טרי (1:10) ולדגור באופן אירובי ב 37 ° C עד שהצפיפות האופטית מגיעה לשלב אמצע לוג הגידול.
   הערה: תקנן את עקומת הצמיחה המיקרוביאלית עבור כל מעבדה בעבר. במחקר הנוכחי, תרביות הורשו לדגור במשך כ-8 שעות, עד שהגיעו לשלב אמצע היומן של הצמיחה כפי שמצוין על ידי הצפיפות האופטית ב-540 ננומטר (OD₅₄₀), עם ערך ממוצע של 0.536 ±-0.062 יחידות שרירותיות (ממוצע ± סטיית תקן [SD]).
5. צנטריפוגו את התרבית בטמפרטורה של 5,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה פעמיים באותו נפח של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS; 0.136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7.4).
6. השתמש 100 μL aliquots לביצוע ארבעה דילולים טוריים פי 10 ב- PBS, פיזר דילולים על לוחות SDA, ודגר ב 37 ° C במשך 48 שעות לספירת מושבה. כסטנדרט, מתלים פטרייתיים משמשים בריכוזים של כ 4.5 × 10⁷ יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL)].

3. השראת OC בעכברים

הערה: המתודולוגיה הבאה תוארה בעבר על ידי Takakura et ^al.13 ושוחזרה על ידי הקבוצה שלנו^10,14, עם כמה שינויים.

1. פיזור אקראי של עכברים בתשע קבוצות (n = 5), בהתאם למספר זהה של טיפולים (קובץ משלים 1).
   הערה: חלל הפה של עכברים צריך להיות שלילי לצמיחת קנדידה . זה צריך להיבדק על ידי ספוג חלל הפה ציפוי הדגימה על SDA.
2. שמור את בעלי החיים בקופסאות פרופילן¹⁰ (5 עכברים לכל היותר תיבה), עם שבבי עץ לחיפוי הרצפה, בויבריום מבוקר טמפרטורה ב 23 ± 2 ° C תחת מחזור אור / חושך 12/12 שעות. אין צורך לספק העשרה ספציפית.
3. שמור על עכברים על דיאטת עכברים מושחלת ומים מסוננים ad libitum.
4. הזרקה תת עורית של התרופה לדיכוי מערכת החיסון, פרדניזולון (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ראה טבלת חומרים), לראשונה ביום הראשון לכל חברי הקבוצות C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ ו-C-L- (קובץ משלים 1).
   הערה: שמור עכברים מאותה קבוצה באותה קופסה ועקוב אחריהם מדי יום עבור כל סימן של מתח וירידה במשקל. פנה לייעוץ וטרינרי עבור משכך כאבים או מזון / מים שהשתנו אם מתח או ירידה במשקל הם ציינו.
5. החל מהיום הראשון ועד סוף הניסוי, לספק טטרציקלין הידרוכלוריד במי שתייה ב 0.83 מ"ג / מ"ל¹³.
6. חסן לשונות עכברים ביום השני, כולל קבוצות C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ ו- C-L- (קובץ משלים 1), עם החיסון C. albicans . אין לחסן עכברים מקבוצת הביקורת השלילית (NCtrl).
   1. הרדמת בעלי חיים על ידי הזרקה תוך שרירית של 10 מ"ג / ק"ג כלורפרומזין כלוריד (ראה טבלת חומרים) על כל שריר הירך לפני ביצוע חיסון.
   2. בצע חיסון אינטרה-אוראלי של העכברים על ידי השריית ספוגית סטרילית (אחת לכל חיה) לתרחיף מתוקנן טרי (כלומר, מוכן מיד לפני החיסון) של C. albicans.
   3. הניחו עכברים מורדמים במצב שכיבה. מוציאים בעדינות את לשונם מפיהם באמצעות מלקחיים סטריליים. שפשפו את לשונו של כל עכבר במקלון ספוג במשך 30 שניות. עקוב אחר עכברים עד שהם מתאוששים מהרגעה.
7. ביום החמישי, יש לתת זריקה תת עורית משלימה של פרדניזולון (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) כדי לשמור על הדיכוי החיסוני.
   הערה: פרוטוקול זה מספיק כדי לשמור על הזיהום במשך 7 ימים לאחר חיסון תוך אוראלי. ציר הזמן של הפרוטוקול מוצג באיור 2.

4. טיפול פוטודינמי אנטי מיקרוביאלי והחלמה של C. albicans מנגעים אוראליים

1. ביום השביעי, לפני הטיפול, יש להרדים את בעלי החיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) בשילוב עם קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (ראו טבלת חומרים).
2. הניחו כל בעל חיים במצב שכיבה על מכשיר כרית ^14,15 המצויד בחוטי נירוסטה שניתן לכרוך בלולאה סביב החותכות כדי לשמור על הפה פתוח.
   הערה: רפידות איזותרמיות מומלצות לחימום העכברים בזמן טשטוש, מניעת היפותרמיה בטמפרטורת החדר ומניעת תמותה הקשורה להרדמה¹⁵. כל בעל חיים מורדם צריך להיות מנוטר על ידי היעדר רפלקס נסיגה כאשר בהונות הם צובטים כדי לאשר את עומק ההרדמה. ניתן לתת מנת תחזוקה אחת של קטמין ב-1/3 מהמינון המקורי (ללא קסילזין) במידת הצורך.
3. כאשר הלסת התחתונה והלחיים נסוגות, מניחים בעדינות את הלשון מחוץ לפה.
4. עבור עכברים מקבוצות C+L+, פיפטה 70 μL של PS על גבי הלשון (באחד הריכוזים שנבדקו). יש לשמור על העכברים בסביבה חשוכה למשך 20 דקות כתקופת טרום הקרנה. ודא כי במהלך זמן זה, הלשון של כל בעל חיים נשאר ממוקם בתוך חלל הפה כדי למנוע את photoensitizer (PS) מלהיות בליעה.
5. לאחר תקופת הפוטוסנסיטיזציה, משוך את הלשון מהפה להארה. הניחו את התקן ה-LED על גבי הלשון והאירו ב-37.5 J/cm² (7 דקות עם המכשיר הנוכחי) (איור 3).
6. עבור בעלי חיים מקבוצות C+L, פיפטה 70 μL של PS באחד הריכוזים שנבדקו על גבי הלשון, ולשמור עכברים אלה בחושך במשך 27 דקות.
7. עבור בעלי חיים מקבוצת C-L+ (מטופלים באור ללא פוטונסיטיזציה קודמת), פיפטה 70 μL של תמיסת מלח סטרילית על גבי הלשון. שמור את העכברים בחושך במשך 20 דקות ולאחר מכן להאיר את לשונם ב 37.5 J / cm² (7 דקות עם המכשיר הנוכחי).
8. עבור עכברים מקבוצת C-L- (לא מטופלים עם PS ולא עם אור), פיפטה 70 μL של תמיסת מלח סטרילית על גבי הלשון ולשמור אותם בחושך במשך 27 דקות.
9. לשחזר C. albicans מן הלשון של כל העכברים מיד לאחר הטיפול. ספוג את החלק האחורי של הלשון במשך דקה אחת עם צמר גפן סטרילי.
10. הניחו כל מטוש דגימה בצינור המכיל 1 מ"ל של מלח סטרילי ומערבולת למשך דקה אחת כדי להשעות מחדש את התאים המיקרוביאליים.
11. מיד לבצע דילולים טוריים פי 10 ב PBS צלחת 25 μL aliquots מעל לוחות SDA כפול. לדגור את הצלחות באופן אירובי ב 37 ° C במשך 48 שעות.
12. לאחר 48 שעות, השתמש במונה מושבות דיגיטלי (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את ספירת מושבות השמרים. חשב עומס C. albicans (CFU/mL) עבור כל חיה.
13. הפוך ערכי CFU/mL ליומן₁₀ וננתח כראוי בהתאם לתכנון הניסוי והנחות הנתונים.
    הערה: בחקירה הנוכחית, נעשה שימוש במבחן ANOVA ו-Games-Howell החד-כיווני של וולש (α = 0.05)¹⁶ .

5. ניתוחים היסטופתולוגיים

1. ביום השמיני, מרדימים עכברים עם קטמין במינון של 100 מ"ג/ק"ג בשילוב עם קסילזין במינון של 10 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך פריטוניאלית וממיתים אותם עם מנת יתר של קטמין (200 מ"ג/ק"ג הניתנת באמצעות אינטרפריוטוניאל). אשר את המוות על ידי בדיקת היעדר תנועה נשימתית (דום נשימה), והיעדר פעימות לב (אסיסטולה).
2. בזהירות לצבוט את הלשון ולשלוף אותו מתוך הפה של החיה. באמצעות אזמל ידני, לבצע חתך לפני papillae circumvallate כדי להסיר בניתוח את כל הלשון מבלי לגרום לפציעות באזורים הקדמיים והמרכזיים.
3. מקבעים את הלשון בפורמלין חוצץ 10% (pH 7.2-7.4) למשך 24 שעות ושוטפים אותה במים זורמים למשך שעתיים.
4. המשך עם ההכללה בתהליך הפרפין: התייבשות, הבהרה והספגה^10,14.
5. חתכו מקטעים טוריים (בעובי 5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום, ולאחר מכן הדביקו את המקטעים על שקופיות זכוכית. המשך להכתים חלקים אלה באמצעות חומצה תקופתית Schiff ו hematoxylin (PAS-H) לבדיקה היסטופתולוגית וזיהוי פטריות באמצעות תצפית תחת מיקרוסקופ אור.
6. בקש מפתולוג, רצוי עיוור לקבוצות שנחקרו, לבחון את תגובת הרקמה עקב זיהום C. albicans .
7. תאר את המאפיינים ההיסטולוגיים של הרקמה (אפיתל ורקמת חיבור), במיוחד תגובות דלקתיות מקומיות בעוצמות שונות.

מודל מורין של OC הראה כתמים לבנים טיפוסיים ופסאודוממברנות על הלשון של כל העכברים הנגועים (איור 4A). C. albicans שנמצאו מבעלי חיים C-L אישרו התיישבות רקמות על ידי מיקרואורגניזם זה (הערכים נעו בין 1.62 x 104 ל 4.80 x 105 CFU/mL). כצפוי, חיות מקבוצת NCtr לא הראו שינויים כלשהם ברקמות או צמיחת מושבה לאחר הדגימה (איור 4B).

aPDT הפחית את הכדאיות של C. albicans כאשר כורכומינואידים שימשו ב-80 מיקרומטר לפוטוסנסיטיזציה (איור 5). ההפחתה הממוצעת של log10 שהושגה עם aPDT בתיווך PS של 80 מיקרומטר הייתה 2.47, בהשוואה לזו שבקבוצת C-L- (p = 0.008).

מספר מושבות C. albicans שנמצאו בלשונות עכברים לא היה שונה באופן משמעותי בין עכברים שטופלו בכורכומינואידים ללא הארה (קבוצות C+L), עכברים שטופלו באור אך לא עברו פוטונזיט קודם לכן (קבוצות C-L+), ועכברים לא מטופלים (קבוצת C-L) (p ≥ 0.210).

המאפיינים ההיסטולוגיים של לשונות של חיות לא נגועות (NCtr) הראו רקמות נורמליות/בריאות, כולל למינה פרופריה שלמה, קרום בסיסי ופפילות פיליפורמיות (איור 6A). לעומת זאת, כאשר בחנו את התמונות ההיסטופתולוגיות של לשונות העכברים מקבוצת C-L, ניכר כי שמרים וחוטים היו נוכחים בתוך שכבת הקרטין של האפיתל, אם כי לא הייתה חדירה של פטריות. ברקמת החיבור הבסיסית נצפתה תגובה דלקתית קלה, בעיקר בתיווך תאים חד-גרעיניים, ופפילות פיליפורמיות נעדרו באופן בולט (איור 6B). הניתוח ההיסטולוגי של לשונות עכברים בשתי קבוצות C+L- ו- C-L+ הראה מאפיינים דומים. לעומת זאת, חלקי הלשון של עכברים שטופלו ב-aPDT בתיווך כורכומינואיד של 80 מיקרומטר חשפו מספר מופחת של תאים פטרייתיים, המוגבלים בעיקר לשכבת הקרטין של האפיתל (איור 6C).

איור 1: המבנה הכימי של הפוטונסיטייזר. המבנה הכימי של תערובת המלחים המסיסה במים המשמשת כפוטונסיטייזר, כולל 53.4% כורכומין טבעי ו-46.6% כורכומינואידים אחרים (דמתוקסיכורכומין וביס-דמתוקסיכורכומין). המשקל המולקולרי הממוצע הסופי הוא 730.32 גרם/מול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציר הזמן של פרוטוקול עבור מודל מורין של קנדידה אוראלית ו-aPDT. ציר זמן המתאר את הפרוטוקול עבור מודל מורין של קנדידה אוראלית וטיפול פוטודינמי מיקרוביאלי (aPDT). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הארה של לשונות עכברים לאחר פוטוסנסיטיזציה. לאחר פוטוסנסיטיזציה, (הדגירה של הרקמה הנגועה עם הפוטונסיטייזר), הלשונות הוארו ב 37.5 J / cm2 באמצעות אור LED כחול (~ 455 ננומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נגעים לבנים במודל קנדידיזיס אוראלי מוריני. (A) תמונות מייצגות המתארות את הנגעים הלבנים שנצפו במודל מורין של קנדידה אוראלית. (B) בקרה שלילית (לא נגועה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: קנדידה אלביקנס התאוששה מלשונות של עכברים. הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן של log10 (CFU/mL) מקבוצות הטיפול. ANOVA חד-כיווני של וולש הצביע על כך שהשפעות הטיפולים היו שונות באופן מובהק סטטיסטית בין הקבוצות (p < 0.001). אותיות קטנות שונות (a, b, c) ליד האמצעים מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית על פי מבחן גיימס-האוול (עמ≤ 0.030). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונות מייצגות של מקטעים היסטולוגיים של לשונות עכברים. חלקים היסטולוגיים של לשונות עכברים הוכתמו ב-PAS-H, והתמונות צולמו ברזולוציה של 200x. (A) עכברי ביקורת שליליים ללא קנדידה אוראלית מושרית, פוטוסנסיטיזציה והארה (קבוצת NCtr). (B) עכברים עם קנדידה מושרית דרך הפה, לא עברו פוטונזיט ולא נחשפו לתאורת LED (קבוצת C-L). (C) בעלי חיים עם קנדידה אוראלית מושרית, שנחשפו לכורכומינואידים של 80 מיקרומטר ולתאורת LEDשל 37.5 J/cm 2 (קבוצת C+L+ 80). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קבוצות ניסוי. רשימה של קבוצות הניסוי ששימשו במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.