מאמר שיטה

אופטימיזציה של מודל העכבר לפריודונטיטיס שנגרם על ידי ליגטורה למחקר פרה-קליני

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל העכבר לדלקת פריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות הוא כלי יעיל ופופולרי יותר ויותר לחקר מחלות חניכיים. מוצגות הנחיות מפורטות ליישום גרסה מפושטת של המודל המתמקדת בהרס עצם אלוואולרי בין-פרוקסימלי, כולל תכנון מחקר במעבדה, ייצור כלים מודפסים בתלת-ממד וכימות עצם באמצעות ניתוח מיקרו-CT.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המודל הניסיוני של פריודונטיטיס הנגרמת על ידי קשירה בעכברים שיחק תפקיד יסודי בהבנת פתוגנזה של מחלות חניכיים; עם זאת, הוא לא נוצל במלואו ליישומים תרגומיים וטיפוליים. בדומה למחלות בבני אדם, פריודונטיטיס הנגרמת על ידי קשירות בעכברים מתפתחת באמצעות סדרה של אירועים מיקרוביאליים, דלקתיים ואוסטאו-אימונולוגיים מובחנים. הרס העצם האלוואולרי שנגרם על ידי קשירות מתקדם בפרק זמן קצר יחסית וניתן למדידה בקלות, מה שהופך אותו למודל מחלה חסכוני למחקרים פרה-קליניים.

כדי להתגבר על האתגר הטכני של מודל הליגטורה הקלאסי, נערך התכנון של מודל עכבר פרויודונטיטיס המושר על ידי ליגטורה. במקום לגרום למחלה בכל היקף שתי השיניים הסמוכות, מודל המחלה הפשוט מתמקד בהרס דלקתי של עצם רק באזור הבין-פרוקסימלי של שתי שיניים אחוריות, שהוא גם האזור שבו מתחילה מחלת חניכיים נפוצה בבני אדם. מכיוון שהוא משתמש בכלים מודפסים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) למיקום קשירה, הגישה מהירה ויעילה ומובילה לזמן פרוצדורלי של 5-10 דקות לעכבר. בעוד שאיתות אוסטאוקלסטוגני מתגלה לאחר 3 ימים של הנחת קשירה, הרס עצם מתפתח באופן עקבי לאחר 9 ימים לאחר הקשירה.

כאן, פרוטוקול מודל הליגטורה המפושט מפותח על ידי הדגשת אלמנטים חשובים ספציפיים לעיצוב המחקר (כגון חישוב כוח, תקנון פרוצדורות, כיול), פיתוח כלי ההדפסה התלת-ממדיים (כגון "מיטת השיניים של העכבר" ו"מחזיק הליגטורה"), וכימות עצם אלוואולרי באמצעות ניתוח μCT. ביטוי גנים חניכיים של Rank, Rankl ו-Opg, טריאדה רגולטורית ראשית של אוסטאוקלסטוגנזה, משמש כהוכחה עקיפה ליעילות טיפולית. השיטות המוצגות במאמר זה ינחו את יישום החוקרים של מודל פריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות לבדיקה של טיפולים חדשניים לפריודונטלי בסביבה פרה-קלינית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת חניכיים היא תהליך דלקתי מורכב שמוביל להרס מבנים תומכי שיניים, כולל החניכיים, הרצועה החניכית, הצמנטום והעצם האלוואולרית. כדי להתפתח אובדן עצם חניכיים, יש צורך לשבירת מחסום החניכיים ולפלישה חיידקית, בנוסף לגיוס תאים דלקתיים ולמעבר מתגובה חיסונית דומיננטית מולדת לתגובה חיסונית דומיננטית נרכשת1. חוסר האיזון הסופי בין אוסטאובלסטים לאוסטאוקלסטים יגרום לאובדן עצם אלוואולרי דרך הרס2. הממצא הפנוטיפי הבולט שמבדיל בין אבחון מחלת חניכיים לדלקת חניכיים הפיכה (דלקת חניכיים) הוא אובדן עצם אלוואולרי. לכן, כמות עצם הנאדית התומכת בשן היא תוצאה טיפולית מרכזית במסגרת הפרה-קלינית.

אין מודל בעל חיים בודד שיכול לשחזר את כל ההיבטים הביולוגיים הנדרשים לפיתוח טיפולים שונים 3,4,5. מודל העכבר לפריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות מפתח הרס עצם שניתן לכמותי בזמן קצר יחסית (3-9 ימים)5, מה שהופך אותו למודל חסכוני לבדיקת התערבויות טיפוליות חדשות למניעת פריודונטיטיס ומווסת. למרות הצלחתו בתמיכה בפיתוח ניסויים קליניים בבני אדם שלב II-III 6,7,8,9,10, פריודונטיטיס הנגרמת על ידי קשירות בעכברים אינה בשימוש נפוץ כמודל פרה-קליני. כדי להתגבר על האתגרים הטכניים של המודל הקלאסי שבו הליגטורה מקיפה את השן, הוקם דגם11,12 של עכבר פריודונטיטיס המושרה על ידי קשירה פשוטה. השינוי הפשוט של המודל הקלאסי מתמקד באתר הרס עצם ממוקד, בין השיניים ולא סביבן. היתרונות של שינוי זה הם רבים, כולל משך זמן קצר יותר הנדרש ל-1) הכשרת צוות, 2) קלות טכנית בהליך הניסוי, ו-3) שחזוריות של כימות העצם. בנוסף, התגלה כי מספר אירועים מיקרוביולוגיים ואימונולוגיים המתפתחים ומתבטאים תחת מודל מפושט זה תואמים את ההבנה הנוכחית של מחלת החניכיים הנפוצהבבני אדם 2,11,12,13. לבסוף, המניעה היעילה של אובדן עצם שנגרמה על ידי תרופות, כפי שדווח בעבר על ידי US 2,14, תומכת עוד יותר בשימוש במודל הפריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות ככלי ב-in vivo להערכת היבטים מרכזיים של טיפולים חניכיים חדשים.

היבט חדשני במודל הפשוטה של פריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות הוא פיתוח כלים מודפסים בתלת-ממד להקל על תהליך ההשראה של המחלה11,12. למרות שזה אינטואיטיבי עבור חלק מהאנשים, החוקרים דיווחו על חוסר יכולת להרכיב את הכלים המודפסים בתלת-ממד15, מה שעלול לעכב או לעכב עוד יותר את תחילת המחקר על בעלי חיים. המחקר הנוכחי מרחיב את המידע שהוצג במחקר הפרוטוקול הקודםשלנו 11ומספק מידע מפורט לאפשר יישום מוצלח של מודל פריודונטיטיס המושרה על ידי קשירות במסגרת מעבדה. הפרטים הכלולים בפרוטוקול הנוכחי הם חלק ממערך מורכב של גורמים שעשויים לתרום לחוסר שחזוריות התוצאות של ממצאים מדעיים 15,16,17. השימוש העקבי במודל והספיגת עצם אמינה שזוהו במחקרים המרובים 2,11,12,14,18 ובקבוצות מחקר שיתופיות 13,19,20,21 בעשור האחרון תומכים בחשיבות הפצת מידע מפורט לקידום שחזוריות בקהילה המדעית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עמד בהנחיות ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)22,23. כל ההליכים הניסיוניים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. עיצוב ניסויי

  1. חישוב גודל המדגם
    הערה: בשל אופיו התרגומי של תוכנית המחקר, חישוב ההספק המוצג כאן מבוסס על מדידות עצם אלוואולריות של עכברים מסוג פראי C57Bl6 בני 8-12 שבועות.
    1. לנתח עצם בהתבסס על המדידות הליניאריות בין צומת הצמנטום-אמייל לבין רכס העצם האלוואולרי (CEJ-ABC).
      1. לעכברים בריאים יש רמת התקשרות ממוצעת (או מדידת CEJ-ABC) של 0.2 מ"מ, בעוד שעכברים עם פריודונטיטיס בנקודת הזמן של 9 ימים לאחר הקשירה, יש להם כמות כפולה (מרחק CEJ-ABC של 0.4 מ"מ)11. אובדן העצם האלוואולרי אינו עולה משמעותית בין 9 ל-18 ימים לאחר הנחת הקשירה11.
      2. בצע ניתוח חישוב עוצמה המבוסס על גודל האפקט כדי לזהות את מספר העכברים הנדרש לחשוף את ההבדלים בין בריאות למחלה (כאן, סך הכל 8-10 עכברים [איור 1A]).
        הערה: ההספק חושב כך שיגיע להספק בין 0.8 ל-0.95, α = 0.05, תוך שימוש בממוצע הספק דו-דגימה. ממוצעים קבוצתיים וסטיות תקן מוצגים באיור 1B.
    2. כדי לקבוע השפעה טיפולית על אובדן עצם, בצע חישוב כוח שונה. במקום להשוות עכברים בריאים לעכברים חולים, שכן קבוצות ניסוי וקבוצת ביקורת מפתחות פריודונטיטיס בפרוטוקול זה, יש להקדיש בין 19 ל-31 עכברים לקבוצה כדי להבטיח שחזוריות התוצאה בעת בדיקת מודולציה של אובדן עצם באמצעות מודל עכברי פריודונטיטיס מפושט (ראו תוצאות מייצגות ואיור 1C).
      הערה: ההספק חושב באמצעות אותו מבחן שתואר לעיל. ממוצעים קבוצתיים וסטיות תקן מוצגים באיור 1D.
  2. תקנון פרוצדורות וכיול כוח אדם
    1. להכשיר ולכיול את כל הצוות המעורב בהשראה וכימות מחלה לפני תחילת המחקר (אינטרקליברציה ואינטראינטלברציה; r2 ≥ 0.90).
      הערה: ההערכה היא שההכשרה להנחת קשירה וכימות אובדן העצם דורשת תקופה של 2-3 חודשים (ציר הזמן המוצג בטבלה 1). שלבים נדרשים נוספים מוצגים כציר זמן בטבלה 1.
    2. לפרוצדורת הנחת הקשור, יש שני חוקרים מיומנים שעובדים יחד בחדר הפרוצדורות. החוקר הראשי (תוך-מכויל ובין-מכויל) נשאר כמפעיל שממקם את הליגטורות.
    3. תן לחוקר השני לעבוד כעוזר פרוצדורלי ולבצע את השלבים המפורטים להלן:
      1. הקלט את משקל העכבר.
      2. שים את העכבר בקופסת ההרדמה.
      3. מרחים משחת עיניים על העכבר לפני שמוסרים את העכבר למפעיל להנחתו ב"מיטת השיניים של העכבר".
      4. ודאו ש-≥3 "מחזיקי קשירה" טעונים כראוי עם הקישורים ומוכנים לשימוש.
        הערה: כדי לשפר את היעילות, אידיאלי שיהיו ≥3 "מחזיקי קשירה" טעונים כראוי לשימוש המפעיל. מומלץ לשמור על מהירות (כלומר, זמן פרוצדורה של 5-10 דקות לעכבר), להגדיל את מספר הניסויים ביום ולהפחית את ההשפעות הפוטנציאליות של האצווה.
      5. בצע ניטור עכבר (לפני ואחרי ההליך).
        הערה: פריודונטיטיס הנגרמת על ידי קשירה היא הליך לא פולשני ולא כירורגי, הדומה לניקוי חוט דנטלי לשן אנושית. הצבת קשירה צפויה לגרום לאי נוחות קלה מאוד לעכברים (בעיקר עקב הצטברות חיידקים בין שתי שיניים), אך לא צריכה לדרוש שימוש במשככי כאבים. לא צפויים סיבוכים לאחר הנחת הקשורה על ידי אדם מיומן. כל בעלי החיים מנוטרים כל 2-3 ימים לאחר הצבת הקשירה. נקודות סיום הומניות (למשל כישלון בטיפוח או האכילה, חוסר יכולת לקום או ללכת, נשימה כבדה, פצעים נמקיים או מזוהמים) צריכים להיות מופיעים בפרוטוקול בעלי החיים המאושר, אך אם מתרחשים סיבוכים, יש להתייעץ עם צוות הווטרינר בנוגע לפעולות המתאימות.

2. יצירת כלים מודפסים להשראת פריודונטיטיס קשירה בעכברים

הערה: כדי למקסם את מיקום הליגטורה, פותחו כלים מודפסים בתלת-ממד בשם Mouse Dental Bed ו-Ligature Holder, המורכבים ממספר חלקים מודפסים תלת-ממדיים נפרדים שמודבקים בנפרד ומורכבים ידנית. מפרטי התכנית למכשירים אלו פורסמו בעברב-11 וניתן להשתמש בהם על ידי חוקרים מנוסים ליצירת קבצי STL בודדים. המכשירים החדשים במחקר הנוכחי נוצרו בשיתוף עם מרכז העיצוב BeAM של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. ניתן להשיג חומרים דרך המתקן המרכזי הרלוונטי או להדפיס בתלת-ממד באמצעות קבצי STL בקובץ המשלים 1.

  1. מיטת שיניים עכברים
    1. הדפסו את מיטת השיניים של העכבר (איור 2A) ואת מחזיק הליגטורה (איור 2B) באיכות הדפסה סטנדרטית על מדפסת תלת-ממד עם חוט חומצה פולילקטית (PLA) בקוטר 3.0 מ"מ. הדפיסו את מיטת השיניים בכיוון המתוכנן ואת החלקים האחרים עם משטחים שטוחים אחידים הממונים כלפי מטה כנגד מיטת ההדפסה. הפעל את אפשרות חומר התמיכה על ידי הפעלת הגדרת מיקום התמיכה. ודא שחומר התמיכה נוגע בלוח הבניין תחילה על ידי בחירת אפשרות 'מגע עם לוח הבנייה'.
      הערה: השתמש בחמשת קבצי STL בתיק המשלים 1 כדי להדפיס את כל האלמנטים הנדרשים, כולל צינור מנותק, קשורה (עם חריץ), מיטת השיניים של עכבר (עם חריצים), מכסה ומנעול מחזיק קשיר. ראו את טבלת החומרים לממדי כל פריט (מפרטי התכנית הוצגוקודם 10).
    2. לאחר סיום ההדפסה, גזמו כל חלקי חומר תומך מודפס מהדגמים באמצעות חותכי חוט, פלייר מחט או כלי אחר.
      הערה: הלבשו משקפי מגן במהלך ההליך הזה.
  2. הרכבת מיטת שיניים לעכברים
    1. להכנת מיטת השיניים של העכבר, פרש את כל החלקים כפי שמוצג (איור 3A) והכן את הדבק לשימוש (איור 3B).
    2. הנח כמה טיפות דבק (איור 3C) וחבר את הברגים כפי שמוצג (איור 3D). שוב, התכוננו להעברת דבק (איור 3E) לאזורים שבהם הוא יונח. החלק את חריץ הצינור המודפס (איור 3F) כאשר הקצה המחודד פונה הרחק ממיטת השיניים של עכבר (כאן יתחבר הצינור להעברת איזופלורן).
    3. אבטח חלקי ייצוב ראש במקומות עם דבק (איור 3F).
    4. נגב כל דבק עודף ושמור לחץ קל על כל החלקים המוכנסים לחיבור יציב (איור 3F).
  3. התאמות למחזיק הליגטורה
    1. כדי להפחית אי נוחות בעת נעילה/פתיחת המנגנון, ודא שכל הקצוות המרובעים/החדים בחלק החיצוני של מנעול מחזיק הליגטורה (איור 4A) משופעים מעט בזווית של 45° באמצעות ידית להב סכין 15C, מספר 3 עם להב 15C.
    2. כדי להבטיח התאמה הדוקה של מנגנון הנעילה למחזיק הליגטורה, יישר כל פינה פנימית מעוגלת במנעול מחזיק הליגטורה (איור 4B-F) באמצעות להב סכין 15C.
      הערה: זה יאפשר למנעול להתמקם במלואו כנגד מחזיק הליגטורה וידרוש רק התאמות קלות.
      1. השתמשו בכלי חיתוך להדפסת תלת-ממד או להב סכין 15C כדי להסיר את ה"פלאש" שנותר בקצוות העליונים והתחתונים גם לאחר הסרת רוב התמיכה, והטבו מעט את הקצוות בזווית של 45° (בדומה לזווית שבוצעה במנעול מחזיק הליגטורה בשלב 1) כדי להבטיח נעילה צמודה.
        הערה: אל תסיר יותר מדי חומר, אלא מספיק כדי שהמנעול יחליק ללא התנגדות.
    3. אם הוא דק מדי, גזם את אורך כל קצה עד שמגיעים לחתך עבה יותר [לפחות 0.5 מ"מ בעובי], כדי להבטיח שיש מספיק מרווח בין הקצוות כדי למנוע פגיעה בחיך בעת הנחת ליגטורות. ודא שהקצוות באורך של לפחות 3 מ"מ לאחר החיתוך (איור 5A, מוצג על ידי "CUT").
    4. בקצות מחזיק הליגטורה, יש להסיר כל פלאש מה"תמיכה" שעליה הודפס הכלי כדי לוודא שצידי הקצוות שטוחים (איור 5B, חץ).
    5. יש להוציא "חתך" מהצד של כל קצה בזווית של 45° כדי להקל על העמסת הליגטורה עליה וגם לרכך את הקצוות כדי למנוע פגיעה טראומטית ברקמות הרכות (איור 5C, מסומן בחצים).
    6. ודאו שכל קצה במחזיק הליגטורה כולל חריץ בצורת "V" שבו ניתן לנוח את קשתות המשי לתפר. אם זה הוסר בשלב 2.3.6 כי הקצה המודפס הראשוני היה דק מדי, לחדד אותו בהדפסה או לשחזר אותו.
      1. אם חריץ בצורת "V" נראה לעין, מניחים את מחזיק הליגטורה על משטח שטוח עם שני הקצוות במקביל למשטח השולחן, הנחו להב סכין 15C בעדינות בבסיס החריץ, ונענעו בעדינות את הלהב מצד לצד כך שקצה הלהב יישאר בבסיס ה-"V" והצדו נוגע בקירות העליונות של ה"V". עם הלהב בבסיס החריץ, זווית את הלהב בזהירות רבה לעבר פני השטח החיצוניים של הקצה וחזרו על התנועה כדי לחדד את בסיס החריץ בצורת "V" בקצה החיצוני, מה שיאפשר לחוט התפר להכווין ביתר קלות למקומו.
        הערה: תנועת הנדנוד יוצרת בדיוק מספיק תנועה בחוט כדי להזיז אותו הצידה ולחדד את החריץ מבלי להסיר כמות מופרזת של חומר.
      2. אם החריץ בצורת "V" אינו נראה, הנח את מחזיק הליגטורה על משטח שטוח עם שני הקצוות בניצב לשולחן. בעת מבט ישר לאורך שני קצות מחזיק הליגטורה, הנח להב סכין 15C במרכז הקצוות, ובתנועה מכוונת אחת, בצע חתך רדוד כדי ליצור את תחילת מה שיהפוך לחריץ בצורת "V".
        הערה: לעיתים קרובות קל יותר לבצע פעולה זו על כל קצה בנפרד מאשר לנסות למקם את הלהב במקום הנכון בשני הקצוות בו זמנית.
      3. חזור על שלב 2.3.7.2 במידת הצורך, וודא שקצה להב הסכין תמיד חוזר לאותו נקודה במרכז הקצה.
        הערה: אם הקצה של הלהב לא חוזר לאותו מקום, יבוצעו חיתוכים מרובים, מה שיגרום לשכבות החוט להתחיל להיפרד באזורים אלה ועלול להפחית את ביצועי הכלי.
        הערה: עומק החריץ בצורת "V" חייב להיבדק מעת לעת באמצעות רצועת משי קשורה לתפר כדי לקבוע אם הליגטורה מחזיקה או שהיא ממשיכה להחליק (מה שעשוי להצביע על צורך בשיפור נוסף). יש להדפיס את המחזיק כאשר החריץ פונה כלפי מטה על לוח הבנייה, ומנעול מחזיק הליגטורה מכוון כך שהפתח הרחב יותר כלפי מטה נוגע בלוח הבנייה. שוב, ניתן להשתמש בחומר תמיכה כאשר מיקום התמיכה מוגדר ל-Touching Builderplate בלבד.
  4. מחזיק הליגטורה מורכב
    הערה: לאחר ביצוע השינויים, הרכיבו את מחזיק הליגטורה, ובדקו את הדברים הבאים:
    1. כאשר קשורה ננעלה במקומה, ודא שהמנעול לוחץ את החוט אל מחזיק הליגטורה (שאינו נראה באיור 6A כמכוון על ידי החץ, אך נראה באיור 6B) בחלק העליון או התחתון של המנעול (שניהם, אם אפשר, אך זה עשוי להיות קשה להשגה).
      הערה: חיכוך זה יבטיח שהליגטורה לא תחליק ממקומה.
    2. כאשר משחילים את הליגטורה אל החריצים של מחזיק הליגטורה, אם הוא ממשיך להחליק מהקצות, יש להעמיק את החריצים או להרחיב אותם עוד יותר אל החלק החיצוני של הקצה כדי ליצור "מסלול" שבו החוט יושב.
    3. בדוק אם שני הקשרים ממורכזים (איור 6C) ושטוחים (קו ישר באיור 6D) כאשר מסתכלים עליו מהחזית של מחזיק הליגטורה; אם לא, אז חריץ אחד עמוק יותר מהשני.
    4. בדוק שהליגטורה יושבת בדיוק בתוך החריצים ושהיא לא יושבת עמוק מדי; אחרת, קיים סיכון מוגבר שקצה מחזיק הליגטורה ייגע ברקמות הרכות ויגרום לטראומה במהלך הנחת הקשירה.
    5. באמצעות חוקר שיניים (איור 6E), וודא שהליגטורה חוזרת למקומה מבלי להחליק כאשר מופעל כוח עדין בין הקשרים (זה מדמה את הכוח שיחווה במהלך הנחת הקשיר).

3. מיקום קשורה

הערה: ניתן למקם את הקשורים בין שיני העכברים עם או בלי הוספת פתוגנים חניכיים אנושיים11. ניתוח תלוי זמן של הרכב המיקרוביאלי של הליגטורה (ללא תוספת עם מיני חיידקים אנושיים) הראה שינוי בקהילת המיקרוביום (דיסביוזיס) במהלך התפתחות פריודונטיטיס12. מסיבה זו, החלפת קשירה אינה מומלצת שכן היא עלולה לשנות את השחזור של התוצאה. הכללת מיני חיידקים בשילוב עם הליגטורה תלויה בשאלה הנדונה במחקר ספציפי. בגלל אובדן הקשירה הצפוי של 10-15%11, הקליטטורות מונחות דו-צדדית בעכבר אחד. גישה זו מצמצמת את אובדן העכברים במהלך הניסוי.

  1. לאחר שהעכבר הורדם באמצעות איזופלורן שנשאף, הניחו את העכבר המורדם במיטת השיניים של העכבר, גבו צמוד למיטה והאף ממוקם בקרבת חרוט האף.
    הערה: יש להרדים עכברים באמצעות איזופלורן 4% (נפח/נפח). מאיידי איזופלוראן וחמצן מסוננים על ידי מסנן אוויר בקוטר 0.2 מיקרון. לאחר שהעכבר מורדם לחלוטין ומונח במיטת השיניים של העכבר, יש לשמור על זרימה של 1.5-2.5% דרך חרוט האף. העכברים מנוטרים על ידי תנועות גוף בלתי רצוניות וקצב נשימה (~55-65 נשימות בדקה). אין צורך במתן משכך כאבים לעכברים שנגרמו עם פריודונטיטיס קשור, שכן מדובר בהליך לא פולשני ולא כירורגי הדומה לחוט דנטלי של שן אדם. הצבת קשירה צפויה לגרום לאי נוחות קלה מאוד לעכברים (בעיקר עקב הצטברות חיידקים בין שתי שיניים), אך לא אמורה לדרוש שימוש במשכי כאבים. לא צפויים סיבוכים לאחר הנחת הקשורה על ידי אדם מיומן.
  2. השתמש בגומיות כדי לייצב את ראש העכבר ולפתוח את פיו.
    הערה: הרצועה סביב החותכות המנדיבולריות גם מושכת את הלשון לאחור, והמתח הוא פסיבי לפתיחת הלסת מבלי למשוך אותה. הדמיית הטוחנות הופכת לקלה יותר כאשר מקור האור מופנה בזווית כדי למנוע מצללים להסתיר את שדה הראייה. מיטת השיניים לעכברים תוכננה במיוחד למודל העכברים הפשוטים של דלקת פריודונטיטיס המושרה על ידי ליגטורה. המרחק בין אף העכבר לקונוס נדרש כדי לאפשר לעכבר לבצע תנועות קטנות בגוף במהלך ההליך הניסוי. תנועה זו של העכבר מאפשרת ניטור מתאים של תמרון היד של המפעיל תוך שימוש במחזיק הליגטורה ושולטת בכוח המופעל במהלך הנחת הליגטורה. הנחת הקשורה אמורה לקחת 5-10 דקות לכל עכבר. יש לבצע את ההליכים במכסה מאוורר היטב לביצוע ניסויים בבעלי חיים
  3. כדי להניח קשורה בצד ימין, החזק את מחזיק הליגטורה ביד ימין ואת החוקר ביד שמאל.
    הערה: אם הקשרים על הקשורה אינם ממוקמים במרכז הקצוות אלא קרובים יותר לקצה אחד, ייתכן שהקשורה מתאימה יותר למיקום בצד מסוים. לדוגמה, אם הקשרים ממוקמים קרוב יותר לקצה הימני של מחזיק הליגטורה, ייתכן שהקשר הזה יהיה קל יותר להניח בצד ימין.
  4. הניחו בעדינות את קצה החוקר מתחת למגע הבין-פרוקסימלי של הטוחנות הראשונה והשנייה בצד החך.
    1. תנו לקצה החוקר לגעת תחילה בשיניים ואז להחליק למטה ולנוח על החניכיים כדי למנוע טראומה לרקמות הרכות; הנח את ידית החקר בזווית אופקית לאחר מיקום נכון.
    2. שים לב איזה קצה של החוקר משמש למיקום בצד ימין ואיזה בצד שמאל. ודא שקצה החוקר מתחבר לאזור המגע הקרוב בכיוון כלפי מעלה, תוך מתן אפשרות לכיפוף השוק לשכב על הצד הנגדי כדי לייצב את הראש מפני כוחות תגובה במהלך ההנחה.
  5. באמצעות מחזיק הליגטורה בזווית אופקית, משוך את הלחי לאחור על ידי מיקום מחזיק הליגטורה מעל המגע הבין-קרובי בין הטוחנות השנייה לשלישית, דחיפת קצה מחזיק הליגטורה אל הלחי כדי להזיז אותה, ואז הבאת מחזיק הליגטורה למקומו במגע הבין-פרוקסימלי של הטוחנת הראשונה והשנייה.
    הערה: שלב זה מסייע להבטיח שאף ריר בוקלי לא ייתקע בין הקשורה לשיניים, מה שיפריע למיקום.
  6. לאחר שהקשורה ממוקמת מעל המגע הבין-פרוקסימלי בין הטוחנת הראשונה לשנייה, סובבים את ידית מחזיק הליגטורה עד 45°, ובשילוב של נדנוד עדין והחלקה, דוחפים את הקשורה דרך המגע.
  7. חיתוך החוט העודף:
    1. השתמשו במלקחיים דקים כדי לאחוז את החוט העודף שמחובר לקשר בצד ימין, משכו את החוט על פני השיניים לכיוון שמאל, ובאמצעות מספריים שפתוחים מעט, החלקו את המספריים לאורך החוט עד שהן ממוקמות ~1.5 מ"מ מהקשר לפני החיתוך.
      הערה: זה מסייע להפחית את הסיכוי לטראומה לא מכוונת ברירית בעת חיתוך העודף.
    2. חזור על זה למעלה עם ההוראות הפוכות בקשר השני.
  8. משקף את הצעדים למעלה מ-3.3. ל-3.7.2. כאשר מניחים קשורה בצד הנגדי של הפה.
    הערה: איסוף קשורה בהקרבה מומלץ, שכן ההזזה הדיסביוטית עשויה להשתנות על ידי תנאים ניסיוניים שונים הנבדקים12. כדי להקל על האיסוף, עכברים מונחים במיטת השיניים של מורין ואחד הקשרים נחתך ואחריו הסרה עדינה בין-פרוקסימלית עם מלקחיים. השימוש במיטת השיניים לעכבר במהלך איסוף הליגטורות מאפשר יציבות מתאימה של העכבר וגישה נוחה לאתר הקליטה.

4. כימות הרס עצם

  1. ניתוח מיקרו-CT
    1. פתח את התוכנה ולחץ על קובץ | ייבא תמונה...
    2. לחץ על דפדף בתפריט הקופץ, גש לתיקייה המכילה קבצי Dicom לסריקה אחת, ובחר את הקובץ הראשון.
    3. לחץ על Examine כדי למצוא ולבחור קבצים נוספים בתיקייה שהם חלק מאותה דגימה סרוקה. לחץ אוקיי.
    4. לאחר שהתמונה מתחילה להיטען, לחץ על Visualize ו-Isosurface.
    5. שנו את סף התמונה ל-5,000 ואת מקדם איכות הפנים (%) ל-55.
    6. תיבות סימון מסומנות 'הפעלת החלקת תמונה ו-Clip Surface' עם החזר השקעה נוכחי ולחץ על 'עדכון'.
    7. כוונן מאפייני רמה על ידי לחיצה ימנית על חלון/רמה בתחתית (איור 7A) ולחיצה על עריכת חלון/תכונות רמה. בחר ערך צפיפות עצם שהוא סטנדרטי לכל הדגימות. כדי לעקוב אחרי הפרוטוקול הזה, השתמשו ב-2,000 אך שנו לפי צפיפות העצם של הדגימות ושמרו עליה קבועה בכל המדידות.
    8. למניפולציה של מישורים:
      1. השתמש בקיצורי מקלדת I /J/K להסתיר/הצג עבור שלושת המטוסים השונים.
      2. לחץ קליק ימני והזיז את הסמן כדי להגדיל ולהרחיק.
      3. לחץ על Shift ואז קליק שמאלי לפנ.
      4. לחץ על Slice כדי לזוז ולסובב את המישורים.
      5. לחץ על מרכז המישור כדי להזיז את המישור קדימה/אחורה או הנח את הסמן במרכז המישור הרצוי והשתמש במקשי החצים למעלה ולמטה כדי להזיז את המישור פרוסה אחר פרוסה.
      6. לחצו על קצה המישור כדי להסתובב סביב קו המקביל לקצה זה במרכז המישור.
      7. לחצו על פינת מטוס כדי להסתובב סביבו.
    9. כוון את ציר ה-z (לוח כחול בראש המסך - חתיכת ה-z) כך שהמשטחים/הצורות של שלוש השיניים יהיו גלויים בו זמנית (או קרוב ככל האפשר) (איור 7B).
    10. גלול באותו מישור (לוח כחול בראש פרוסת המסך-z) כך ששורשיהטוחנים הראשוניםוהשניים יהיו גלויים (איור 7C). נסה לבחור נקודה שנמצאת מספיק עמוק בשורשים כדי שכל האנטומיה מסביב תיראה, וגם שבה התעלות נראות מוגדרות היטב ובקו ישר.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לסובב את המישור כדי לכוון אנכית את התעלות.
    11. כוון את ציר ה-x (הקו הירוק האנכי בפאנל ה-z) כך שיתיישר עם שורשיהבוקול של הטוחנתהראשונה והשנייה (נסה ליישר דרך החלק המרכזי של כל שורש/תעלה אם אפשר; אחרת, יישר דרך שורש הבוקאלי של הטוחנתהראשונה והשורש הדיסטובוקלישל הטוחנת השנייה) (איור 7D).
    12. השתמשו בכיוון של פרוסת ה-x כהתייחסות ליישור פרוסת ה-y (קו כחול אנכי בפאנל פרוסת ה-x).
      1. יישר את פרוסת ה-y כך שתהיה מקבילה אנכית דרך שורש הטוחנת הראשונה בפאנל ה-x-slice (איור 7E). סובב את המישור כדי לכוון את השורש אנכית. שימו לב שהקו הכחול חוצה את מרכז השורש.
        הערה: באזורים של אובדן עצם (כפי שמצופה במודל זה), ייתכן שלקצה האלוואולרי יש פגם; לכן, יש להעריך את קו האמצע של השורש מכיוון שהעצם הסובבת עשויה שלא להיות קיימת כדי להגדיר באופן אידיאלי את מרכז השקע.
    13. בפאנל ה-y-slice מודדים את המרחק מהצומת הצמנטואנמיל (CEJ) לראש העצם האלוואולרי (ABC) על ידי הנחת הסמן בנקודה העמוקה ביותר של החריץ ב-CEJ ולחיצה על 1, ואז על ידי הנחת הסמן בנקודה הקרובה ביותר ל-ABC ולחיצה על 2 כפי שמוצג (איור 7F). הנקודה הראשונה מסומנת בחץ כחול והנקודה השנייה בחץ ירוק.
      1. אם החצים לא מופיעים עד ששתי הנקודות נבחרות, בחר אותם על ידי ריחוף עם החץ מעל האזורים הרצויים ולחץ על מקשי המספר במקלדת, כי לחיצה על העכבר בלבד לא תעבוד.
      2. אם קשה לקבוע את ה-CEJ, השתמש במקשי החצים למעלה ולמטה כדי לגלול בין הפרוסות הסמוכות ולאשר את מיקומו.
      3. מדוד נקודות מרובות של ה-ABC אם קשה לקבוע את ה"נקודה הקרובה ביותר" כדי לאשר שיש מעט מאוד או אין שינוי במדידה.
        הערה: כדי לוודא שהמדידה הנכונה נלקחה, יש לראות את פרוסות x ו-z מצטלבות מעל השורש הרצוי וניתן לאשר את המדידה במבט התלת-ממדי על ידי הסתרת המישורים (איור 7F).
  2. כימות ביטוי חניכיים של Rankl/Opg ו-Rankl/Rank
    1. איסוף רקמת חניכיים כפי שתואר קודם9.
      הערה: תוצאות הפקת RNA הטובות ביותר מתקבלות באמצעות דגימות רקמה טריות, ויש לעבד את טיהור ה-RNA בהקדם האפשרי.
    2. חילוץ RNA של רקמת החניכיים על ידי הכבת חרוזים באמצעות ערכת התייחסות וחרוזי קרמיקה. עקבו אחרי ההוראות בערכה ואחסנו את הדגימה בטמפרטורה של -80 °C עד לניתוח על ידי qRT-PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aניתוח נתונים מייצגים של מדידות עצם אלוואולריות ליניארית של עכברים נקבות וזכרים במשקל משקל בתחילת המצב (בריאות) ו-9 ימים לאחר הקשירה מוצגים באיור 1A. חישוב ההספק מצביע על כך שנדרשים בסך הכול 10 עכברים (4-5 עכברים בכל קבוצה) כדי לזהות הבדלים בין הקבוצות הללו אם התוצאה העיקרית היא רמות עצם ליניאריות הנמדדות באמצעות μCT (איור 1B). עם זאת, חישוב עוצמה למחקרים פרה-קליניים דורש ששתי קבוצות העכברים יפתחו פריודונטיטיס, אך אחת מהקבוצות ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מספק מידע מעמיק והכוונה מפורטת, שלב אחר שלב, בנוגע לפרוטוקול מודל העכבר המושרה על ידי ליגטורה, שהוצג קודםלכן. הפרטים הכלולים במאמר הנוכחי יכולים להשפיע באופן דרמטי על השחזוריות ונתמכים על ידי ניסיון הקבוצה עם דגם העכבר הספציפי הזה לדלקת פריודונטיטיס המושרתעל ידי קשירה 11,12,13,18,19,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבצי STL ששימשו ליצירת המכשירים המודפסים בתלת-ממד בפרסום הקודם9 נמצאים תחת הסכם זכויות יוצרים עם אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאלי של המכון הלאומי לבריאות תחת פרסים K01DE027087 (JTM) ו-R01DE032830 (JTM). העבודה נתמכה גם על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R01-AI153265 (KVS). התוכן נמצא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. בנוסף, המחקר המדווח כאן נתמך גם על ידי קוד הכספים 001 (TA) של תוכנית פולברייט/CAPES.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
להבאינטגרה4-315Cלהב 15C
חרוזי קרמיקהVWR10158-6080.5 מ"ל x 1.4 מ"מ חרוזי קרמיקה
חומר דבק/שרףחברת הדבק גורילה8401519
מחזיק קשורה (עם חריץ)מרכז העיצוב BeAM של UNC בצ'אפל היל הוא מרכז העיצובלא רלוונטי118.01 מ"מ x 13 מ"מ x 13.74 מ"מ
מנעול מחזיק קשורהמרכז העיצוב BeAM של UNC בצ'אפל היל הוא מרכז העיצובלא רלוונטי17.5 מ"מ x 14.57 מ"מ x 17.8 מ"מ
מדפסת תלת-ממד Lulzbot mini v1.0  Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)לא רלוונטיAleph Objects, דגם Lulzbot Mini v1.0
תוכנת מיקרווויוחדשנות פרלקס2.5.0-3139תוכנה למדידות עצם
מיטת שיניים עכבר (עם חריצים)מרכז העיצוב BeAM של UNC בצ'אפל היל הוא מרכז העיצובלא רלוונטי103.86 מ"מ x 196.85 מ"מ x 50.99 מ"מ
משטח מיטה דנטלי של עכברמרכז העיצוב BeAM של UNC בצ'אפל היל הוא מרכז העיצובלא רלוונטי99.8 מ"מ x 77 מ"מ x 21.5 מ"מ
חוט חומצה פולילקטית (PLA)מילה במילה552593.0 מ"מ PLA
ערכת רקמות RNA של Rapidpureביומדיקל MP112721050
ידית להב סקלפלברד-פארקר371030ידית להב סכין 15C
משי תפריםכלי ניתוח רובוזSUT-15-1
פריימרים של qPCR טאקמןתרמו פישררנק (Mm00437135_ מ1), רנקל (Mm00441906_ מ1), אופג' (Mm00435452_ מ1), גפדה (Mm99999915_g 1)
VX-765  InvivoGen, סן דייגו, ארה"ב#inh-vx765-1מעכב Caspase-1 המשמש למודולציה של מארח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Micro CT

מאמרים קשורים