הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל תרבית תלת מימד תרגומי להערכת השפעות היפראוקסיה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודל תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) תוך שימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAEC) ומבצעים חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני המושרה על ידי אטמוספירה על תאים שמקורם באפיתל פני השטח של דרכי הנשימה המתפתחות.

תקציר

אפיתל דרכי הנשימה הפגים חשוף כל הזמן לגורמי לחץ סביבתיים. אחד מגורמי הלחץ הללו בילודים עם מחלת ריאות כולל מתח חמצן (O2) גבוה יותר מהאטמוספירה הסביבתית - המכונה היפראוקסיה (>21% O2). השפעת ההיפראוקסיה על דרכי הנשימה תלויה בגורמים שונים, כולל השלב ההתפתחותי של דרכי הנשימה, מידת ההיפראוקסיה ומשך החשיפה, כאשר חשיפות משתנות עלולות להוביל לפנוטיפים ייחודיים. בעוד שקיים מחקר מקיף על השפעת היפראוקסיה על אלבאולריזציה של ריאות יילודים ותגובתיות יתר של דרכי הנשימה, מעט ידוע על ההשפעה הבסיסית לטווח הקצר והארוך של היפראוקסיה על תאי אפיתל של דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה עיקרית לכך היא המחסור במודל יעיל במבחנה לחקר התפתחות ותפקוד אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה של יילודים אנושיים (nTAECs) תוך שימוש בשאיבות קנה הנשימה של יילודים אנושיים ותרבית תאים אלה בתרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנו מדגימים כי nTAECs יוצרים תא חד-שכבתי מקוטב בוגר בתרבית ALI ועוברים התמיינות רירית. כמו כן, אנו מציגים שיטה לחשיפה מתונה להיפראוקסיה של חד-שכבת התא בתרבית ALI באמצעות אינקובטור מיוחד. בנוסף, אנו מתארים בדיקה למדידת מתח חמצוני תאי בעקבות חשיפה להיפראוקסיה בתרבית ALI באמצעות כימות פלואורסצנטי, המאשר כי חשיפה מתונה להיפרופקסיה גורמת למתח חמצוני תאי אך אינה גורמת לנזק משמעותי לקרום התא או לאפופטוזיס. ניתן להשתמש במודל זה כדי לדמות חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה קלינית בה נתקלים דרכי הנשימה של יילודים ביחידה לטיפול נמרץ בילודים (NICU) ולהשתמש בו כדי לחקור את ההשפעות הקצרות והארוכות טווח של O2 על תכנות אפיתל דרכי הנשימה של היילודים. ניתן להשתמש במחקרים המשתמשים במודל זה כדי לחקור דרכים להפחית פגיעה חמצונית בגיל מוקדם בדרכי הנשימה המתפתחות, המעורבת בהתפתחות מחלות ארוכות טווח בדרכי הנשימה אצל פגים לשעבר.

מבוא

חמצן טיפולי (O2) הוא אחד הטיפולים הנפוצים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ יילודים (NICU)1. כתוצאה מכך, חשיפה להיפראוקסיה (>21% O2) היא גורם לחץ אטמוספרי שכיח בו נתקלים יילודים עם ובלי מחלת ריאות משמעותית. תגובות הריאות להיפראוקסיה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת ו/או משך החשיפה והמיקום האנטומי, סוג התא ושלב התפתחות הריאות 2,3,4,5,6. עיקר המחקר בפגיעה ריאתית היפראוקסיה בילודים התמקד בהשפעת החשיפה להיפראוקסיה בהקשר של אלבאולריזציה לאחר הלידה....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות שאיבת קנה הנשימה של היילודים נאספו רק לאחר הסכמה מדעת של ההורים, והפרוטוקול המשמש לאיסוף, הובלה ואחסון אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (IRB 14377).

1. הכנה לבידוד, מעבר ותרבית ALI של nTAEC

  1. הכנת מדיה
    1. מדיום אפיתל סימפונות (BLEAM) עם מעכבים (BLEAM-I): הכן 500 מ"ל (בקבוק אחד, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) של BLEAM על ידי הוספת 1.25 מ"ל של תוסף HLL (500 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין בסרום אנושי, 0.6 מיקרומטר חומצה לינולאית, 0.6 מיקרוגרם/מ"ל לציטין), 15 מ"ל L-גלוטמין (6 מ"מ), 2 מ"ל תמצית P (0.4%, תמצית יותרת המוח בקר), 5 מ"ל TM1....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבודד nTAECs, אספנו שאיפות קנה נשימה מיילודים שעברו אינטובציה בפגייה והעברנו את השאיפות על קרח למעבדה להמשך עיבוד (איור 1A). לאחר זריעת דגימות השאיבה של קנה הנשימה במדיום גידול אפיתל של דרכי הנשימה (BLEAM-I המכיל מעכבי Rho/Smad, GSK3 ו-mTOR), הופיעו תאים קובואידיים תוך 7-10 ימים. לאחר 14 יום, התאים היו 50%-60% מתלכדים, וכ-21 יום לאחר הציפוי, התאים היו ארוזים בצפיפות ודרשו טריפסיניזציה למעבר והתרחבות לאחר מכן. מעברים סדרתיים של תאים אלה (עד P3) נשמרו בהקפ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה לאיסוף ועיבוד של דגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים מיילודים אינטובציה בפגייה עם בידוד והרחבה של nTAECs חיים מדגימות אלה תוך שימוש בשיטות שנקבעו בעבר39. יתר על כן, תיארנו שיטה לתרבית nTAECs ב-ALI ואפיון ההתמיינות שלהם לאפיתל מקוטב של דרכי הנשימה הריריות כפונקציה של זמן באמצעות מדידת TEER, בדיקת FITC-dextran, צביעה אימונו-פלואורסצנטית וניתוח qPCR של סמנים ספציפיים לסוג התא (כלומר, בסיסי, ריסני, מועדון וגביע). ההיבט החדש של פרוטוקול זה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי אינטרסים לדווח עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מימון מקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF) ומשאבים קליניים ותרגומיים משותפים של אוקלהומה (U54GM104938 עם פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מ-NIGMS) ל-AG. אנו רוצים להודות לד"ר פול לרו ולד"ר שינגבין איי מבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, על שסיפקו תאים מתורמי יילודים ששימשו בחלק מהניסויים. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמליןפישר סיינטיפיק23-426796
1X PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט), pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5 מ"מקורנינג3470
נוגדן טובולין אנטי אצטיל, עכבר חד שבטיSigmaT7451
נוגדן אנטי אלפא טובוליןAbcamab7291
אנטי ציטוקרטין 5 נוגדןAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
נוגדן קספאז-3 שסועאיתות תאים9664T
SCGB1A1 או חלבון תא מועדון (CC16) נוגדן רב-שבטי אנושי, ארנבBioVendor מו"פ DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (מחוון מתח חמצוני כללי)Thermo ScientificC6827
תרבית תאי קורנינג מטופלת צלוחיות T25קורנינג430639
קורנינג תרבית תאים בצורת U T75 צלוחיותקורנינג430641U
CyQUANT LDH בדיקת ציטוטוקסיותThermo ScientificC20300
DAPI תמיסה (1 מ"ג/מ"ל)פישר סיינטיפיקEN62248
דימתיל סולפוקסיד [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
מים מזוקקיםGibco15230162
EVOM מדריך למדידת TEERמכשיר דיוק עולמיEVM-MT-03-01
FBS (סרום בקר עוברי)Gibco10082147
פלואורסצאין איזותיוציאנט דקסטרן (משקל ממוצע של 10,000 מול)פישר סיינטיפיקF0918100MG
פלואורסצאין איזותיוציאנט וכו'; דקסטרן (ממוצע מול WT 20,00)SigmaFD20-100MG
עיזים נגד עכבר IgG (H+L), מודעות אנושיות-HRPSouthern Biotech1031-05
עז נגד עכבר IgG2b נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
עיזים נגד ארנב IgG (H+L), מודעות עכבר/אדם-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC ממשק אוויר-נוזל (ALI) בידולתא אורך חייםLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 אינקובטור, 165 ליטרתרמו מדעי
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההתרמו סיינטיפיק4368814
HLLטכנולוגיית תאים LifeLineLS-1001
ImageJNIHN / A
Invivogen Normocin - מגיב אנטי מיקרוביאליפישר סיינטיפיקNC9273499
L-גלוטמיןטכנולוגיית תאי LifeLine LS-1013
סרום עיזים רגילGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-25268
ProLong זהב Antifade MountantInvitrogenp36930
PureLink RNA מיני קיטתרמו מדעי12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression מבחנים: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression מבחנים: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: GAPDHמבחני Thermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression מבחנים: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: KRT5Thermo Scientific
Taqman Gene Exression Tests: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Tests: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
יחידות מסנן חד פעמיות סטריליות סטריליות של Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow עם קרום PES (0.22 μ נקבוביות, 500 מ"ל)Thermo Scientific5660020
TM-1 תוסף משולבLifeLine Cell TechnologyLS-1055
סה"כ קספאז-3 נוגדניםאיתות תאים14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
טכנולוגיית בינוני 51030411 תוסף imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1

מקורות

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Ph....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תאים תלת-ממדיתחשיפה להיפר-אוקסיהתאי דרכי נשימה של ילודיםממשק אוויר-נוזלבדיקת עקה חמצוניתבידוד משאבת קנהדיפרנציאציה מוקוציליאריתקיטוב שכבת תאים חד-שכבתיתמחלת ריאות של ילודים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.