מאמר שיטה

מודל תרבית תלת מימד תרגומי להערכת השפעות היפראוקסיה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודל תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) תוך שימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAEC) ומבצעים חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני המושרה על ידי אטמוספירה על תאים שמקורם באפיתל פני השטח של דרכי הנשימה המתפתחות.

תקציר

אפיתל דרכי הנשימה הפגים חשוף כל הזמן לגורמי לחץ סביבתיים. אחד מגורמי הלחץ הללו בילודים עם מחלת ריאות כולל מתח חמצן (O2) גבוה יותר מהאטמוספירה הסביבתית - המכונה היפראוקסיה (>21% O2). השפעת ההיפראוקסיה על דרכי הנשימה תלויה בגורמים שונים, כולל השלב ההתפתחותי של דרכי הנשימה, מידת ההיפראוקסיה ומשך החשיפה, כאשר חשיפות משתנות עלולות להוביל לפנוטיפים ייחודיים. בעוד שקיים מחקר מקיף על השפעת היפראוקסיה על אלבאולריזציה של ריאות יילודים ותגובתיות יתר של דרכי הנשימה, מעט ידוע על ההשפעה הבסיסית לטווח הקצר והארוך של היפראוקסיה על תאי אפיתל של דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה עיקרית לכך היא המחסור במודל יעיל במבחנה לחקר התפתחות ותפקוד אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה של יילודים אנושיים (nTAECs) תוך שימוש בשאיבות קנה הנשימה של יילודים אנושיים ותרבית תאים אלה בתרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנו מדגימים כי nTAECs יוצרים תא חד-שכבתי מקוטב בוגר בתרבית ALI ועוברים התמיינות רירית. כמו כן, אנו מציגים שיטה לחשיפה מתונה להיפראוקסיה של חד-שכבת התא בתרבית ALI באמצעות אינקובטור מיוחד. בנוסף, אנו מתארים בדיקה למדידת מתח חמצוני תאי בעקבות חשיפה להיפראוקסיה בתרבית ALI באמצעות כימות פלואורסצנטי, המאשר כי חשיפה מתונה להיפרופקסיה גורמת למתח חמצוני תאי אך אינה גורמת לנזק משמעותי לקרום התא או לאפופטוזיס. ניתן להשתמש במודל זה כדי לדמות חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה קלינית בה נתקלים דרכי הנשימה של יילודים ביחידה לטיפול נמרץ בילודים (NICU) ולהשתמש בו כדי לחקור את ההשפעות הקצרות והארוכות טווח של O2 על תכנות אפיתל דרכי הנשימה של היילודים. ניתן להשתמש במחקרים המשתמשים במודל זה כדי לחקור דרכים להפחית פגיעה חמצונית בגיל מוקדם בדרכי הנשימה המתפתחות, המעורבת בהתפתחות מחלות ארוכות טווח בדרכי הנשימה אצל פגים לשעבר.

מבוא

חמצן טיפולי (O2) הוא אחד הטיפולים הנפוצים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ יילודים (NICU)1. כתוצאה מכך, חשיפה להיפראוקסיה (>21% O2) היא גורם לחץ אטמוספרי שכיח בו נתקלים יילודים עם ובלי מחלת ריאות משמעותית. תגובות הריאות להיפראוקסיה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת ו/או משך החשיפה והמיקום האנטומי, סוג התא ושלב התפתחות הריאות 2,3,4,5,6. עיקר המחקר בפגיעה ריאתית היפראוקסיה בילודים התמקד בהשפעת החשיפה להיפראוקסיה בהקשר של אלבאולריזציה לאחר הלידה למודל דיספלזיה ברונכופולמונרית (BPD) - מחלת הריאות הכרונית הנפוצה ביותר הפוגעת בפגים 6,7,8,9,10,11. חומרת הפרעת אישיות גבולית מסווגת לפי כמות התמיכה הנשימתית, ו-O2 הדרוש בשבוע 36 לאחר גילהווסת 9. רוב התינוקות עם הפרעת אישיות גבולית משתפרים קלינית עם הזמן ככל שהריאות ממשיכות לגדול, כאשר רובם נגמלים מתמיכה נשימתית לפני יום הולדתם הראשון12,13. ללא קשר לחומרת הפרעת אישיות גבולית לאחר הלידה, תחלואה משמעותית המשפיעה על פגים לשעבר כוללת סיכון מוגבר פי 5 לצפצופים בגיל הרך, אסטמה, זיהומים נשימתיים חוזרים במהלך הילדות, ומחלת ריאות חסימתית כרוניתמוקדמת 12,14,15,16,17,18,19 . ההשפעה של היפראוקסיה על מחלות דרכי נשימה ארוכות טווח וזיהומים ריאתיים בפגים נחקרה באמצעות מודלים של בעלי חיים במבחנה וב-vivo 20,21,22,23,24. עם זאת, רוב המודלים הללו התמקדו בתפקיד הרקמה המזנכימלית, האפיתל המכתשית והשריר החלק של דרכי הנשימה 25,26,27,28.

אפיתל פני השטח של דרכי הנשימה מצפה את כל הנתיב של מערכת הנשימה, משתרע מקנה הנשימה עד לסימפונות הסופיים, ומסתיים ממש לפני מפלס הנאדיות29. תאי בסיס של דרכי הנשימה הם תאי הגזע העיקריים באפיתל דרכי הנשימה, עם היכולת להתמיין לכל הרפרטואר של שושלות אפיתל בוגרות של דרכי הנשימה, הכוללות תאים ריסניים ומפרישים (תאי מועדון: לא מייצרים ריר, ותאי גביע: מייצרי ריר)29,30,31,32. מחקרי תרבית תאים בהקשר של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים השתמשו בעיקר בקווי תאים של סרטן אנושי או עכבר בוגרים33,34. בנוסף, רוב הניסויים במבחנה השתמשו במערכות תרבית שקועות, שאינן מאפשרות התמיינות של התאים לאפיתל של דרכי הנשימה הריריות הדומה לאפיתל דרכי הנשימה in vivo בבני אדם35. כתוצאה מכך, קיים פער בידע לגבי ההשפעות של פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי היפראוקסיה בהתפתחות תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה אחת היא המחסור במודלים תרגומיים לחקר ההשפעות של חשיפה אטמוספרית על אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. פגיעה ריאתית היפראוקסית בשלב מוקדם בחיים עלולה להוביל למחלה ארוכת טווח בדרכי הנשימה ולסיכון מוגבר לזיהום, וכתוצאה מכך להשלכות משנות חיים אצל פגים לשעבר 14,36,37. בתינוקות שאינם שורדים עם הפרעת אישיות גבולית חמורה, לאפיתל פני השטח של דרכי הנשימה יש חריגות מובהקות, כולל היפרפלזיה של תאי גביע והתפתחות ריסנית לא תקינה, המציינת פינוי רירית לא תקין וגובה אפיתל מוגבר הפוגע בקליבר דרכי הנשימה38. בעשור האחרון, היה עניין גובר בתרבית תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לחקור את התפתחות האפיתל של דרכי הנשימה לאחר הלידה 39,40,41,42. עם זאת, מודלים של ALI של תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים לא שימשו בהקשר של מודלים של הפרעות חמצון חיזור אטמוספרי כגון חשיפה להיפראוקסיה.

באמצעות שיטה39 שפורסמה בעבר, השתמשנו בדגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים שהתקבלו מיילודים מונשמים בפגייה ובודדנו והרחבנו בהצלחה תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של קנה הנשימה (nTAECs). השתמשנו במעכבים של Rho, Smad, גליקוגן סינתאז קינאז (GSK3), ויעד יונקים של איתות רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל את יכולת ההתפשטות ולעכב את ההזדקנות בתאים אלה, כפי שתואר קודם לכן39,42, מה שמאפשר מעבר יעיל ומאוחר יותר של nTAECs. הפרוטוקול מתאר שיטות להקמת תרביות ALI תלת מימדיות באמצעות nTAECs וביצוע חשיפה להיפראוקסיה על חד-שכבות nTAEC. עיכוב Rho ו-Smad משמש במשך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI (ימי ALI 0 עד 7), ולאחר מכן מעכבים אלה מוסרים מאמצעי ההתמיינות למשך שארית תקופת תרבית ALI. המשטח האפיקלי של חד-שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה בתרבית ALI נשאר חשוף לסביבה43, מה שמאפשר מחקרי הפרעות אטמוספריות ודומה מאוד לפתוביולוגיה של דרכי נשימה מתפתחות של יילודים שנחשפו להיפראוקסיה in vivo. ריכוז ה-O2 ששימש במחקרי תרבית תאים קודמים (ללא קשר לתאים אימורטליים או ראשוניים) של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים משתנה באופן משמעותי (נע בין 40% ל-95%), וכך גם משך החשיפה (נע בין 15 דקות ל-10 ימים)36,44,45,46,47. במחקר זה, תאי ה-ALI נחשפו ל-60% O2 במשך 7 ימים מהיום ה-7 עד ה-14 של ALI (לאחר הסרת מעכבי Rho/Smad מאמצעי ההתמיינות). חשיפה להיפראוקסיה בוצעה בשלב המוקדם-אמצע של התמיינות הרירית (ALI יום 7 עד 14) בניגוד לאפיתל הבוגר המובחן במלואו ובכך מדמה את אפיתל דרכי הנשימה המתפתח in vivo בפגים. אסטרטגיית חשיפה זו ממזערת את הסיכון לרעילות O2 חריפה (הצפויה עם ריכוזים גבוהים יותר של O2) תוך הפעלת מתח חמצוני בטווח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ודומה לחלון המעבר הקריטי מהסביבה התוך רחמית ההיפוקסית יחסית לסביבה חיצונית היפראוקסית בילודים אנושיים פגים.

פרוטוקול

דגימות שאיבת קנה הנשימה של היילודים נאספו רק לאחר הסכמה מדעת של ההורים, והפרוטוקול המשמש לאיסוף, הובלה ואחסון אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (IRB 14377).

1. הכנה לבידוד, מעבר ותרבית ALI של nTAEC

  1. הכנת מדיה
    1. מדיום אפיתל סימפונות (BLEAM) עם מעכבים (BLEAM-I): הכן 500 מ"ל (בקבוק אחד, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) של BLEAM על ידי הוספת 1.25 מ"ל של תוסף HLL (500 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין בסרום אנושי, 0.6 מיקרומטר חומצה לינולאית, 0.6 מיקרוגרם/מ"ל לציטין), 15 מ"ל L-גלוטמין (6 מ"מ), 2 מ"ל תמצית P (0.4%, תמצית יותרת המוח בקר), 5 מ"ל TM1 (1 מיקרומטר אפינפרין, 5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 10 ננומטר טריודוטירונין, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 5 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי (EGF), 5 ננוגרם/מ"ל אינסולין), 1 מ"ל תמיסת אנטיביוטיקה (נורמוצין, 0.1 מ"ג/מ"ל). כדי למנוע הזדקנות של התאים הראשוניים ולשפר את יעילות ההתפשטות, הוסף את מעכבי גורם הגדילה הבאים כפי שתואר קודם לכן39: Y-27632 (מעכב חלבון קינאז או מעכב ROCK) עם ריכוז סופי של 5 מיקרומטר, A83-01 (מעכב איתות Smad) עם ריכוז סופי של 1 מיקרומטר, CHIR 99021 (מעכב גליקוגן סינתאז קינאז-3 או מעכב GSK3) עם ריכוז סופי של 0.4 מיקרומטר ורפמיצין (מעכב מטרה מולקולרית של רפמיצין או mTOR) עם ריכוז סופי ריכוז של 5 ננומטר. סנן את המדיה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה של רכיבי מדיה.
    2. מדיום ALI של תאי אפיתל סימפונות/קנה הנשימה האנושיים (HBTEC): הכינו 500 מ"ל של חומר HBTEC על ידי הפשרת הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס והוספת 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה (נורמוצין, 0.1 מ"ג/מ"ל). לאחר ההוספה, סנן את המדיה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
    3. מדיית HBTEC עם מעכבים (HBTEC-I): הכן את מדיית HBTEC כמפורט לעיל. לפני הסינון יש להוסיף את המעכבים הבאים: Y-27632 בריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו-A83-01 בריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר.
      הערה: אחסן מדיה BLEAM-I, HBTEC ו-HBTEC-I בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מתוארכת ומסומנת, בחושך (עטוף בנייר כסף), ורק לחמם את הכמות הדרושה (חיי המדף הם 30 יום).
    4. HEPES/FBS: הוסיפו 500 מ"ל של מי מלח עם חוצץ HEPES ו-88 מ"ל של FBS (הריכוז הסופי הוא 15%). לאחר ההוספה, סנן את התמיסה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מתוארכת ומסומנת.
      הערה: יש לחמם את BLEAM, HEPES-FBS ו-Trypsin-EDTA ל-37 מעלות צלזיוס (לפחות 30 דקות) לפני השימוש.
  2. ציפוי צלוחיות תרבית ותוספות תרבית תאים ALI עם מדיום ממוזג 804G
    1. הכן מדיה מותנית מטריצת תא 804G (קו תאי אפיתל של שלפוחית השתן של חולדה) כפי שתואר קודם לכן39.
    2. מצפים את בקבוק תרבית התאים ותוספות תרבית התאים במדיה מותנית 804G למשך 4 שעות לפחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. עיין בטבלה 2 לכמויות המדיה הדרושות לציפוי צלוחיות תרבית שונות ותוספות תרבית תאים.

2. בידוד והרחבה של nTAECs והכנה לתרבית ALI הבאה

  1. רכשו שאיבה טרייה של קנה הנשימה (כ-1 מ"ל) במהלך יניקה שגרתית של הצינור האנדוטרכיאלי של יילודים מונשמים ואספו את השאיפה במלכודת ריר. אם נפח השאיבה אינו מספיק כדי להגיע למלכודת הריר, שטפו את קטטר היניקה עם 1-3 מ"ל מי מלח סטריליים.
  2. סמן את הדגימה ואחסן אותה בשקית ביולוגית על קרח.
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לכל היותר. עם זאת, התשואה גבוהה יותר עם דגימות טריות.
  3. העבר את הדגימה מהפגייה למעבדה. מצפים בקבוק T25 במדיה מותנית 804G ומתכוננים לחיסון הדגימה בזמן הובלת שאיבת קנה הנשימה למעבדה.
  4. הסר את מלכודת הריר משקית הסכנה הביולוגית ונקה היטב את המשטחים החיצוניים עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. פתח בזהירות את המכסה על מלכודת הריר מתחת למכסה מנוע סטרילי של תרבית תאים.
  5. יש לדלל את דגימת שאיבת קנה הנשימה עם PBS סטרילי ל-5 מ"ל (לדילול ריר) ולהעביר את כל התוכן לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  6. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 250 x גרם, 20°C-23°C למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט (כולל ריר).
    הערה: כל הצנטריפוגות כאן נעשות בטמפרטורה של 250 x גרם, 20 °C-23 °C למשך 5 דקות אלא אם צוין אחרת.
  7. השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של BLEAM-I.
  8. הסר את בקבוק T25 מהחממה והשליך את המדיה הממוזגת 804G לפני ציפוי הדגימה.
  9. צלחו את הדגימה בבקבוק T25 והניחו בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (זה ייקרא מעבר 0 או P0).
  10. החלף את המדיה עם BLEAM-I 24 שעות לאחר הציפוי כדי לשטוף תאים לא מחוברים ולאחר מכן כל 48 שעות.
    הערה: לאחר עיבוד דגימת השאיבה של קנה הנשימה והדגירה שלה במדיה BLEAM-I, תאים בצורת קוביה מופיעים 7-10 ימים לאחר הציפוי. בסביבות 3 שבועות לאחר הציפוי, התאים ארוזים בצפיפות ודורשים טריפסיניזציה לצורך מעבר, הרחבה ואחסון לאחר מכן. תאי מעבר מוקדם (P1 - P2) ממוקמים בצינורות קריו-צינורות (2.5 x 106 תאים לכל 500 מיקרוליטר של חומרי הקפאה לכל קריו-טיוב) ומאוחסנים בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  11. הפשירו במהירות תאים קפואים מחנקן נוזלי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והעבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי בגודל מתאים המכיל BLEAM-I.
  12. ספור את התאים כדי לקבוע את מספר התאים הכולל והחי באמצעות כתם כחול טריפן ומונה תאים אוטומטי או ידני כמתואר קודם לכן48. יש לדלל את תרחיף התאים בנפח מתאים של BLEAM-I, כך שהריכוז הסופי הוא 2.1 x 106 תאים ב-15 מ"ל של תרחיף תאים (עבור בקבוק T75).
    הערה: עבור בקבוק T25, 0.7 x 106 תאים ב-5 מ"ל של תרחיף תאים משמשים בדרך כלל לזריעה.
  13. העבירו את תרחיף התאים בנפח 15 מ"ל לבקבוק T75 ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  14. למחרת בבוקר, החליפו את התקשורת עם BLEAM-I החדש. לאחר מכן, החליפו את המדיה ב-BLEAM-I חדש כל יומיים. ברגע שהתאים בסביבות 80%-90%, הם מוכנים לטריפסין לתרבית ALI.
  15. החל 5 מ"ל של טריפסין-EDTA (T75) על תא חד-שכבתי.
    הערה: זכרו להשתמש בטריפסין טרי. הימנעו משימוש בטריפסין שחומם מספר פעמים.
  16. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחממה. לאחר מכן, הקש על צד הבקבוק 8x-10x כדי לעקור את התאים. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נעקרו לאחר טריפסיניזציה. אם >50% מהתאים נשארים על הבקבוק, יש לשטוף עם PBS 2x ולחזור על שלב הטריפסיניזציה עם זמן דגירה מופחת של 2-3 דקות.
  17. עצור את התגובה עם 15 מ"ל של HEPES-FBS ופיפטה למעלה ולמטה 4x-5x. העבירו את התאים לצינור סטרילי בגודל מתאים וצנטריפוגה ב-250 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.
  18. לאחר צנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. ממיסים את כדור התא ב-1 מ"ל של BLEAM-I על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 5x-10x.
  19. ספור את התאים כדי לקבוע את מספר התא הכולל ואת מספר התא החי. יש לדלל את תרחיף התאים בנפח מתאים של BLEAM-I, כך שהריכוז הסופי הוא 1 x 105 תאים חיים לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים.

3. תרבות ALI של nTAECs

הערה: יש לצבוע את תוספות תרבית התאים במדיה ממוזגת 804G ולדגור למשך 4 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לפני השלב הבא (ראה שלב 1.2).

  1. הסר את צלחות תרבית התאים בעלות 24 בארות המכילות את תוספות תרבית התאים מהחממה והשליך את המדיה המותנית ב-804G.
  2. הוסף 1 מ"ל של BLEAM-I לתא הבסיסי (התחתון) של כל באר ALI. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים (1 x 105 תאים) לתא האפיקלי של מוסיף תרבית התאים ALI ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. שלב זה מוגדר כ-ALI יום -2.
  3. למחרת, החלף את המדיה בתאים הבסיסיים (1 מ"ל) והאפיקליים (100 מיקרוליטר) עם BLEAM-I טרי. בעת החלפת המדיה בתא האפיקלי, היזהר לא להפריע לחד-שכבת התא. שלב זה מוגדר כ-ALI יום -1.
  4. למחרת, הסר את המדיה הן מהתא הבסיסי והן מהתא האפיקלי.
    הערה: לוקח יומיים עד שהתאים על קרום תרבית התאים מתכנסים בתנאים שקועים. בשלב זה ניתן להקים ALI.
  5. הוסף 1 מ"ל של מדיה HBTEC-I לתא הבסיסי אך השאר את מדיה התא האפיקלי חופשית וחשופה לאוויר. שלב זה מוגדר כיום ALI 0.
  6. המשך להחליף את המדיה HBTEC-I (1 מ"ל) בתא הבסיסי כל 48 שעות מיום 0 עד 6 של ALI. עבור למדיית HBTEC רגילה (ללא מעכבים) ביום 7 של ALI עד לנקודת הזמן הרצויה של הקציר.
    הערה: במהלך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI, מדיה מהתא הבסיסי עלולה לדלוף לתוך החדר האפיקלי. יש לשאוב את המדיה הזו בזהירות מדי יום כדי לשמור על בריאות שכבת התא ולאפשר להם להתמיין.
  7. קצור תאים, תוספות תרבית תאים ומדיה בסיסית בנקודות זמן שונות לטכניקות מולקולריות, בדיקות וניתוח.
    1. עבור פרוטוקול זה, בימי ALI 0, 7 ו-28, קצרו תאים לניתוח ביטוי גנים qPCR (פרוטוקול יצרן סטנדרטי) של סמני התמיינות אפיתל. בימי ALI 0, 7, 14 ו-28, תוספות תרבית תאים לבדיקת תפקוד המחסום (שיטות המתוארות להלן).
    2. בימים 0 ו-28 של ALI, השתמש בתוספות תרבית תאים קבועות פורמלין לצביעה אימונו-פלואורסצנטית עם סמני התמיינות אפיתל (תוך שימוש בפרוטוקול שפורסם בעבר)49. ביום ה-14 של ALI, קצירת מדיה בסיסית לשחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) (פרוטוקול יצרן סטנדרטי), ליזאטים של תאים ל-qPCR של סמני עקה חמצונית, ואימונובלוט עם נוגדנים caspase-3 ו-caspase-3 שסועים (פרוטוקול יצרן סטנדרטי), ותוספות תרבית תאים לבדיקת עקה חמצונית (שיטה המתוארת להלן).

4. בדיקת תפקוד מחסום במהלך התמיינות ALI

  1. מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER)
    הערה: מדוד TEER באמצעות מד וולט/אוהם אפיתל (EVOM) במהלך התמיינות ALI כדי להעריך את תקינות שכבת התא50.
    1. לפני מדידת ערכי התנגדות מסנן הבדיקה, השתמש בתרבית תאים מצופה מדיה מותנית 804G (נטולת תאים) כדי למדוד את ערך התנגדות הרקע באוהם (Ω)
    2. הפחיתו את ערך התנגדות הרקע מערכי ההתנגדות של מסנן הבדיקה והכפילו את ההבדל בשטח הפנים של גידול התא כדי לקבל ערך TEER עבור כל מסנן בדיקה.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (Ω.ס"מ2)
      ΩT = ערך התנגדות מסנן בדיקה (Ω)
      ΩB = ערך התנגדות רקע (Ω)
      C = שטח הפנים של גידול התאים (ס"מ2)
      הערה: תוספות תרבית תאים המשמשות למדידות TEER מקובעות לאחר מכן עם פורמלין חוצץ של 10% ומשמשות מיד לצביעה אימונו-פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית (שיטה המתוארת להלן) או מאוחסנות ב-4 מעלות צלזיוס לצביעה מאוחר יותר.
  2. בדיקת חדירות אפיתל פלואורסצאין איזתיונאט דקסטרן (FITC-dextran)
    הערה: בדיקת חדירות אפיתל בוצעה תוך שימוש בשני משקלים מולקולריים שונים של FITC-dextan (10 kD ו-20 kD) במהלך התמיינות ALI.
    1. הכן תמיסת עבודה של FITC-dextan (1 מ"ג/מ"ל): מדוד 5 מ"ג של FITC וערבב פנימה 1 מ"ל של DMSO (5 מ"ג/מ"ל). יש להשעות מלאי של 5 מ"ג/מ"ל במדיה HBTEC המחוממת ל-37 מעלות צלזיוס לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. הגן על התמיסה מפני אור.
    2. העבירו מסנני בדיקה (המכילים תאים) לצלחת חדשה של 12 בארות והוסיפו 1 מ"ל של מדיה HBTEC בתא הבסיסי.
    3. שאפו את מדיית התא האפיקלי (אם קיימת) והחליפו ב-250 מיקרוליטר של תמיסת עבודה FITC-dextran. דגירה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור למשך 60 דקות.
    4. סיים את בדיקת FITC-dextran על ידי הסרת מסנני הבדיקה (המכילים תמיסת עבודה FITC-dextran) מלוח 12 הבארות.
    5. אסוף את המדיה הבסיסית מצלחת 12 הבארות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומערבולת.
    6. העבירו 100 מיקרוליטר אליקוטים מכל צינור למיקרו-פלטת פוליסטירן שחורה תחתונה שקופה של 96 בארות בשלושה עותקים. העבר 100 מיקרוליטר של מדיית HBTEC לבארות נוספות בלוח 96 הבארות כבקרה שלילית למדידת פלואורסצנטיות ברקע.
    7. מדוד את עוצמת הקרינה באמצעות ספקטרופוטומטר באמצעות עירור של 490 ננומטר ומקסימום פליטה של 520 ננומטר.
    8. הפחיתו את ערך הקרינה הממוצע ברקע מערכי הקרינה של מסנן הבדיקה כדי לקבל פלואורסצנטיות מתוקנת ולבטא את הערכים כאחוז מול ערכי הקרינה המתוקנים ביום ALI 0 עבור FITC 10 kD ו-20 kD.

5. חשיפה להיפראוקסיה באמצעות חממת TriGas

  1. ביום 7 של ALI, קבע את מספר התוספות של תרבית תאים שיש להכניס להיפראוקסיה על סמך צרכי הניסוי והקציר.
  2. הגדר את רמת O2 בחממת TriGas ל-60% O2. בדרך כלל לוקח ~30-45 דקות עד שרמת O2 מגיעה ל-60%.
  3. ברגע שרמת ה-O2 מתייצבת על 60%, הניחו את צלחת תרבית התאים בת 24 הבארות עם תוספות תרבית התאים שהוקצו לקבוצת ההיפראוקסיה בתוך החממה וסגרו את דלת החממה.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע בצורה יעילה ככל האפשר כדי למנוע ירידה משמעותית ברמת O2 בתוך החממה.
  4. שנה את המדיה בתוספות תרבית התאים החשופות להיפראוקסיה בהתאם לאותו לוח זמנים כמו בארות הבקרה (21% O2 חשופות). בדוק את תוספות תרבית התאים מדי יום לאיתור דליפת מדיה ושאף בעדינות כל דליפה לתא תרבית התאים.
  5. המשך חשיפה להיפראוקסיה במשך 7 ימים (ALI ימים 7 עד 14). לאחר השלמת החשיפה להיפראוקסיה, קצרו תאים או בצעו בדיקות באמצעות תוספות תרבית תאים ביום ה-14 של ALI.

6. בדיקת מתח חמצוני להערכת ההשפעות של היפראוקסיה

הערה: השתמשנו בערכת הבדיקה CM-H2DCFDA ומדדנו את עוצמת הקרינה ביום ה-14 של ALI כסמן לעקה חמצונית בתוספות תרבית תאים לאחר חשיפה ל-O2 . H2DCFDA היא צורה מופחתת כימית ואצטילית של 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF) המהווה אינדיקטור חי לתאים של מיני חמצן תגובתיים (ROS). CM-H2DCFDA הוא נגזרת הכלורו-מתיל התגובתי של H2DCFDA, המקדם קשירה קוולנטית נוספת לרכיבים תוך-תאיים, ומאפשר שמירה ארוכה יותר של הצבע בתוך התא. מולקולות אלה אינן פלואורסצנטיות עד להסרת קבוצות האצטט על ידי פעולת אסטרזות תוך-תאיות, וחמצון מתרחש בתא51. בעקבות חמצון תוך-תאי, ניתן למדוד את העלייה הנובעת מכך בקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמדד חלופי למתח חמצוני תאי52. המגיב קל ורגיש לאוויר ולכן יש להגן עליו מפני אור ולשמור עליו אטום ככל האפשר.

  1. הכנת תמיסת בדיקת CM-H2DCFDA: כל בקבוקון מכיל 50 מיקרוגרם של צבע מגיב בצורת אבקה. להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"מ, הוסיפו לבקבוקון 80 מיקרוליטר של DMSO סטרילי, ערבבו היטב עם פיפטה ומערבלו בעדינות. עבור ריכוז סופי של 1 מיקרומטר של הצבע בתוספות תרבית תאים, הוסף 0.1 מיקרוליטר ממלאי 1 מ"מ לכל 100 מיקרוליטר PBS (למשל, הוסף תמיסת מלאי של 0.6 מיקרוליטר ל-600 מיקרוליטר PBS עבור 6 תוספות תרבית תאים).
    הערה: הריכוז הסופי של הצבע יכול לנוע בין 1-5 מיקרומטר. יש למטב את המינון לכל מצב תרבית.
  2. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הצבע של 1 מיקרומטר בכל תרבית תאים הן עבור הקבוצה שנחשפה להיפראוקסיה והן עבור הקבוצה שנחשפה לנורמוקסיה. השתמש בתרבית תאים אחת לפחות כבקרה שלילית מכל קבוצת טיפול (100 מיקרוליטר PBS ללא צבע). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מוגנת מפני אור. שטפו 1x עם PBS.
  3. הכנת שקופית: מסננים את כל ה-PBS העודף. החזק בזהירות את תוספות תרבית התאים והשתמש בלהב כדי לחתוך לאט את קרום תרבית התאים. יוצקים 1-2 טיפות נוזל הרכבה על השקופית. בעזרת מלקחיים שטוחים, החזק בזהירות את פינת הממברנה, הנח אותה עם צד התא כלפי מטה על התושבת וכסה אותה בהחלקת כיסוי. הסר עודפי נוזל הרכבה והשאיר לייבוש באוויר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. השקופיות מוכנות כעת לצילום.
    הערה: יש לבצע את הכנת השקופית והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית במהירות האפשרית מכיוון שעוצמת הפלואורסצנט דועכת משמעותית במשך 2-3 שעות.
  4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך שימוש בערוץ Cy2 (ציאנין-2). צלם תמונות משלושה אזורים נפרדים שאינם חופפים לכל תרבית תאים.
  5. זיהוי פלואורסצנטי של מתח חמצוני
    הערה: השתמש בתמונות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי למדוד פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים (CTCF) באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) וזרימת העבודה המתוארת להלן. CTCF משמש כסמן לעקה חמצונית בתוספות תרבית התאים לאחר חשיפה להיפראוקסיה ונמדד על ידי ביטול הקרינה ברקע בעזרת תוכנת ImageJ.
    1. פתחו את תמונת המיקרוסקופיה ב-ImageJ ובחרו את אזור העניין בעזרת הכלי מלבן. שמור את אזור הבחירה (α) על-ידי לחיצה ימנית ובחר הוסף למנהל החזר ההשקעה (אזור עניין). השתמשו באזור בחירה זה בכל התמונות.
    2. בחר את הפרמטרים למדידה תחת Analyze > Set Measurements ובחר Area, Integrated Density ו-Mean Gray Value בכרטיסייה Settings.
    3. עבור כל תמונה, השתמש באותו אזור בחירה ממנהל ההחזר על ההשקעה ובחר Analyze > Measure. ערך הצפיפות המשולב מייצג את הקרינה הכוללת (Ft) של האזור הנבחר. רשום את ערכי המדידה מהחלון המוקפץ.
    4. כדי לתקן את הקרינה ברקע (Fb) בכל תמונה, בחר אזור קטן של אזור שאינו פלואורסצנטי בעזרת הכלי מלבן. בחר נתח > מדידה עבור אזור זה. ערך העוצמה הממוצע מייצג את Fb. רשום את ערכי המדידה מהחלון המוקפץ.
    5. חשב CTCF על ידי הכפלת עוצמת הקרינה הממוצעת של קריאות רקע בשטח הכולל של ה-ROI והפחתת מספר זה מערך הצפיפות המשולב של ה-ROI. חזור על תהליך עבודה זה עבור כל התמונות עבור שתי קבוצות הטיפול (Control ו-Hyperoxia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים (A.U.)
      Ft = פלואורסצנטיות כוללת
      Fb = פלואורסצנטי רקע
      α = אזור בחירה

תוצאות

כדי לבודד nTAECs, אספנו שאיפות קנה נשימה מיילודים שעברו אינטובציה בפגייה והעברנו את השאיפות על קרח למעבדה להמשך עיבוד (איור 1A). לאחר זריעת דגימות השאיבה של קנה הנשימה במדיום גידול אפיתל של דרכי הנשימה (BLEAM-I המכיל מעכבי Rho/Smad, GSK3 ו-mTOR), הופיעו תאים קובואידיים תוך 7-10 ימים. לאחר 14 יום, התאים היו 50%-60% מתלכדים, וכ-21 יום לאחר הציפוי, התאים היו ארוזים בצפיפות ודרשו טריפסיניזציה למעבר והתרחבות לאחר מכן. מעברים סדרתיים של תאים אלה (עד P3) נשמרו בהקפאה בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. התאים (≤ קטע 3) הופשרו לאחר מכן לתרבית ALI.

nTAECs תורבו ב-ALI ברגע שהם הגיעו לסביבות 80%-90% מפגש בצלחת T75 בתנאים שקועים. ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של חד-שכבת nTAEC ביום 0 של ALI עם הסמנים הספציפיים לתאי הבסיס - ציטוקרטין-5 (KRT5)53 וחלבון הגידול p63 (TP63)54 (איור 1B). ביום 0 של ALI, כמעט כל התאים חיוביים ל-KRT5 ו-TP63, מה שמרמז על פנוטיפ תאי בסיס בדרכי הנשימה עם התמיינות מינימלית. לאחר הקמת ALI, TEER נמדד באמצעות EVOM (איור 1C) וגדל במהירות בשלב המוקדם של תרבית ALI (ALI יום 0 עד 7) כאשר nTAECs החלו ליצור שכבה חד-שכבתית של תאים מקוטבים בוגרים, עם מישור של TEER לאחר מכן בין היום ה-7 ליום ה-28 של ALI (איור 1D). יתר על כן, FITC-dextan של שני משקלים מולקולריים (10 kD ו-20 kD) שימשו להערכת חדירות פרה-תאית במהלך התמיינות ALI והראו ירידה הדרגתית כללית של הקרינה לאורך זמן (איור 1E). זה מתאם עם היווצרות של תא חד-שכבתי בוגר במהלך התמיינות ALI עם ירידה בחדירות למומסים. 

במהלך תרבית ALI, תאי הבסיס מתמיינים לשושלות אפיתל בוגרות, הכוללות תאים ריסניים, תאי מועדון שאינם מפרישים ריר ותאי גביע מפרישי ריר39. ניתוח ביטוי גנים של סמנים ספציפיים לתאי אפיתל בוגרים ביום 0 של ALI הראה ביטוי מינימלי עד ללא ביטוי של חלבון קופסת המזלג J155 (FOXJ1, סמן תאים ריסניים), אוטרוגלובין56 (SCGB1A1, סמן תאי מועדון) ומוצין-5AC57 (MUC5AC, סמן תאי גביע; איור 2A), עם עלייה לאחר מכן (ALI ימים 7 ו-28) מרמזת על התמיינות לתת-סוגים בוגרים אלה של אפיתל דרכי הנשימה במהלך תרבית ALI. בנוסף, ביצענו צביעה אימונו-פלואורסצנטית ביום ה-28 של ALI תוך שימוש בסמנים ספציפיים לתאי אפיתל בוגרים והתמיינות אפיתל כמותית המורכבת מתאי אצטיל-טובולין58 (TUBA4A) חיוביים (~22%), תאי מועדון חיוביים SCGB1A1 (~13%) ותאי גביע חיוביים ל-MUC5AC (~3%) כאשר השאר הם תאי בסיס חיוביים ל-KRT5 (~51%) וסוגי תאים נדירים אחרים (איור 2B).

מעכבי Rho ו-Smad שימשו במהלך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI (ימי ALI 0 עד 7) ולאחר מכן הוסרו מאמצעי ההתמיינות למשך שארית תקופת תרבית ה-ALI (איור 3A). המשטח האפיקלי של התא חד-שכבתי במהלך תרבית ALI נחשף לאוויר, מה שמאפשר מחקרי הפרעות אטמוספריות. חשיפה להיפראוקסיה של התא החד-שכבתי בוצעה עם 60% O2 ברציפות במשך 7 ימים מהיום ה-7 עד ה-14 באמצעות חממת TriGas. קבוצת הביקורת הוחזקה באינקובטור נפרד עם חשיפה לאוויר בחדר (21% O2). בהתחשב בכוונה העתידית לחקור את ההשלכות ארוכות הטווח (1-2 שבועות לאחר השלמת החשיפה ל-O2) של חשיפה ל-O2 על התפתחות והתחדשות האפיתל של דרכי הנשימה, היה חיוני שהחשיפה ל-O2 לא תגרום באופן חריף לציטוטוקסיות חמורה או לנזק לממברנה במידה שהיא משבשת באופן משמעותי את השכבה החד-שכבתית של תאי ALI. כדי להעריך את הנזק לקרום התא, מדדנו שחרור LDH במדיה הבסיסית ביום ה-14 של ALI, שלא הראה הבדל משמעותי בין היפראוקסיה לבין תרביות שטופלו באוויר בחדר (איור 3B). כדי להעריך עוד יותר אם השפעות ציטוטוקסיות מ-O2 היו משמעותיות מספיק כדי לגרום לאפופטוזיס ב-nTAECs, ביצענו אימונובלוטיקה עבור קספאז-3 כולל וקספאז-359 שסוע על ליזטים של תאים שנאספו מהיפראוקסיה וקבוצות שנחשפו לאוויר בחדר ביום ה-14 של ALI (איור 3C). הביטוי הכולל של קספאז-3 היה דומה בין שתי הקבוצות, וביטוי קספאז-3 שסוע לא זוהה, מה שמצביע על כך ש-7 ימים של חשיפה של 60% ל-O2 לא גרמו לאפופטוזיס ב-nTAECs ביום ה-14 של ALI. בנוסף, תוכננה בקרה חיובית עם דגירה לילית של nTAECs בתנאים שקועים עם ריכוזים הולכים וגדלים של סטאורוספורין (0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר ו-2 מיקרומטר), חומר ציטוטוקסי וגורם אפופטוזיס. אימונובלוטינג לביטוי קספאז-3 כולל וקספאז-3 שסוע אישר אינדוקציה מוצלחת של אפופטוזיס. כדי למדוד מתח חמצוני הנגרם על ידי חשיפה של 60% O2, בוצעה בדיקת מתח חמצוני תאי עם מדידת עוצמה פלואורסצנטית על חד-שכבות תאי nTAEC ב-ALI 14 (איור 3D). חשיפה להיפראוקסיה גרמה לעלייה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנט (מחושבת על ידי פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים או CTCF) בהשוואה לתאים שנחשפו לאוויר בחדר, מה שמרמז על מתח חמצוני תאי מוגבר. ניתוח ביטוי גנים של גנים נוגדי חמצון הראה כי 60% O2 גרם לוויסות מוגבר של גנים נוגדי חמצון אלה ביום ה-14 של ALI, כאשר קטלאז, SOD1, SOD2 ו-GPX3 היו מווסתים באופן משמעותי (איור 3E).

figure-results-1
איור 1: תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAECs) מבודדים בהצלחה משאיבות קנה הנשימה של היילודים ומתורבתים בממשק אוויר-נוזל (ALI). (A) nTAECs שבודדו תוך שימוש בשאיבת קנה הנשימה מיילודים שעברו אינטובציה הועברו במצב שקוע עם תרבית ALI לאחר מכן. (B) תאים נקצרו ביום 0 של ALI לצביעה אימונו-פלואורסצנטית עם סמני תאי בסיס בדרכי הנשימה - KRT5 (אדום) ו-TP63 (אדום). הגרעינים צבועים בכחול עם DAPI. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER) בתוספות תרבית תאים באמצעות מד וולט/אוהם אפיתל (EVOM). (D) TEER נמדד במהלך התמיינות ALI. הנתונים מוצגים כממוצע (n=2 תורמים, 5-10 בארות לתורם לנקודת זמן). פסי שגיאה מצביעים על SEM. (E) בדיקת חדירות טרנס-אפיתל של פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן (FITC-dextran) בוצעה במהלך התמיינות ALI תוך שימוש בשני משקלים מולקולריים שונים של FITC-dextan (10 kD ו-20 kD). תמיסת FITC-dextran (10 kD או 20 kD) נוספה לתא האפיקלי, ותוספות תרבית התאים הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. הקרינה בתקשורת התא הבסיסית נמדדה באופן ספקטרופוטומטרי בלוחות של 96 בארות. פלואורסצנטי רקע (מדיה HBTEC) הופחת ממדידות הבדיקה כדי לקבל ערך פלואורסצנטי מתוקן (מבוטא באחוזים בהשוואה לערכי יום 0). הנתונים הוצגו כממוצע (n=2 תורמים, שלוש בארות לתורם לנקודת זמן עבור כל משקל מולקולרי של FITC-dextran). קווי שגיאה מציינים SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAECs) עוברים התמיינות רירית במהלך תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). (A) תאים נאספו בימים 0, 7 ו-28 של ALI לניתוח qPCR של סמנים ספציפיים לתאי אפיתל: ציטוקרטין-5 (KRT5) עבור חלבון בסיסי, קופסת מזלג J1 (FOXJ1) עבור ריסים, רחם (SCGB1A1) עבור מועדון ומוצין-5AC (MUC5AC) עבור תאי גביע. הביטוי היחסי של כל גן נקבע בשיטת δCt עם GAPDH כבקרה אנדוגנית. הנתונים הוצגו כממוצע (מ-n = 3 תורמים, שלוש בארות לתורם לנקודת זמן). פסי שגיאה מצביעים על SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע תוך שימוש ב-ANOVA דו-כיווני עם ניתוח פוסט-הוק של Tukey, *p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001. (B) צביעה אימונו-פלואורסצנטית של תאי בסיס (KRT5, אדום), ריסניים (אצטיל-טובולין או TUBA4A, ירוק), מועדון (SCGB1A1, אדום) וגביע (MUC5AC, ירוק) בוצעו ביום ה-28 של ALI כדי לכמת את התמיינות האפיתל. הגרעינים צבועים בכחול עם DAPI. נתונים עבור אחוז (%) תאים חיוביים המוצגים כממוצע (n=2 תורמים, שתי תוספות תרבית תאים לכל תורם, 6-8 תמונות לא חופפות לכל שקופית, מינימום 3000 תאים שנספרו בכל שקופית). קווי שגיאה מציינים SEM. סרגל קנה המידה = 50 מיקרומטר.  אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: היפראוקסיה גורמת לעקה חמצונית תאית בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAECs) אך אינה גורמת לנזק משמעותי לקרום התא או לאפופטוזיס. (A) ציר זמן ניסיוני לחשיפה להיפראוקסיה של nTAECs באמצעות חממת Trigas. החשיפה לחמצן החלה לאחר שהמעכבים הוסרו מאמצעי ההתמיינות ביום ה-7 של ALI ונמשכה במשך 7 ימים (יום 7 עד 14 של ALI). (B) המדיה הבסיסית נאספה לבדיקת שחרור LDH כדי להעריך את הנזק לקרום התא בין הקבוצה שנחשפה ל-60% O2 (היפראוקסיה) ביום ה-14. הנתונים הוצגו כנקודות נתונים בודדות (ספיגה מתוקנת) עם קווים המציינים את הממוצע הכולל עבור כל קבוצה, n=3 תורמים מסומנים בעיגולים שחורים, ריבועים ומשולשים עם ארבע בארות לכל תורם, בהתאמה. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג, p=0.6184. (C) תאים נקצרו ביום ה-14 של ALI, ובוצע אימונובלוטינג לסמנים של אפופטוזיס (קספאז-3 וקספאז-3 שסוע) כדי להשוות את התגובות בין אוויר החדר ל-nTAECs שנחשפו ל-O2. בקרה חיובית לבדיקה תוכננה על ידי דגירה של nTAECs בן לילה עם סטאורוספורין (Stau 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר ו-2 מיקרומטר) או בקרת רכב (Veh Ctrl) במצב תרבית שקועה. תאים נאספו לאימונובלוט עם נוגדן קספאז-3 כולל ונוגדני קספאז-3 שסועים. דנסיטומטריה בוצעה עם α-טובולין כגן משק בית. הנתונים הוצגו כממוצע (מ-n=2-3 תורמים, באר אחת עד שתיים לכל תורם). קווי שגיאה מציינים SEM. נעשה שימוש במבחן t לא מזווג כדי להשוות את הביטוי הכולל של caspase-3 בין אוויר החדר לקבוצת 60% O2 , p=0.4. נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני כדי להשוות את הביטוי הכולל של caspase-3 ו-caspase-3 שסוע בין קבוצות שנחשפו ל-Veh Ctrl ו-Stau, *p<0.05, ***p<0.0005. (D) בדיקת CM-H2DCFDA לעקה חמצונית תאית בוצעה ביום ה-14 של ALI עם תוספות תרבית תאים שנקטפו מאוויר החדר ו-nTAECs שנחשפו ל-O2. מוצגות תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מייצגות של תוספות תרבית תאים חשופות לאוויר החדר (בקרה) ו-60% O2 (היפראוקסיה). פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים (CTCF) חושבה כדי להשוות מתח חמצוני תאי בין אוויר בחדר ל-60% nTAECs שנחשפו ל-O2. נתוני CTCF מוצגים כנקודות נתונים בודדות עם קו המציין את הממוצע הכולל עבור כל קבוצה, 6-7 תמונות לקבוצה מ-2 תורמים בודדים (עיגולים שחורים וריבועים) עם שתי בארות לכל תורם. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג, *p<0.05. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (E) תאים נאספו ביום ה-14 של ALI מאוויר החדר, ובוצעו בארות חשופות להיפראוקסיה לניתוח qPCR של גנים של עקה חמצונית, כולל קטלאז, סופראוקסיד דיסמוטאז 1 ו-2 (SOD1 ו-SOD2), גלוטתיון פרוקסידאז 1, 2 ו-3 (GPX1, GPX2 ו-GPX3). נתוני שינוי הקיפול של כל גן נקבעו בשיטת δCt עם 18s rRNA כבקרה אנדוגנית. הנתונים הוצגו כממוצע (מ-n=3 תורמים, שתי בארות לכל תורם). קווי שגיאה מצביעים על SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג, *p<0.05, **p=0.006.  אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

רכיב מדיהכמותריכוז סופי
בלאם-איי
מדיה של BLEAM500 מ"ל
תוספת HLL1.25 מ"ל500 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין בסרום אנושי
0.6 מיקרומטר חומצה לינולאית; 0.6 מיקרוגרם/מ"ל לציטין
ל-גלוטמין15 מ"ל6 מ"מ
תמצית P2 מ"ל0.4% תמצית יותרת המוח בקר
TM15 מ"ל1 מיקרומטר אפינפרין; 5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין
10 ננומטר טריודוטירונין; 0.1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון
5ng/mL גורם גדילה אפידרמיס (EGF)
5 ננוגרם/מ"ל אינסולין
נורמוצין1 מ"ל0.1 מ"ג/מ"ל
י-27632עשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה5 מיקרומטר
A83-01עשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה1 מיקרומטר
צ'יר 99021עשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה0.4 מיקרומטר
רפמיציןעשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה5 ננומטר
HBTEC
מדיה HBTEC500 מ"ל
נורמוצין1 מ"ל0.1 מ"ג/מ"ל
HBTEC-I
מדיה HBTEC500 מ"ל
נורמוצין1 מ"ל0.1 מ"ג/מ"ל
י-27632עשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה5 מיקרומטר
A83-01עשוי להשתנות בהתאם למספר האצווה0.5 מיקרומטר

טבלה 1: רכיבי מדיה עבור מדיום דרכי הנשימה של הסימפונות עם מעכבים (BLEAM-I), מדיה ALI של תאי אפיתל סימפונות/קנה הנשימה האנושיים עם מעכבים (HBTEC-I) ו-HBTEC.

בקבוק תרבית תאים/מוסיף תרבית תאים804G מדיה ממוזגת תאים (mL)
בקבוק T253 מ"ל
בקבוק T755 מ"ל
תוספת תרבית תאים 24 בארות (0.4 מיקרומטר גודל נקבוביות, 0.33 ס"מ2 שטח פנים)400 מיקרוליטר

טבלה 2: נפחים של מדיה מותנית מטריצה שמקורה בתאים 804G הנדרשים עבור צלוחיות תרבית ותוספות תרבית תאים.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה לאיסוף ועיבוד של דגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים מיילודים אינטובציה בפגייה עם בידוד והרחבה של nTAECs חיים מדגימות אלה תוך שימוש בשיטות שנקבעו בעבר39. יתר על כן, תיארנו שיטה לתרבית nTAECs ב-ALI ואפיון ההתמיינות שלהם לאפיתל מקוטב של דרכי הנשימה הריריות כפונקציה של זמן באמצעות מדידת TEER, בדיקת FITC-dextran, צביעה אימונו-פלואורסצנטית וניתוח qPCR של סמנים ספציפיים לסוג התא (כלומר, בסיסי, ריסני, מועדון וגביע). ההיבט החדש של פרוטוקול זה הוא הפרעת חמצון חיזור אטמוספרי המתבצעת באמצעות חשיפה מתונה להיפראוקסיה (60% O2) בהתפתחות חד-שכבות nTAEC. הראינו כי חשיפה של 60% ל-O2 למשך 7 ימים גורמת לעקה חמצונית תאית ב-nTAECs. אנו מראים עוד כי אסטרטגיית החשיפה ל-O2 אינה גורמת באופן חריף לאפופטוזיס תאי משמעותי או לנזק לקרום התא, מה שמאפשר שמירה על nTAECs אלה בתרבית ALI מעבר לזמן השלמת החשיפה ל-O2 . לפיכך, ניתן להשתמש במודל כדי לחקור את ההשפעות הקצרות והארוכות טווח של חשיפה ל-O2 על תכנות אפיתל דרכי הנשימה של היילודים.

תרבית nTAECs ב-ALI מעניקה יתרונות מסוימים על פני תרבית שקועה קונבנציונלית מכיוון שהיא מקדמת היווצרות חד-שכבת אפיתל מקוטבת של דרכי הנשימה עם היווצרות צומת הדוקה והתמיינות רירית60,61. מחקרים קודמים עם nTAECs הראו כי בשלב המוקדם של תרבית ALI (ALI יום 0 עד 7), התאים עוברים פסאודו-ריבוד (מופיעים כרב שכבתי בניגוד לשכבת תא בודדת) ולבסוף יוצרים אפיתל פסאודוסטטי בוגר עד סוף השבוע השני42,62. היווצרות צומת הדוקה עוקבת אחר מסלול דומה בשלב המוקדם של תרבית ALI מלווה בעלייה מהירה ב-TEER עם מישור מאוחר יותרשל 63, שהודגם במודל עם nTAECs. יתר על כן, תאי אפיתל של דרכי הנשימה שגודלו ב-ALI משפרים את הביטוי והלוקליזציה האפיקו-לטרלית של קלאודין-1 (מרכיב של קומפלקס צומת הדוק), מה שמגביר את תכונות האיטום של צמתים הדוקים במהלך תרבית ALI, ומקדם את היווצרות חד-שכבת תא בוגר63. זה מתאם עם ירידה בחדירות הפרה-תאית, שנבדקה במודל עם בדיקת FITC-dextran והדגימה מגמת ירידה כללית בחדירות חד-שכבתית. תיארנו את דפוס ההתמיינות הרירית ב-nTAECs עם צביעה חיסונית עבור סמנים ספציפיים לתאים ריסניים (TUBA4A), מועדון (SCGB1A1) וגביע (MUC5AC) ביום 28 של ALI. בנוסף, ביצענו ביטוי גנים של סמנים ספציפיים לתאים ריסניים (FOXJ1), מועדון (SCGB1A1) וגביע (MUC5AC) במהלך מהלך הזמן ALI. קבוצות אחרות הראו כי גורם השעתוק FOXJ1 חיוני לריסים תנועתיים, בעוד ש-TUBA4A קיים הן בריסים ראשוניים והן בתנועה64,65. במודל זה, דפוס ביטוי הגנים עבור FOXJ1 במהלך התמיינות ALI של nTAECs נמצא בקורלציה גסה עם זמן הופעת ריסים תנועתיים בתרבית אפיתל של דרכי הנשימה ממחקרים קודמים64,66.

מחקר שנערך לאחרונה על ידי Teape et al. העריך את ההשפעות הפרוטאומיות והמטבולומיות של חשיפה להיפראוקסיה על תרבית ALI67. עם זאת, תאים הופקו מתורמים בוגרים. מחקרים קודמים על וירוס סינציאלי נשימתי (RSV)62,68,69,70 ומגפת COVID-19 האחרונה 71 הדגישו את החשיבות של הבדלים הקשורים לגיל בתגובת האפיתל ובתפקוד של דרכי הנשימה. Zhao et al. השתמשו בתהליכי עבודה דומים כדי לבודד תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים ובוגרים והראו כי לאחר 21 יום של התמיינות ALI, לא היו הבדלים משמעותיים בהרכב התאים בין תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים ובוגרים62. עם זאת, היו הבדלים ברורים בתגובתם לזיהום RSV, כאשר תאים יילודים הראו יותר תאים נגועים ב-RSV ונזק לאפיתל בהשוואה למבוגרים. באופן כללי, תנאי התרבית שבהם השתמשו Zhao et al. יצרו התמיינות חזקה יותר ב-nTAECs בהשוואה לשלנו, עם מספר גבוה יותר של תאים ריסניים (41% לעומת 22%) וגביע (10% לעומת 3%). ניתן לייחס את ההבדלים הללו לשימוש באמצעי גידול שונים. מדיום PneumaCult-ALI המשמש את קבוצתם (בניגוד למדיום HBTEC-ALI) הוכח כגורם להתמיינות חזקה יותר עם מספר גבוה יותר של תאים ריסניים וגביעים72. במודל זה, ביטוי גנים של סמנים ספציפיים לסוג התא עבור תאים ריסניים, מועדונים וגביעים הראה עלייה מהירה ראשונית (ALI יום 0 עד 7) עם ירידה מאוחרת יותר בסביבות יום 28 של ALI. סיבה אפשרית יכולה להיות מישור ההתמיינות לאחר יום 14 של ALI, שהודגם במחקרים קודמים עם nTAECs42.

תיארנו את השימוש בחשיפה מתונה להיפראוקסיה (60% O2) במשך 7 ימים, שלדעתנו מדמה יותר את חוויות החיים האמיתיות של פגים בפגייה בהשוואה לשימוש ברמות גבוהות מאוד של O2 (> 80% O2)67 כאשר הסיכון לרעילות חריפה של O2 מוגבר1, 5. ואכן, הוכח כי חשיפה של 95% O2 של רקמת ריאה של יילוד גורמת לאפופטוזיס תאי באמצעות הפעלת קספאז73. עם זאת, אסטרטגיית חשיפה זו רלוונטית רק באחוז קטן מהתינוקות בפגייה אשר, כתוצאה מפגיעה ריאתית חריפה הנגרמת על ידי O2, מפתחים הפרעת אישיות גבולית חמורה עם פתולוגיות סימפונות כרוניות (מודל פגיעה ריאתית חריפה)37. בעידן המודרני של שימוש מושכל בטיפול O2 , רוב הפגים אינם נחשפים ל-O2 כה גבוה; עם זאת, הם עדיין נמצאים בסיכון לפתח מחלות דרכי נשימה עתידיות (מודל הפרעה התפתחותית). בקבוצה אחרונה זו, הפגיעה מהפרעת חמצון חיזור בתחילת החיים עשויה להיות שקטה בהתחלה אך להתבטא מאוחר יותר בגיל הפעוטות או מעבר לכך בצורה של מחלת דרכי נשימה כרונית37. הנתונים שלנו המשתמשים בבדיקת מתח חמצוני תאי הראו כי חשיפה מתונה להיפראוקסיה (60% O2) הגדילה משמעותית את הלחץ החמצוני בתוך חד-שכבת התא nTAEC. ניתוח שחרור LDH והפעלת קספאז-3 תאי הצביע על כך שאסטרטגיית החשיפה להיפראוקסיה שלנו לא גרמה למוות תאי משמעותי. ניתן להשתמש בשיטות ובמערכת המודל שאנו מתארים כדי לחשוף מנגנונים מולקולריים רגישים ל-O2 בשלב מוקדם בחיים כקישור להתפתחות מאוחרת יותר של מחלת ריאות אצל פגים לשעבר.

במהלך חיי העובר, תאי אפיתל של דרכי הנשימה שקועים בנוזל הריאה וקיימים בסביבה התוך-רחמית ההיפוקסית יחסית26. תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים עוברים תחלופה והתמיינות מהירה ויוצרים מחסום קריטי בין הריאה לעולם החיצון. כאשר יילודים עוברים לחיים לאחר הלידה, תאי אפיתל של דרכי הנשימה נחשפים לסביבה היפראוקסית יחסית לאחר הלידה. מעבר זה נעשה פתאומי יותר ביילודים פגים וחולים קליניים מכיוון שהם זקוקים באופן שגרתי לטיפול O2 כחלק מהטיפול בהם40,74, מה שמציב אותם בסיכון גבוה לפגיעה חמצונית לאחר הלידה1. בעוד שההשפעות של היפראוקסיה על אלבאולריזציה של הריאות לאחר הלידה אופיינו היטב באמצעות מודלים של בעלי חיים75, ההשפעות של חשיפה להיפראוקסיה על תאי אפיתל של דרכי הנשימה מתפתחות אינן נחקרות יחסית38. השימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה שמקורם בילודים אנושיים עם חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית במהלך ALI מוסיף רלוונטיות תרגומית למודל שלנו. בנוסף, השימוש בחשיפה להיפראוקסיה בשלב המוקדם-בינוני של התמיינות פעילה והיווצרות תאים חד-שכבתיים במקום אפיתל67 בוגר של דרכי הנשימה המובחנות לחלוטין מדמה פוטנציאלית את התרחיש הקליני ביילודים פגים מאוד (< שבוע 28 להריון) שנולדים בשלבים המוקדמים יותר (תעלתיים עד עצמיים) של התפתחות הריאות ולא בשלבהמכתשית 7.

למודל שלנו יש מגבלות שיש לקחת בחשבון כאשר מיישמים אותו על התפתחות אנושית ומחלות. השתמשנו בתכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של היילודים שפורסמו בעבר במודל ALI של nTAECs39. השימוש במעכבי גורמי גדילה (Rho/Smad/GSK3/mTOR) מאפשר מעבר מהיר ומאוחר יותר של תאים אלה. ניסינו לתרבת nTAECs הן בתנאי שקוע והן בתנאי ALI ללא מעכבים במדיום הגידול; עם זאת, התרחבות ומעבר של תאים אלה היו איטיים משמעותית, ושכבת התא החד-שכבתית ב-ALI הפכה לדליפה בסוף השבוע השני (הנתונים לא מוצגים). קבוצה אחרת המשתמשת באותם מעכבים לתרבית תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימהבילודים 42 ביצעה ריצוף RNA של תא בודד כדי להראות שנוכחותם של מעכבים אלה לא גרמה לביטוי דיפרנציאלי משמעותי של גנים המעורבים בעקה חמצונית, מעבר אפיתל-מזנכימלי או הזדקנות תאית. עם זאת, שקלנו מגבלה זו במודל שלנו והחלטנו לבצע חשיפה להיפראוקסיה לאחר שמעכבי Rho ו-Smad הוסרו מאמצעי ההתמיינות. במחקר זה, בדקנו רק השפעות היפראוקסיה מתונות (60% O2) על nTAECs. עם זאת, מחקרים עתידיים מתכוונים להשתמש בחשיפה מדורגת להיפראוקסיה (40%, 60% ו-95% O2) ולהשוות את התגובות ב-nTAECs. בעוד שלמודל המתואר כאן יש משיכה תרגומית בהתחשב בשימוש בתאים מיילודים אנושיים שהתקבלו ב-NICU, זהו מודל תרבית תאים במבחנה , ולפיכך, ממצאים משמעותיים המשתמשים במודל זה יצדיקו אישור עם מודל משלים של בעלי חיים in vivo .

לסיכום, תיארנו את השיטה שלב אחר שלב להקמת מודל תרבית ALI תלת מימדית במבחנה תוך שימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים המבודדים משאיבות קנה הנשימה של יילודים אינטובציה בפגיות. השתמשנו במודל זה כדי לבחון את ההשפעות של חשיפה מתונה להיפראוקסיה, עלבון סביבתי נפוץ ביילודים פגים בפגיה. חשיפה להיפראוקסיה גרמה לעקה חמצונית תאית בחד-שכבת התא מבלי לגרום לנזק משמעותי לקרום התא או למוות של תאים, מה שאפשר להמשיך בתרבית ALI לחקור את ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה ל-O2 על התפתחות ותפקוד האפיתל של דרכי הנשימה בילודים. יישומים עתידיים המשתמשים בשיטות אלה עשויים לחשוף מנגנוני מחלה מוקדמים המעורבים בהתפתחות ארוכת טווח הנגרמת על ידי היפראוקסיה של מחלות ריאה הנראות לעתים קרובות אצל פגים לשעבר.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי אינטרסים לדווח עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מימון מקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF) ומשאבים קליניים ותרגומיים משותפים של אוקלהומה (U54GM104938 עם פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מ-NIGMS) ל-AG. אנו רוצים להודות לד"ר פול לרו ולד"ר שינגבין איי מבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, על שסיפקו תאים מתורמי יילודים ששימשו בחלק מהניסויים. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמליןפישר סיינטיפיק23-426796
1X PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט), pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5 מ"מקורנינג3470
נוגדן טובולין אנטי אצטיל, עכבר חד שבטיSigmaT7451
נוגדן אנטי אלפא טובוליןAbcamab7291
אנטי ציטוקרטין 5 נוגדןAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
נוגדן קספאז-3 שסועאיתות תאים9664T
SCGB1A1 או חלבון תא מועדון (CC16) נוגדן רב-שבטי אנושי, ארנבBioVendor מו"פ DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (מחוון מתח חמצוני כללי)Thermo ScientificC6827
תרבית תאי קורנינג מטופלת צלוחיות T25קורנינג430639
קורנינג תרבית תאים בצורת U T75 צלוחיותקורנינג430641U
CyQUANT LDH בדיקת ציטוטוקסיותThermo ScientificC20300
DAPI תמיסה (1 מ"ג/מ"ל)פישר סיינטיפיקEN62248
דימתיל סולפוקסיד [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
מים מזוקקיםGibco15230162
EVOM מדריך למדידת TEERמכשיר דיוק עולמיEVM-MT-03-01
FBS (סרום בקר עוברי)Gibco10082147
פלואורסצאין איזותיוציאנט דקסטרן (משקל ממוצע של 10,000 מול)פישר סיינטיפיקF0918100MG
פלואורסצאין איזותיוציאנט וכו'; דקסטרן (ממוצע מול WT 20,00)SigmaFD20-100MG
עיזים נגד עכבר IgG (H+L), מודעות אנושיות-HRPSouthern Biotech1031-05
עז נגד עכבר IgG2b נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
עיזים נגד ארנב IgG (H+L), מודעות עכבר/אדם-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC ממשק אוויר-נוזל (ALI) בידולתא אורך חייםLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 אינקובטור, 165 ליטרתרמו מדעי
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההתרמו סיינטיפיק4368814
HLLטכנולוגיית תאים LifeLineLS-1001
ImageJNIHN / A
Invivogen Normocin - מגיב אנטי מיקרוביאליפישר סיינטיפיקNC9273499
L-גלוטמיןטכנולוגיית תאי LifeLine LS-1013
סרום עיזים רגילGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-25268
ProLong זהב Antifade MountantInvitrogenp36930
PureLink RNA מיני קיטתרמו מדעי12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression מבחנים: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression מבחנים: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: GAPDHמבחני Thermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression מבחנים: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression מבחנים: KRT5Thermo Scientific
Taqman Gene Exression Tests: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Tests: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
יחידות מסנן חד פעמיות סטריליות סטריליות של Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow עם קרום PES (0.22 μ נקבוביות, 500 מ"ל)Thermo Scientific5660020
TM-1 תוסף משולבLifeLine Cell TechnologyLS-1055
סה"כ קספאז-3 נוגדניםאיתות תאים14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
טכנולוגיית בינוני 51030411 תוסף imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1

מקורות

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.