זיהוי וכימות של מונו-רמנוליפידים ודי-רמנוליפידים המיוצרים על ידי Pseudomonas aeruginosa

סיכום

Pseudomonas aeruginosa מייצר את biosurfactants rhamnolipid. כרומטוגרפיה בשכבה דקה מזהה וקובעת את שיעור המונו-רמנוליפידים והדי-רמנוליפידים המיוצרים על ידי כל זן. כימות של סך כל הרמנוליפידים כרוך בהערכת מקבילות של רמנוז הקיימות בביו-פעילי שטח אלה המופקים מתרבית העל-נאטנטים בשיטת אורצינול.

תקציר

החיידק הסביבתי Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן אופורטוניסטי בעל עמידות גבוהה לאנטיביוטיקה המהווה סכנה בריאותית. חיידק זה מייצר רמות גבוהות של ביו-פעילי שטח המכונים רמנוליפידים (RL), שהן מולקולות בעלות ערך ביוטכנולוגי משמעותי אך קשורות גם לתכונות אלימות. מבחינה זו, זיהוי וכימות של RL עשוי להיות שימושי הן עבור יישומים ביוטכנולוגיים והן עבור פרויקטים של מחקר ביו-רפואי. במאמר זה, אנו מדגימים שלב אחר שלב את הטכניקה לזיהוי הייצור של שתי צורות RL המיוצרות על ידי P. aeruginosa באמצעות כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC): מונו-רמנוליפידים (mRL), מולקולות המורכבות על ידי דימר של חומצות שומן (בעיקר C10-C10) הקשורות למויטי רמנוז אחד, ודי-רמנוליפידים (dRL), מולקולות המורכבות על ידי דימר חומצת שומן דומה המקושר לשני מואייטים של רמנוז. בנוסף, אנו מציגים שיטה למדידת הכמות הכוללת של RL בהתבסס על הידרוליזה חומצית של ביו-פעילי שטח אלה המופקים מסופרנאטנט תרבית P. aeruginosa והזיהוי הבא של ריכוז הרמנוז המגיב עם אורצינול. ניתן להשתמש בשילוב של שתי הטכניקות כדי להעריך את הריכוז המשוער של mRL ו-dRL המיוצר על ידי זן מסוים, כפי שמודגם כאן עם הזנים PAO1 (פילוגרופ 1), PA14 (פילוגרופ 2) ו-PA7 (פילוגרופ 3).

מבוא

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק סביבתי ופתוגן אופורטוניסטי בעל דאגה רבה בשל ייצורו של תכונות הקשורות לאלימות ועמידותו הגבוהה לאנטיביוטיקה ^1,2. מטבוליט משני אופייני המיוצר על ידי חיידק זה הוא RL biosurfactant, אשר מיוצר באופן מתואם עם מספר תכונות הקשורות לאלימות כגון פנזין pyocyanin, אנטיביוטיקה עם פעילות חמצון-חיזור, ואת פרוטאז elastase³. תכונות הטנסיו-אקטיביות והתחליב של RL נוצלו ביישומים תעשייתיים שונים וכיום הן ממוסחרות⁴.

רוב זני P. aeruginosa, השייכים לקבוצות פילוגרופ 1 ו-2, מייצרים שני סוגים של RL: mRL, המורכב ממויטי רמנוז אחד המקושר לדימר חומצת שומן המורכב בעיקר מ-10 פחמנים, ו-dRL, המכיל רמנוז מואטי נוסף הקשור לרמנוז⁴ הראשון (ראו איור 1). עם זאת, דווח כי שתי קבוצות פילוגרופ מינוריות של P. aeruginosa (קבוצות 3 ו -5) מייצרות רק mRL ^5,6. שני סוגי RL מכילים תערובת של דימרים של חומצות שומן, שכאמור הם בעיקר C10-C10, אך מיוצרים גם פרופורציות קטנות יותר של מולקולות המכילות דימרים C12-C10, C12-C12 ו-C10-C12:1. אפיון קונגנרי RL המיוצרים על ידי זנים שונים באמצעות HPLC MS/MS דווח ^7,8. השיטות המתוארות בעבודה זו יכולות רק להבדיל בין mRL ו- dRL אך אינן יכולות לשמש לאפיון של קונגנרים RL.

P. aeruginosa וכמה מיני Burkholderia הם יצרנים טבעיים של RL⁹, אבל החיידק לשעבר הוא היצרן היעיל ביותר. עם זאת, RL בשימוש מסחרי מיוצר כיום בנגזרות Pseudomonas putida KT2440 המבטאות גנים P. aeruginosa כדי למנוע את השימוש בפתוגן אופורטוניסטי^{זה 10,11}. לגילוי וכימות של RL המיוצר על ידי P. aeruginosa חשיבות רבה לחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בביטוי תכונות הקשורות לאלימות¹², באפיון זנים השייכים לקלאדים 3 או 5¹³, ובבניית נגזרות P. aeruginosa המייצרות יתר על המידה ביו-פעילי שטח אלה תוך הפחתת האלימות¹⁴. הייצור של biosurfactants על ידי מיקרואורגניזמים שונים זוהה מבוסס על כמה מאפיינים כלליים של תרכובות אלה, כגון שיטת נפילת קריסה או מדד תחליב¹⁵, אבל שיטות אלה אינן מדויקות או ספציפיות¹⁶.

במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי mRL ו-dRL באמצעות מיצוי נוזלי של סך כל ה-RL מתרבית העל-נאטנטים של זנים שונים מסוג P. aeruginosa, וההפרדה של שני סוגי RL באמצעות TLC. בשיטה זו, ה-RL המופק מהתרבית מופרד על ידי המסיסות הדיפרנציאלית שלהם בממסים המשמשים ל-TLC, מה שגורם לנדידה דיפרנציאלית על צלחת ג'ל הסיליקה. לכן, mRL יש הגירה מהירה יותר מאשר dRL, והם יכולים להיות מזוהים כתמים נפרדים כאשר לוחות מיובשים ומוכתמים עם α-naphthol.

השיטה המתוארת כאן לאיתור mRL ו- dRL על ידי TLC מבוססת על מאמר¹⁷ שפורסם בעבר, שהוא קל לביצוע ואינו דורש ציוד יקר. שיטה זו הייתה שימושית לאיתור RL במבודדי P. aeruginosa ^{שונים 13} באמצעות בקרות מתאימות, כגון מוטציה שמקורה ב-P. aeruginosa שאינה מסוגלת לייצר RL. עם זאת, זו אינה השיטה המועדפת לאפיון ביו-פעילי שטח חדשים המיוצרים על ידי חיידקים שאינם Pseudomonas aeruginosa בשל חוסר הספציפיות שלה.

בנוסף, מוצגת שיטה לכימות המקבילות של RL הכולל המופק מסופרנאטנט תרבית P. aeruginosa . שיטה זו מכמתת ביו-פעילי שטח אלה בהתבסס על התגובה של אורצינול עם סוכרים רדוקטיביים, וכתוצאה מכך נוצר מוצר שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית ב-421 ננומטר, כפי שתואר קודם לכן¹⁸. מכיוון שהתגובה עם אורצינול אינה ספציפית לרמנוז, חשוב לבצע שיטה זו עם RL המופק מתרבית העל שאינה מכילה כמויות משמעותיות של מולקולות אחרות המכילות סוכר, כגון ליפופוליסכרידים (LPS). תערובת כלורופורם/מתנול חומצית משמשת כאן למיצוי נוזלי של RL¹⁸, אך ניתן להשתמש גם באתיל אצטט, ומיצוי בשלב מוצק (SPE) מניב תוצאות טובות מאוד¹⁹. שיטת האורצינול המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מתוחכם ויכולה לספק תוצאות אמינות אם מבוצעת בזהירות מיוחדת בהכנת הדגימות המנותחות, כפי שנדון. כדי להבטיח הכנת דגימה נאותה, חשוב לכלול מוטנט Pseudomonas aeruginosa rhlA שאינו מסוגל לייצר RL²⁰ ולבצע שלושה שכפולים ביולוגיים ושלושה טכניים לכל קביעה.

הייתה מחלוקת משמעותית בספרות^16,21 לגבי קביעת RL בשיטת אורצינול, כאשר כמה מחקרים מציעים כי ייצור RL מוערך יתר על המידה וכי הבדיקה חסרה ספציפיות עבור rhamnose, פוטנציאל גילוי סוכרים אחרים. עם זאת, אנו מראים כאן כי השיטות המתוארות יכולות להיות מדויקות וספציפיות בתנאים המתאימים. יתר על כן, לצורך השוואה עם ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו משתמשים בזיהוי UPLC-MS/MS של תקן dRL ומדגימים כי תוצאות דומות מתקבלות בשיטת אורצינול. הפרוטוקול המפורט לכימות RL בשיטה זו כלול בקובץ משלים 1.

פרוטוקולים אלה מודגמים באמצעות זני הסוג PAO1 (פילוגרופ 1), PA14 (פילוגרופ 2) ו-PA7 (פילוגרופ 3). זנים אלה נבחרו מכיוון שהם מאופיינים היטב ומייצרים פרופילי RL שונים.

פרוטוקול

הליך זה מסוכם באיור משלים 1. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. זיהוי mRL ו-dRL בתרבית סופרנאטנטים של P. aeruginosa באמצעות TLC

1. התחל עם מרק צנטריפוגה של זן P. aeruginosa של עניין, מעובד בתווך נוזלי במשך 24 שעות (כדי להגיע לשלב נייח של צמיחה שבו RL מיוצר). בדרך כלל, תרביות אלה מכילות 1 x 10⁹ חיידקים לכל מ"ל.
2. התאימו את רמת החומציות של התרבית ל-2 באמצעות HCl מרוכז.
3. שים 5 מ"ל של supernatant תרבית acidified בצינור פוליפרופילן 50 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של תערובת כלורופורם: מתנול 2: 1.
4. יש לסעיר את הצינור על ידי היפוך שלוש פעמים, בכל פעם למשך 10 שניות, ולהשאיר את הצינור ללא היפוך למשך 2 דקות בין כל תסיסה.
5. השאירו את הצינור ללא תסיסה למשך כ-3 שעות עד להפרדת שני השלבים, או צנטריפוגו את הצינור למשך 10 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם ב-4°C.
6. מעבירים את הפאזה האורגנית (שכבה תחתונה) לצינור נקי ומשאירים את הצינורית במכסה אדים עד להיווצרות יובש.
7. חזור על התהליך החל משלב 1.3, לשים את השלב האורגני מן הכלורופורם השני: מיצוי מתנול, לתוך הצינור ששימש מיצוי הראשון.
8. התאדו בשלב האורגני עד שנותרו 1 מ"ל או 1.5 מ"ל. מעבירים נפח זה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומאדים את הממס ליובש למשך הלילה.
9. הוסף 50 μL של מתנול לצינור המיובש כדי להשהות מחדש את RL.
10. בצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה על לוחות ג'ל סיליקה.
    הערה: יש לחתוך את גודל צלחת TLC בהתאם למספר הדגימות שינותחו. כל מדגם צריך להיות מיושם ב 1.5 ס"מ, ואת נקודת היישום צריך להיות 1 ס"מ מקצה הלוח (לצייר קו אופקי עם עיפרון).
11. יש למרוח 5 μL מכל דגימה באמצעות מיקרופיפטה של 10 μL.
12. השלב הנוזלי TLC מורכב מתערובת 65:15:2 של כלורופורם: מתנול: חומצה אצטית. כדי להכין 35 מ"ל של תערובת זו, לערבב 26 מ"ל של כלורופורם, 6 מ"ל של מתנול, ו 0.8 מ"ל של תמיסת מלאי 20% של חומצה אצטית. ערבבו את הממסים הללו והניחו אותם בתא TLC סגור למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת הכרומטוגרפיה, כך שהאטמוספירה רוויה בממיסים הנדיפים.
13. הניחו את צלחת TLC לתוך התא, תוך הימנעות ממגע עם הנקודה שבה הדגימות יושמו.
14. סגור את התא והשאר את TLC עד שהממס מגיע 1 ס"מ לפני קצה הצלחת. בשלב זה, להסיר את הצלחת ולתת לו להתייבש (זרימת אוויר ניתן להחיל כדי להאיץ את התהליך).
15. הכן פתרון של α-naphthol על ידי המסת 5 גרם של תרכובת זו ב 33 מ"ל של אתנול. לאחר המסה, להוסיף 127.5 מ"ל של אתנול, 12.6 מ"ל של מים, ו 20.5 מ"ל של קר H₂SO₄.
16. כדי לזהות נוכחות של mRL ו- dRL, רססו את תמיסת α-naphthol על הצלחת במכסה המנוע והניחו את הצלחת המרוססת בתנור בטמפרטורה של 85°C למשך מספר דקות עד שהסימן הוורדרד של RL ניכר.
17. השתמש בתמונה של TLC כדי לחשב את היחס בין מונו ו- di-RL הקיימים בכל דגימה באמצעות תוכנה המזהה את הצפיפות של כל נקודה.

2. כימות הכמות הכוללת של RL המודדת את המקבילות לרמנוז הקיימות בביו-פעילי שטח

1. מניחים 1.2 מ"ל של תרבית פאזה נייחת (גדלה במשך 24 שעות) בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב 3,000 x גרם ב 4 ° C. אוספים את הסופרנאטנט בצינור נקי.
2. מעבירים 333 μL לצינור נקי (בצעו שלב זה בשלשה) והוסיפו 1 מ"ל אתר.
3. מערבבים במרץ במערבולת במשך 30 שניות. חזור על הליך זה עם צינור אחד בכל פעם.
4. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-3,000 x גרם ב-4°C. אספו את הפאזה האורגנית (השלב העליון), העבירו אותה לצינורית נקייה והשאירו אותה פתוחה במכסה המנוע עד להיווצרות יובש.
5. חזור על החילוץ באמצעות אתר כמתואר בשלב 2.2. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4.
6. לאחר ייבוש מוחלט, להוסיף 1 מ"ל מים לכל צינור. השאירו את הצינורות למשך 12 שעות כדי לאפשר ל-RL להתייבש, ואז להתסיס במרץ במערבולת.
7. מניחים בקבוק נקי בקרח למשך 5 דקות (מכיוון שמדובר בתגובה אקסותרמית). הכינו תמיסה של 60% H₂SO₄ (להגן על הבקבוק מפני אור).
8. בצינור נקי, להכין תמיסת אורצינול 1.6% במים מזוקקים. כדי להכין את מגיב orcinol, לערבב 4.4 מ"ל של 60% H₂SO₄ פתרון עם 0.6 מ"ל של 1.6% תמיסת orcinol.
9. חשב את הנפח הסופי של מגיב orcinol הדרוש. הוסף 900 μL של מגיב זה לכל דגימה ולכל ריכוז של עקומת הכיול, באמצעות ריכוזי rhamnose שונים (בדרך כלל, 9 ריכוזים של rhamnose משמשים בטווח של 1 מיקרוגרם / מ"ל עד 9 מיקרוגרם / מ"ל), ואחד עם 100 μL של מים, להבטיח כי כולם מבוצעים משולש.
10. הוסף 100 μL של כל דגימת RL ל 900 μL של מגיב orcinol בצינור זכוכית ומערבבים את שתי התמיסות.
11. יש לדגור במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש ל-80 מעלות צלזיוס.
12. תנו לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר.
13. קרא את ספיגת הדגימות ועקומת הכיול ב- 421 ננומטר באמצעות תא קוורץ.
14. חשב את ריכוז הרמנוז בכל דגימה על ידי אינטרפולציה של הספיגה על עקומת הכיול והתחשבות בנפח המשמש לקביעה.
15. כדי לחשב את ריכוז μM, חלק את הריכוז המתקבל ב μg / mL ב 182.2 (המשקל המולקולרי של rhamnose) ולהכפיל ב 1000.

תוצאות

במאמר זה, שלושה זנים שונים מסוג P. aeruginosa שימשו כדי לייצג שלוש פילוקבוצות, כל אחת עם רמות ייצור RL שונות ופרופורציות שונות של mRL ו- dRL. זנים אלה כוללים PAO1 (מבודד פצע מאוסטרליה, 1955²²), PA14 (צמח מבודד מארה"ב, 1977²³), ו- PA7 (מבודד קליני מארגנטינה, 2010²⁴). כבקרה שלילית, נעשה שימוש במוטציה PAO1 rhlA, שאינה מסוגלת לייצר RL. כל הזנים טופחו במשך 24 שעות בתווך PPGAS, שתוכנן במיוחד כדי לקדם רמות RL גבוהות²⁵, ב 37 ...

דיון

השיטה המדויקת ביותר לגילוי וכימות RL היא HPLC בשילוב ספקטרומטריית מסות (MS)^7,8,27; עם זאת, זה דורש ציוד מיוחד ויקר כי לא יכול להיות נגיש לחוקרים רבים. השיטות המתוארות כאן יכולות להתבצע באופן שגרתי עם חומרי מעבדה בסיסיים וציוד כדי לזהות ולהעריך ריכוזי RL, אך יש להן כמה מגבלות, במיוחד חוסר הדיוק שלהן בקביעת תערובות mRL ו- dRL. יתר על כן, הכנת המדגם המשמש לכימות RL צריכה להתבצע בקפידה. תרביות המשמשות לזיהוי וכימות RL לא צריכות להיו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
חומצה אצטית	J.T. BAKER	9508-02
צנטריפוגה			לצינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל ו-  50 מ"ל
כלורופורם	JT BAKER	9180-02
			ייבוש
אתר	JT BAKER	9244-02
פיפטה זכוכית	סיגמא-אולדריץ'
חומצה הידרוכלורית	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
מתנול	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
ציר			טריס הידרוכלוריד (0.12 מ'), אשלגן כלורי (0.02 מ'), אמוניום כלוריד (0.02 מ'),   פפטון (1%), pH 7.4    חיטוי. הוסף  גלוקוז (5%) ומגנזיום גופרתי (0.0016M)
תא קוורץ (קובטה)	סיגמה-אולדריץ	' Z276669
מלבני TLC פיתוח מיכל	פישר סיינטיפיק
ראמנוליפידים	סיגמא-אולדריץ'	R-90
ספקטרופוטומטר			VIS
מרסס	סיגמא-אולדריץ'	Z529710-1EA
חומצה גופרתית	J.T. BAKER	9681-02
TES צינורות 5 מ"ל	קורנינג	352002
TLC סיליקה ג'ל 60 F254	MERCK	1.05554.0001
אמבט		מים	> 80 & מעלות; ג

תנור CLS706510 PPGAS, K4161801020